Аннотация результатов, полученных в 2017 году
С помощью биоинформатического анализа и анализа литературы были проанализированы пост-трансляционные модификации (ПТМ) каспазы-2 по сравнению с ПТМ других представителей семейства каспаз и их влияние на активацию и функции данных белков. Проведенный анализ показал, что самым распространенным типом ПТМ является фосфорилирование и убиквитинилирование. Первый тип ПТМ в подавляющем большинстве случаев приводит к следующим последствиям: 1) блокируется расщепление проформ каспаз и, следовательно, их активация; 2) происходит изменение конформации активного центра каспаз и ингибирование активности каспаз. Второй распространённый среди каспаз тип ПТМ – убиквитинилирование – регулирует в первую очередь уровень каспаз в клетке за счет процесса деградации. Несмотря на довольно большое количество описанных ПТМ для инициаторных каспаз-8 и -9, для каспазы-2 было охарактеризовано только 3 сайта фосфорилирования. Для изучения фосфорилирования каспазы-2 и других каспаз был проведен сравнительный анализ консервативных остатков серина, треонина и тирозина в первичной последовательности каспаз позвоночных и беспозвоночных организмов. Анализ множественного выравнивания показал, что экспериментально доказанные сайты фосфорилирования достаточно консервативны во всех каспазах, включая каспазу-2. Более того, был проведен анализ пространственной структуры каспаз с учетом расположения консервативных сайтов фосфорилирования. При этом показано, что некоторые из них, такие как T263 каспазы-8 и S183 каспазы-9 находятся в одном и том же положении в составе пространственной структуры фермента по отношению к активному центру. Также подобную закономерность можно было наблюдать для пространственного расположения высококонсервативных остатков треонина или серина T67, T67, T90 у каспаз-3, -6, и -7, соотвественно. Таким образом, было сделано предположение, что данные сайты могут принимать участие в модификации каспаз и регуляции протеолитической активности ферментов. Установленные в ходе ряда экспериментальных исследований сайты фосфорилирования S347, S150, T173 у каспаз-8, -3, -7, соотвественно, показали эволюционную консервативность среди всех организмов. Анализ сайтов узнавания и расщепления каспазы-2 выявил, что в белке RIP1 имеется мотив, который может быть распознан данной протеазой. Поскольку RIP1 – ключевой компонент некроптотического пути гибели клеток, было проведено исследование процесса некроптоза при воздействии цисплатина в клетках карциномы яичника Caov-4 дикого типа и с пониженным содержанием каспазы-2. Уровень расщепления RIP1 после обработки цисплатином заметно снижался в клетках Caov-4-shRNA-каспаза-2 по сравнению с диким типом, что говорило о потенциальной роли каспазы-2 в регуляции некроптоза. Анализ фосфорилирования RIP1 и белка MLKL – ключевых маркеров некроптотической гибели – продемонстрировал, что в дефицитных по каспазе-2 клетках накопления фосфорилированных форм данных белков происходит на существенно более высоком уровне чем в клетках дикого типа. Таким образом, каспаза-2, по-видимому, играет роль негативного регулятора некроптоза в клетках Caov-4 в ответ на индукцию гибели ДНК-повреждающим агентом цисплатином. С помощью скрининга нами выявлен белок, взаимодействующий с каспазой-2. Им оказался связанный с X-ассоциированным анкирином белок (RFXANK). Полученные данные указывают на новую роль каспазы-2 - контроль регуляции гена гистосовместимости MHC класса II. Анализ клинических образцов пациенток с карциномой яичника показал, что каспаза-2 экспрессируется в нормальной и опухолевой ткани. При этом у 5 из 12 пациенток наблюдался повышенный уровень каспазы-2 в опухолевой ткани. У двух пациенток с повышенным содержаением каспазы-2 в опухолевой ткани было отмечено появление расщепленной формы белка PARP, которое может свидельствовать о запуске апоптоза после химиотерапии. Анализ механизмов усиления цисплатин-индуцированной гибели раковых клеток линий Caov-4 и HeLa в условиях депривации сыворотки (SD – serum deprivation) показал, что ключевую роль в данном процессе играет антиапоптотический белок семейства Bcl-2 - Mcl-1. На предыдущем этапе работы было показано, что при комбинации цисплатина и депривации сыворотки наблюдалось ускорение сборки высокомолекулярного комплекса активации каспазы-9 – апоптосомы. Для детального анализа механизма усиления апоптоза в условиях SD был проанализирован уровень антиапоптотических белков семейства Bcl-2 - Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1, негативно регулирующих пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий. Данный анализ показал, что уровень белков Bcl-2 и Bcl-xL оставался без изменений независимо от способа индукции