КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-25-00056

НазваниеВлияние на взаимодействие между различными формами клеточной гибели: способ борьбы с раком

РуководительЖивотовский Борис Давидович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2017 - 2018 

КонкурсКонкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований коллективами существующих научных лабораторий (кафедр)»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые словаГибель клеток, апоптоз, каспазы, митохондрии, рак, резистентность, терапия

Код ГРНТИ34.15.51


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Программируемая гибель клетки представляет собой физиологический процесс чрезвычайно важный в процессе эмбрионального развития и в зрелом организме для поддержания тканевого гомеостаза. Исследованиями, выполненными в последние годы установлено, что количество и качество клеток в популяции, в тканях и органах тщательно регулируется процессами пролиферации, дифференцировки и гибели. Нарушение любого из этих процессов влечёт либо появление и накопление патологических и нежелательных клеток, либо неконтролируемый рост количества клеток, либо неконтролируемую их гибель. Так, различные нейродегенеративные заболевания (болезни Паркинсона и Альцгеймера) характеризуются интенсивной гибелью клеток мозга. В то время как развитие опухолей происходит в ассоциации с подавлением процессов клеточной гибели. Данная область знаний является одной из наиболее быстро развивающихся областей биомедицины. Успехи, достигнутые в последние годы, подтверждаются признанием научного сообщества. Это единственная область биомедицинской науки, за успехи в которой в последние 15 лет присуждено 3 Нобелевские Премии: За выяснение ключевых регуляторов клеточного цикла (2001); За выяснение механизмов программируемой гибели клеток (2002); За выяснение механизмов аутофагии (2016). Несмотря на то, что нарушение процессов программируемой гибели опухолевых клеток является лишь одним из признаков канцерогенеза, на сегодняшний день основным способом борьбы с онкологическими заболеваниями является активация механизмов гибели клеток. Исследование различных аспектов клеточной гибели является наиболее быстро развивающейся областью биомедицины. На сегодняшний день научное сообщество признает наличие более десяти различных форм программируемой гибели клеток, среди которых апоптоз, некроптоз и аутофагия. Не все из них оперируют одновременно, но взаимопроникновение метаболических путей различных форм клеточной гибели существует, и, согласно современным взглядам, можно предположить, что направленная активация различных взаимодополняющих форм клеточной гибели послужит новой стратегией борьбы с различными заболеваниями, в том числе и со злокачественными новообразованиями. Несмотря на достигнутые в последние годы успехи в исследовании гибели клеток, в наших знаниях есть немало пробелов, в частности касающихся механизмов активации и функционирования этих физиологических процессов. Это не позволяет нам понять, как можно влиять на машину клеточной гибели с целью повысить чувствительность раковых клеток к терапии. К числу конкретных задач данного проекта относятся: (1) Исследование механизмов активации каспазы-2 и ее функций в регуляции различных типов гибели клеток; (2) Анализ роли митохондрий в регуляции митотической катастрофы и аутофагии; (3) Оценка последствий дерегуляции клеточной гибели и взаимосвязи различных видов клеточной гибели в устойчивости опухолевых клеток к терапии на примере клеток рака лёгкого. Новизна предлагаемого проекта состоит в более глубоком понимании взаимопроникновения метаболических путей апоптоза, аутофагии, некроптоза и митотической катастрофы) с целью использовать полученные знания для преодоления устойчивости опухолевых клеток к терапии. Вещества, испытываемые в настоящее время в клинике, можно разделить на две группы: непосредственно воздействующие на процессы, вовлечённые в регуляцию клеточной гибели, и те, которые предназначены для подавления ростовых факторов, и, следовательно, активирующие клеточную гибель. Есть надежда, что на основе наших достижений некоторые из испытуемых веществ станут весомым дополнением к терапевтическому арсеналу будущего. Скорее всего, этот арсенал будет включать цитотоксические препараты, используемые в комбинации с агентами, специфически воздействующими на определённые молекулы-мишени регулирующие клеточную гибель. Как пациенты, так и клиницисты надеются на появление нового поколения терапевтических подходов, которые можно будет использовать в лечении рака. Условиями для успешного выполнения данного проекта является наличие: (а) команды, созданной 6 лет назад и включающей как опытных, так и молодых исследователей, обладающей большим опытом в исследовании различных форм клеточной гибели; (б) предварительно полученных положительных результатов; (в) оборудования необходимого для проведения экспериментов (конфокальный микроскоп, уникальный прибор для оценки биоэнергетики клетки – Seahorse Analyzer, оборудование для спектрального анализа, проточный цитометр, и т.д.). Сотрудничество с Российским Научным Центром Онкологии им Н.Н. Блохина и Московским Научно-исследовательским Онкологическим Институтом имени П.А. Герцена, даёт возможность проведения экспериментов с использованием клинического материала.

Ожидаемые результаты
К моменту завершения работы над проектом планируем: (1) Получить новую информацию о механизмах активации каспазы-2 и ее функциях в регуляции различных типов гибели клеток; (2) Установить роль митохондрий в регуляции взаимодействия между митотической катастрофой аутофагией; (3) Оценить роль взаимосвязи между апоптозом и аутофагией регуляции ответа опухолевых клеток к терапии. Занимаясь вопросами радиобиологии и пытаясь понять механизмы высокой радиочувствительности лимфоидных органов, еще в начале 90х мы предлоположили, что «модуляция апоптотических путей может быть широко использована в будущем для терапии рака». Более того, мы высказли гипотезу, что выбирая путь пролиферации, клетка одновременно отключает работу машины, действующей по принципу "лучше умереть, чем быть неправильной". Накопленные в настоящее время данные свидетельствуют, что мутации или измененная экспрессия гено и их продуктов, принимающих активное участие в регуляции клеточной гибели, тесно связаны как с генетически-детерминированной, так и приобретенной устойчивостью опухолевых клеток к терапевтическому ответу. Эта информация лежит в основе выработки новых терапевтических стратегий, способных использовать в качестве мишеней различные звенья метаболических путей клеточной гибели. Идентификация молекул, принимающих участие в регуляции переключения от одного к другому типу гибели позволила установить новые мишени, на которые стало возможно специфически воздействовать. Одним из ключевых механизмов активации апоптоза, индуцированного ДНК-повреждающими химиорепаратами, является активаций каспазы-2. Несмотря на то, что этот фермент был первым описанным в данном семействе в клетках человека, он по-прежне является одим из наименее изученных. В заканчивающемся проекте мы показали, что в дополнении к известному высокомолкулярному комплексу, PIDDосомы, каспаза-2 может активироваться в составе ранее неизвестого комплекса без белков PIDD и RAIDD. Масс-спектрометрический анализ полученных образцов выявил три группы потенциальных партнеров каспазы-2: 1) белки, участвующие в убиквитинилировании и деградации; 2) киназы, фосфотазы и белки, регулирующие клеточный цикл 3) субстраты. Таким образом, в результате выполнения данного проекта мы сможем ответить с какими белками взаимодействует каспаза-2. Это необходимо для понимания механизма программируемой клеточной гибели, запускаемой в ответ на повреждения ДНК. Известно, что каспаза-2, единственная из входящих в состав семейства белов имеет сигнал локализации в ядре. Полученные нами данные косвенно свидетельствовали о ядерной функциональности (наличие расщепленных форм) и/или возможной ядерной активации (детекция проформ) каспаз в ходе апоптотической гибели. Однако, в настоящее время ядерные субстраты каспазы-2 неизвестны. Принимая во внимание наличие у исследуемой нами каспазы-2 свойств как инициаторных, так и эффекторных каспаз, открытие новых ядерных субстратов каспазы-2 в результате выполнения данного проекта представляет собой перспективное направление для дальнейших исследований. Хорошо известно, что митохондрии выполняют роль "коммутатора" в регуляции апоптоз и некроза. В нашей работе мы установили роль органелл в регуляции митотической катастрофы. Кроме того, нами впервые было показано, что в определенных случаях митотическая катастрофа может приводить к аутофагии. Мы рассчитываем по окончании данного проекта установить роль митохондрий в регуляции взаимодействия между митотической катастрофой аутофагией. Ранее нами показано, что одним из перспективных направлений стратегии в борьбе с опухолями является воздействие на митохондрии опухолевых клеток. Контроль качества состояния митохондрий очень важен для клетки. Поврежденные или «избыточные» митохондрии клетки подвергаются элиминации в процессе митофагии, одного из подтипов аутофагии. Селективное воздействие на процесс митофагии (аутофагии) в комбинации с индукцией апоптоза в опухолевых клетках может усилить цитотоксические свойства химиотерапии. В конце данного исследования мы планируем получить ответ на вопрос так ли это и какие механизмы ответственны за этот процесс. Данные по анализу экспрессии генов в клетках аденокарциномы легкого показали, что уровень экспрессии белка TSN в клетках аденокарциномы легкого, а также в опухолевых образцах значительно превышает экспрессию данного белка в нормальных фибробластах легкого и в образцах полученных из нормальных тканей этого органа. С помощью аффиметрического и биоинформатического анализа мы установили новую цепь событий (TSN-S100A11-PLA2), регулирующую супероксид-зависимый апоптоз, запускаемый платина-содержащими препаратами в клетках аденокарциномы легких, который может быть таргетирован в новой противоопухолевой терапии. Однако, в результате нокаута TSN одновременно с уменьшением уровня белка S100A11 уровень белков BNIP3 и IGFBP2. Важно отметить, что