клеточной гибели. В то же время комбинаторное воздействие цисплатина и депривации сыворотки приводило к существенному снижению уровня белка Mcl-1 по сравнению с воздействием цисплатина в стандартной среде, содержащей сыворотку. Дальнейший анализ с помощью методов оверэкпрессии Mcl-1 или, наоборот, подавления его синтеза с помощью миРНК подтвердил ведущую роль этого белка в усилении цисплатин-индуцированной гибели раковых клеток в условиях депривации сыворотки. В процессе выполнения проекта получены оригинальные данные, раскрывающие молекулярные механизмы взаимодействий различных форм клеточной гибели. Впервые было установлено, что митотическая катастрофа (МК) приводит не только к некрозу или апоптозу, как считалось ранее, но и способна стимулировать аутофагию. Полученные нами данные о том, что свойство МК - предшествовать различным типам гибели - не зависит от типа клеток, а митохондрии могут являться важными модуляторами в выборе конечного типа клеточной гибели, внесут существенный вклад в выработку стратегий, направленных на преодоление резистентности опухолей. Нами показано, что накопление поврежденных митохондрий в клетках с дефицитом аутофагии приводит к активации апоптоза в этих клетках при различных стрессовых условиях, включая голодание. Установлено, что подавление механизма трансляции белков в случае отсутствия питательных веществ зависит от функционирования каспаза-8-зависимого апоптоза в аутофагия-дефицитных клетках рака легких. Нами установлено, что инициация митофагии разобщителем окисления и фосфорилирования вызывает подавление апоптоза, вызванного цисплатином, тогда как ее подавление, напротив, стимулирует клеточную гибель. Полученные данные позволяют использовать митофагию, в качестве фактора, модулирующего гибель клеток чем значительно повысить эффективность противоопухолевой терапии. В ходе выполнения проекта изучена роль белка TSN и ее белков-мишеней BNIP3 и IGFBP2 в регуляции механизмов клеточной гибели. Показано, что подавление экспрессии белка BNIP3 в клетках аденокарциномы легкого приводит к увеличению апоптоза. В то время как подавление экспрессии IGFBP2 при подавлении апоптоза ведет к увеличению клеточной гибели путем некроптоза. На основе полученных данных сделан вывод, что белки-мишени TSN, BNIP3 и IGFBP2, могут участвовать в переключении между различными видами клеточной гибели, что дает возможность расширить знания по возможным механизмам химиорезистентности и клеточной гибели. За отчетный период нами опубликовано 10 статей в международных журналах. Было сделано 24 доклада на международных и отечественных конференциях (из них 11 приглашенных и 2 устных), получены 7 премий, защищены 2 кандидатские диссертации и 2 дипломных проекта, организованы и проведены 1 курс для студентов МГУ и 1 курс для студентов Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Ранее была показана ключевая роль снижения уровня антиапоптотического белка Mcl-1, представителя семейства Bcl-2, в усилении цисплатин-индуцированной гибели раковых клеток линий Caov-4 и HeLa в условиях депривации сыворотки (SD – serum deprivation). Для детального анализа механизмов ускорения деградации Mcl-1 при комбинаторном воздействии цисплатина и SD были рассмотрены три способа регуляции уровня Mcl-1: расщепление каспазами, протеасомная деградация, снижение уровня синтеза данного белка на уровне транскрипции. Проведенные исследования показали, что расщепление Mcl-1 происходит независимо от активности каспаз, а следовательно, предшествует их активации. Несмотря на то, что в рамках исследуемой модели наблюдалась протеасомная деградация Mcl-1, ее уровень не зависил от наличия сыворотки в культуральной среде. Было показано, что при культивировании клеток в бессывороточной среде синтез Mcl-1 подавляется на уровне транскрипции. Таким образом, суммарно полученные данные свидетельствуют, что в условиях SD наблюдается подавление синтеза Mcl-1, что ведет к ускорению его деградации и последующему усилению апоптоза. Установлено, что, несмотря на снижение активации сигнального пути MEK/ERK в условиях депривации сыворотки, а также на описанную ранее роль киназ ERK-1/2 в регуляции уровня Mcl-1, данный каскад не оказывал решающего влияния на изменения уровня Mcl-1 в данной модели. Полученные данные создают предпосылки для разработки новых подходов к непрямому воздействию на Mcl-1 в комбинированной терапии опухолевых заболеваний. Нами установлено, что при воздействии ДНК-повреждающих агентов происходит образование двух независимых комплексов каспазы-2 и каспазы-8, в состав последнего входят такие белки как RIP1 и FADD. В ходе проведенных исследований была проанализирована роль каспазы-2 не только в индукции апоптоза, но и впервые ее влияние на