белок BNIP3 принимает участие в регуляции аутофагии, а IGFBP2 - апоптоза. C помощью технологии CRISPR/Cas9 мы получили и детально охарактеризовали клеточные линии аденокарциномы легкого нокаутные по всем трем белкам. В конце данного исследования узнаем каков механизм подобного явления и как оно влияет на регуляцию чувствительности клеток аднокарциномы легких к терапии. К сожалению, действие традиционных химиопрепаратов достаточно ограничено. Мы полагаем, что, терапия, основанная на стимуляции клеточной гибели, приведет к снижению пороговой чувствительности опухолевых клеток (то есть к преодолению устойчивости к терапии путём снижения экспрессии антиапоптотических генов, либо повышения экспрессии про-апоптотических). Информация о структуре и механизмах действия регуляторных и эффекторных белков уже помогает поиску новых провоопухолевых препаратов. Область исследования гибели клеток является одной из наиболее быстро развивающихся в биомедицине, однако, количество научных групп в России занимающихся этой проблемой довольно малочисленно, и объем статей из России, публикуемых в ведущих научных журналах по данной тематике не очень велик. Наша лабораторий создана всего 6 лет назад и уже стала известной. Более 40 публикаций за этот период в ведущих журналах позволяют надеяться, что цель данного исследования и лаборатории в целом - проведение исследований на самом высоком уровне - будет достигнута. Совершенно очевидно, что научные данные и созданная нами инфраструктура будет доступны научному сообществу и вне нашей лаборатории. Анализ взаимопроникновения метаболических путей различных форм клеточной гибели представляет собой предмет первостепенной важности, поскольку полученные знания позволят существенно повысить эффективность противоопухолевых препаратов и применяемых стратегий. Необходимо отметить, что все описанные выше ожидаемые конкретные научные результаты, а также планируемые на этом основании публикации могут быть достигнуты только в случае поддержки гранта в полном обьеме (20000 тыс. р.). В случае уменьшения обьема финансирования, к сожалению, мы будем вынуждены оставить за собой право пропорционально снизить степень выполнения заявленного в проекте плана работы и, соответственно, число публикаций.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
С помощью биоинформатического анализа и анализа литературы были проанализированы пост-трансляционные модификации (ПТМ) каспазы-2 по сравнению с ПТМ других представителей семейства каспаз и их влияние на активацию и функции данных белков. Проведенный анализ показал, что самым распространенным типом ПТМ является фосфорилирование и убиквитинилирование. Первый тип ПТМ в подавляющем большинстве случаев приводит к следующим последствиям: 1) блокируется расщепление проформ каспаз и, следовательно, их активация; 2) происходит изменение конформации активного центра каспаз и ингибирование активности каспаз. Второй распространённый среди каспаз тип ПТМ – убиквитинилирование – регулирует в первую очередь уровень каспаз в клетке за счет процесса деградации. Несмотря на довольно большое количество описанных ПТМ для инициаторных каспаз-8 и -9, для каспазы-2 было охарактеризовано только 3 сайта фосфорилирования. Для изучения фосфорилирования каспазы-2 и других каспаз был проведен сравнительный анализ консервативных остатков серина, треонина и тирозина в первичной последовательности каспаз позвоночных и беспозвоночных организмов. Анализ множественного выравнивания показал, что экспериментально доказанные сайты фосфорилирования достаточно консервативны во всех каспазах, включая каспазу-2. Более того, был проведен анализ пространственной структуры каспаз с учетом расположения консервативных сайтов фосфорилирования. При этом показано, что некоторые из них, такие как T263 каспазы-8 и S183 каспазы-9 находятся в одном и том же положении в составе пространственной структуры фермента по отношению к активному центру. Также подобную закономерность можно было наблюдать для пространственного расположения высококонсервативных остатков треонина или серина T67, T67, T90 у каспаз-3, -6, и -7, соотвественно. Таким образом, было сделано предположение, что данные сайты могут принимать участие в модификации каспаз и регуляции протеолитической активности ферментов. Установленные в ходе ряда экспериментальных исследований сайты фосфорилирования S347, S150, T173 у каспаз-8, -3, -7, соотвественно, показали эволюционную консервативность среди всех организмов. Анализ сайтов узнавания и расщепления каспазы-2 выявил, что в белке RIP1 имеется мотив, который может быть распознан данной протеазой. Поскольку RIP1 – ключевой компонент некроптотического пути гибели клеток, было проведено исследование процесса некроптоза при воздействии цисплатина в клетках карциномы яичника Caov-4 дикого типа и с пониженным содержанием каспазы-2. Уровень расщепления RIP1 после обработки цисплатином заметно снижался в клетках Caov-4-shRNA-каспаза-2 по сравнению с диким типом, что говорило о потенциальной роли каспазы-2 в регуляции некроптоза. Анализ фосфорилирования RIP1 и белка MLKL – ключевых маркеров некроптотической гибели – продемонстрировал, что в дефицитных по каспазе-2 клетках накопления фосфорилированных форм данных белков происходит на существенно более высоком уровне чем в клетках дикого типа. Таким образом, каспаза-2, по-видимому, играет роль негативного регулятора некроптоза в клетках Caov-4 в ответ на индукцию гибели ДНК-повреждающим агентом цисплатином. С помощью скрининга нами выявлен белок, взаимодействующий с каспазой-2. Им оказался связанный с X-ассоциированным анкирином белок (RFXANK). Полученные данные указывают на новую роль каспазы-2 - контроль регуляции гена гистосовместимости MHC класса II. Анализ клинических образцов пациенток с карциномой яичника показал, что каспаза-2 экспрессируется в нормальной и опухолевой ткани. При этом у 5 из 12 пациенток наблюдался повышенный уровень каспазы-2 в опухолевой ткани. У двух пациенток с повышенным содержаением каспазы-2 в опухолевой ткани было отмечено появление расщепленной формы белка PARP, которое может свидельствовать о запуске апоптоза после химиотерапии. Анализ механизмов усиления цисплатин-индуцированной гибели раковых клеток линий Caov-4 и HeLa в условиях депривации сыворотки (SD – serum deprivation) показал, что ключевую роль в данном процессе играет антиапоптотический белок семейства Bcl-2 - Mcl-1. На предыдущем этапе работы было показано, что при комбинации цисплатина и депривации сыворотки наблюдалось ускорение сборки высокомолекулярного комплекса активации каспазы-9 – апоптосомы. Для детального анализа механизма усиления апоптоза в условиях SD был проанализирован уровень антиапоптотических белков семейства Bcl-2 - Bcl-2, Bcl-xL и Mcl-1, негативно регулирующих пермеабилизацию внешней мембраны митохондрий. Данный анализ показал, что уровень белков Bcl-2 и Bcl-xL оставался без изменений независимо от способа индукции клеточной гибели. В то же время комбинаторное воздействие цисплатина и депривации сыворотки приводило к существенному снижению уровня белка Mcl-1 по сравнению с воздействием цисплатина в стандартной среде, содержащей сыворотку. Дальнейший анализ с помощью методов оверэкпрессии Mcl-1 или, наоборот, подавления его синтеза с помощью миРНК подтвердил ведущую роль этого белка в усилении цисплатин-индуцированной гибели раковых клеток в условиях депривации сыворотки. В процессе выполнения проекта получены оригинальные данные, раскрывающие молекулярные механизмы взаимодействий различных форм клеточной гибели. Впервые было установлено, что митотическая катастрофа (МК) приводит не только к некрозу или апоптозу, как считалось ранее, но и способна стимулировать аутофагию. Полученные нами данные о том, что свойство МК - предшествовать различным типам гибели - не зависит от типа клеток, а митохондрии могут являться важными модуляторами в выборе конечного типа клеточной гибели, внесут существенный вклад в выработку стратегий, направленных на преодоление резистентности опухолей. Нами показано, что накопление поврежденных митохондрий в клетках с дефицитом аутофагии приводит к активации апоптоза в этих клетках при различных стрессовых условиях, включая голодание. Установлено, что подавление механизма трансляции белков в случае отсутствия питательных веществ зависит от функционирования каспаза-8-зависимого апоптоза в аутофагия-дефицитных клетках рака легких. Нами установлено, что инициация митофагии разобщителем окисления и фосфорилирования вызывает подавление апоптоза, вызванного цисплатином, тогда как ее подавление, напротив, стимулирует клеточную гибель. Полученные данные позволяют использовать митофагию, в качестве фактора, модулирующего гибель клеток чем значительно повысить эффективность противоопухолевой терапии. В ходе выполнения проекта изучена роль белка TSN и ее белков-мишеней BNIP3 и IGFBP2 в регуляции механизмов клеточной гибели. Показано, что подавление экспрессии белка BNIP3 в клетках аденокарциномы легкого приводит к увеличению апоптоза. В то время как подавление экспрессии IGFBP2 при подавлении апоптоза ведет к увеличению клеточной гибели путем некроптоза. На основе полученных данных сделан вывод, что белки-мишени TSN, BNIP3 и IGFBP2, могут участвовать в переключении между различными видами клеточной гибели, что дает возможность расширить знания по возможным механизмам химиорезистентности и клеточной гибели. За отчетный период нами опубликовано 10 статей в международных журналах. Было сделано 24 доклада на международных и отечественных конференциях (из них 11 приглашенных и 2 устных), получены 7 премий, защищены 2 кандидатские диссертации и 2 дипломных проекта, организованы и проведены 1 курс для студентов МГУ и 1 курс для студентов Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