некроптотическую гибель, вызванную генотоксическим стрессом, а также предложен вероятный механизм негативной регуляции некроптоза каспазой-2. С помощью разработанного протокола нами получены ядерные фракции клеток линий Caov-4 и HeLa, обработанных цисплатином. Измерение активности каспаз в выделенных фракциях подтвердило, что инициаторные каспазы-2 и-8 и эффекторная каспаза-3 находятся в ядре в активном состоянии. Детекция как проформ, так и активных форм каспаз в ядрах апоптотических клеток позволяет предположить возможность их активации непосредственно в ядре. Для подтверждения ядерной транслокации каспаз-2, -8, -9 и -3 был проведен анализ распределения данных белков с помощью конфокальной микроскопии. Данное исследование продемонстрировало, что почти в 20% клеток наблюдается накопление каспаз в ядре. Перемещение каспаз предшествовало регистрации значительного уменьшения их проформ, расщепления PARP и ламина В. Анализ с помощью конфокальной микроскопии показал, что ядра, содержащие каспазы, морфологически интактны. Это свидетельствует о том, что наблюдаемая транслокация каспаз являлась ранним событием, предшествующим деградации ядерной ламины и фрагментации ядер в ходе гибели клетки по пути апоптоза. Выяснена роль каспазы-3 в транслокации инициаторных каспаз-2, -8 и -9. Поскольку каспаза-3 является ведущей эффекторной каспазой и участвует в деградации белков ядерной поры и белков ламины, то было необходимо выяснить насколько важен этот белок для перемещения инициаторных каспаз в ядро. Исследование проведено на клетках MCF-7, дефицитных по каспазе-3. Установлено, что транслокация инициаторных каспаз происходит независимо от эффекторных каспаз. Анализ структуры митохондрий в условиях гипоксии показал, что в клетках нейробластомы TET21N при гипоксии митохондриальная сеть не распадалась, тогда как в клетках SK-N-BE(2) наблюдалось дробление сети. Содержание белка ГТФазы DRP1, отвечающего за дробление оказалось выше в клетках SK-N-BE(2), в которых происходит дробление митохондриальной сети в ответ на гипоксию, нежели в клетках TET21N. В присутствии ингибитора II комплекса дыхательной цепи – теноилтрифторацетона (TTFA) происходит дробление митохондриальной сети в клетках SK-N-BE(2) как в нормальных, так и в гипоксических условиях. В клетках TET21N, TTFA вызывал дробление только в гипоксических условиях. При гипоксии клеточное дыхание подавлено, что может вызвать снижение мембранного потенциала и накопление поврежденных митохондрий. Клетки способны элиминировать поврежденные органеллы посредством митофагии - аутофагии, направленной на митохондрии, сигналом для которой может служить глубокая гипоксия. В условиях гипоксии в клетках U1810 наблюдалось накопление I, характерной для макроаутофагии формы LC3-II и белка BNIP3, способного регулировать как апоптоз, так и аутофагию. Показано, что нокаут Atg13, важного для макроаутофагии, не влияет на накопление LC3-II в гипоксии, т.е. накопление LC3-II, вызванное гипоксией, не связано с макроаутофагией. Нокаут Atg13 также не влиял на содержание белка BNIP3. В клетках с дефицитом BNIP3 наблюдается высокий уровень апоптоза как в нормоксии, так и в гипоксии, что подтверждает роль поврежденных митохондрий в стимуляции гибели клеток. Таким образом, клетки, в которых экспрессия BNIP3 подавлена, более чувствительны к комбинированной терапии. Установлено, что стимуляция митофагии в результате деполяризации митохондрий существенно подавляет гибель клеток. Напротив, ингибирование митофагии стимулировало апоптоз. Таким образом, сочетание противоопухолевых препаратов с ингибиторами митофагии представляет собой перспективный подход к элиминации опухолевых клеток. Ранее нами показано, что в результате митотической катастрофы (МК) клетки могут погибнуть как по механизму некроза, так и апоптоза. В данном проекте мы показали, что стимуляция МК в клетках HCT116 способна завершиться не только апоптозом или некрозом, но и аутофагией с последующим развитием апоптоза. Стимуляция апоптоза в клетках с нокаутом Atg 13 вызывала значительное подавление МК. Ключевую роль во взаимоотношении аутофагии и МК играют митохондрии и их расположенность к апоптозу. Стимуляция МК является критическим событием, в результате которого клетка решает, как ей предстоит погибнуть, в то время как митохондрии являются регулятором баланса между МК, аутофагией и апоптозом. Нами показано, что ингибитор гликолиза 2-дезоксиглюкоза (2-ДГ) значительно усиливал апоптоз в клетках нейробластомы. Однако, в клетках HCT116 наблюдалась обратная ситуация – 2-ДГ защищала их от апоптоза. Анализ метаболического профиля опухолевых клеток различной этиологии (SK-N-BE(2) и HCT116) установил более активное митохондриальное дыхание в клетках