 

Публикации

1. - Смерть клеток и жизнь после мегагранта: интервью Бориса Животовского Indicator.ru, 26 ноября, 2017 (год публикации - ).

2. - Ученые МГУ исследовали механизмы влияния модификаций белков на апоптоз МГУ, Биология, 22.05.2017 (год публикации - ).

3. - Найден способ уничтожать опухолевые клетки при помощи митотической катастрофы Indicator.ru, 30 ноября 2017 (год публикации - ).

4. Аллавена Г, Куомо Ф, Баумгартнер Г, Беле Т, Ярар СА, Сое О, Джонсон К, Гогвадзе В, Животовский Б, Каминский ВО Suppressed translation as a mechanism of initiation of caspase-8-dependent apoptosis in autophagy-deficient NSCLC cells under nutrient limitation Autophagy, - (год публикации - 2017).

5. Вальтер К, Животовский Б, Гогвадзе В Cell death-based treatment of neuroblastoma Cell Death & Disease, - (год публикации - 2017).

6. Виман КГ, Животовский Б Understanding cell cycle and cell death regulation provides novel weapons against human diseases Journal of Internal Medicine, 281, 482-495 (год публикации - 2017).

7. Денисенко ТВ, Будкевич ИН, Животовский Б Cell death-based treatment of lung adenocarcinoma Cell Death & Disease, - (год публикации - 2017).

8. Замараев А.В., Копеина Г.С., Прохорова Е.А., Животовский Б.Д., Лаврик И.И. Post-translational modification of caspases: the other side of apoptosis regulation. Trends in Cell Biology, 27, 322-339 (год публикации - 2017).

9. Недопекина ДА, Губайдуллин РР, Одиноков ВН, Максимчик ПВ, Животовский Б, Бельский ЮП, Хазанов ВА, Мануйлова АВ, Гогвадзе В, Спивак АЮ Mitochondria-targeted betulinic and ursolic acids derivatives: synthesis and anticancer activity MedChemComm, 8, 1934-1945 (год публикации - 2017).

10. Сеничкин ВВ, Копеина ГС, Прохорова ЕА, Замараев ВВ, Лаврик ИН, Животовский Б Modulation of Mcl-1 transcription by serum deprivation sensitizes cancer cells to cisplatin BBA - General Subjects, - (год публикации - 2017).

11. Сорокина И.В., Денисенко Т.В., Имре Г, Тюрин-Кузмин П.А., Каминский В.О., Гогвадзе В и Животовский Б Involvement of autophagy in the outcome of mitotic catastrophe Scientific Reports, 7, 14571 (год публикации - 2017).

12. Форсберг Д, Животовский Б, Ульсон М Caspase-2 – an orphan enzyme out of the shadows Oncogene, 36, 5441-5444 (год публикации - 2017).