HCT116, чем в SK-N-BE(2). Обработка 2-ДГ приводила к существенному снижению уровня АТФ в клетках SK-N-BE(2), а в клетках HCT116 подавление продукции АТФ было слабее за счет компенсаторной активности митохондрий. Анализ показал, что ответ на индукцию стресса ЭР зависит от уровня аутофагии и 2-ДГ может как усилить апоптоз, вызванный цисплатином, так и снизить, что необходимо учитывать при комбинировании цитотоксических агентов с модуляторами энергетики. Для выяснения влияния белков BNIP3 и TSN на апоптоз и аутофагию проведен анализ гибели клеток, индуцированной цисплатином, в клетках А549 дикого типа и нокаутных по этим белкам. Показано, что нокаутные клетки более чувствительны к цисплатин-индуцированному апоптозу. Этот эффект был нивелирован при использовании комбинации ингибиторов аутофагии (Пепстатин и Е64d) с цисплатином. Установлен низкий базальный уровень LC3-II в клетках А549, который не меняется после индукции цисплатином. Аналогичная ситуация наблюдалась в нокаутных по TSN клетках, что означает отсутствие влияния TSN на процесс аутофагии. Нокаут BNIP3 в клетках А549 привёл к повышению базального уровня аутофагии. Таким образом, в клетках A549, нокаутных по BNIP3, наблюдается самая высокая чувствительность к цисплатину. Опухоли имеют способность к инвазии и метастазированию, связанную с эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП). Анализ «на зарастание раны» показал, что в нокаутных по BNIP3 клетках A549 заживление «царапины» происходит значительно медленнее, чем в клетках дикого типа. При добавлении бафиломицина происходило подавление миграции в этих клетках. Установлено, что в клетках A549 дикого типа в ответ на снижение содержания сыворотки в среде резко повышалось содержание MAPK 42/44 (ERK 1/2). Нокаутные по BNIP3 клетки менее активно реагировали на нехватку питательных веществ. Соответственно изменялось и содержание Akt, являющегося мишенью ERK 1/2 и расположенного ниже в каскаде. Снижение активности MAPK-каскада приводит к снижению способности клеток опухоли к миграции и метастазированию. С использованием двухгибридного скрининга дрожжей нами установлена новая неапоптотическая функция каспазы-2 и новый белок (FAN), взаимодействующий с ней. Каспаза-2-зависимое дерегулирование высвобождения IL-6, везикулярного гомеостаза и задержанное «зарастание раны» четко указывает на связь между каспазой-2 и FAN. В совокупности эти данные позволили расширить наши знания о неапоптотической роли фермента в регуляции клеточных функций. Для анализа физиологической роли каспазы-2 необходимо вывести чистые линии гомозигот, имеющие делеции в гене каспазы-2 для его нокаута. Нами на основе CRISPR/Cas9 созданы конструкции для введения делеций 7 и 20 нуклеотидов в последовательности в экзоне 5 для получения генно-модифицированных мышей. Аккумуляция каспаз в ядре продемонстрировала универсальность явления транслокации при стимуляции апоптоза ФНО или стауроспорином. В клетках с нарушением функции каспазы-3, расщепление инициаторными каспазами своих субстратов является особенно важным для протекания апоптоза. Получены видеоматериалы по визуализации маркеров аутофагии и выяснению взаимосвязи апоптоза и аутофагии. Показано, что стимуляция апоптоза в клетках НСТ116 цисплатином сопровождается аутофагией, которая существенно возрастает в условиях подавления гликолиза. Охарактеризован стресс ЭР в нормальных и гипоксических условиях. Показано, что ингибирование комплекса II под действием TTFA стимулировало ЭР стресс в условиях нормоксии, но не гипоксии. Антиоксиданты обращали гибель клеток в условиях нормоксии, что подтвердило факт участия окислительного стресса в стимуляции гибели клеток TTFA. Учитывая роль митохондрий в инициации и реализации апоптоза, исследован эффект различных препаратов на митохондрии. Установлено, что этопозид вызывал быстрое снижение скорости дыхания за счет непосредственного и обратимого взаимодействия с комплексом I дыхательной цепи митохондрий, приводящее к стимуляции окислительного стресса. Однако, комплекс II оставался интактным. Этопозид также вызывал образование АФК, что приводило к апоптозу, возрастающему в условиях депривации глютамина. Установлено, что сочетание этопозида с ингибиторами антиоксидантых систем клетки может быть успешным для повышения эффективности препарата. За отчетный период нами опубликовано 6 статей в международных журналах, входящих в список WoS/Scopus, все журналы относятся к группе Q1. Было сделано 20 докладов на международных и отечественных конференциях (из них 10 приглашенных и 5 устных), получен 1 патент на изобретение, сотрудниками получено 6 премий, защищены 2 кандидатские диссертации, три магистерских диплома, организованы и проведены 2 курса для студентов МГУ.