13. Форсберг Д, Ли Х, Aкпинар Б, Салватори Р, Отт М, Животовский Б, Улсон М A caspase-2-RFXANK interaction and its implication for MHC class II expression Cell Death & Disease, - (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Ранее была показана ключевая роль снижения уровня антиапоптотического белка Mcl-1, представителя семейства Bcl-2, в усилении цисплатин-индуцированной гибели раковых клеток линий Caov-4 и HeLa в условиях депривации сыворотки (SD – serum deprivation). Для детального анализа механизмов ускорения деградации Mcl-1 при комбинаторном воздействии цисплатина и SD были рассмотрены три способа регуляции уровня Mcl-1: расщепление каспазами, протеасомная деградация, снижение уровня синтеза данного белка на уровне транскрипции. Проведенные исследования показали, что расщепление Mcl-1 происходит независимо от активности каспаз, а следовательно, предшествует их активации. Несмотря на то, что в рамках исследуемой модели наблюдалась протеасомная деградация Mcl-1, ее уровень не зависил от наличия сыворотки в культуральной среде. Было показано, что при культивировании клеток в бессывороточной среде синтез Mcl-1 подавляется на уровне транскрипции. Таким образом, суммарно полученные данные свидетельствуют, что в условиях SD наблюдается подавление синтеза Mcl-1, что ведет к ускорению его деградации и последующему усилению апоптоза. Установлено, что, несмотря на снижение активации сигнального пути MEK/ERK в условиях депривации сыворотки, а также на описанную ранее роль киназ ERK-1/2 в регуляции уровня Mcl-1, данный каскад не оказывал решающего влияния на изменения уровня Mcl-1 в данной модели. Полученные данные создают предпосылки для разработки новых подходов к непрямому воздействию на Mcl-1 в комбинированной терапии опухолевых заболеваний. Нами установлено, что при воздействии ДНК-повреждающих агентов происходит образование двух независимых комплексов каспазы-2 и каспазы-8, в состав последнего входят такие белки как RIP1 и FADD. В ходе проведенных исследований была проанализирована роль каспазы-2 не только в индукции апоптоза, но и впервые ее влияние на некроптотическую гибель, вызванную генотоксическим стрессом, а также предложен вероятный механизм негативной регуляции некроптоза каспазой-2. С помощью разработанного протокола нами получены ядерные фракции клеток линий Caov-4 и HeLa, обработанных цисплатином. Измерение активности каспаз в выделенных фракциях подтвердило, что инициаторные каспазы-2 и-8 и эффекторная каспаза-3 находятся в ядре в активном состоянии. Детекция как проформ, так и активных форм каспаз в ядрах апоптотических клеток позволяет предположить возможность их активации непосредственно в ядре. Для подтверждения ядерной транслокации каспаз-2, -8, -9 и -3 был проведен анализ распределения данных белков с помощью конфокальной микроскопии. Данное исследование продемонстрировало, что почти в 20% клеток наблюдается накопление каспаз в ядре. Перемещение каспаз предшествовало регистрации значительного уменьшения их проформ, расщепления PARP и ламина В. Анализ с помощью конфокальной микроскопии показал, что ядра, содержащие каспазы, морфологически интактны. Это свидетельствует о том, что наблюдаемая транслокация каспаз являлась ранним событием, предшествующим деградации ядерной ламины и фрагментации ядер в ходе гибели клетки по пути апоптоза. Выяснена роль каспазы-3 в транслокации инициаторных каспаз-2, -8 и -9. Поскольку каспаза-3 является ведущей эффекторной каспазой и участвует в деградации белков ядерной поры и белков ламины, то было необходимо выяснить насколько важен этот белок для перемещения инициаторных каспаз в ядро. Исследование проведено на клетках MCF-7, дефицитных по каспазе-3. Установлено, что транслокация инициаторных каспаз происходит независимо от эффекторных каспаз. Анализ структуры митохондрий в условиях гипоксии показал, что в клетках нейробластомы TET21N при гипоксии митохондриальная сеть не распадалась, тогда как в клетках SK-N-BE(2) наблюдалось дробление сети. Содержание белка ГТФазы DRP1, отвечающего за дробление оказалось выше в клетках SK-N-BE(2), в которых происходит дробление митохондриальной сети в ответ на гипоксию, нежели в клетках TET21N. В присутствии ингибитора II комплекса дыхательной цепи – теноилтрифторацетона (TTFA) происходит дробление митохондриальной сети в клетках SK-N-BE(2) как в нормальных, так и в гипоксических условиях. В клетках TET21N, TTFA вызывал дробление только в гипоксических условиях. При гипоксии клеточное дыхание подавлено, что может вызвать снижение мембранного потенциала и накопление поврежденных митохондрий. Клетки способны элиминировать поврежденные органеллы посредством митофагии - аутофагии, направленной на митохондрии, сигналом для которой может служить глубокая гипоксия. В условиях гипоксии в клетках U1810 наблюдалось накопление I, характерной для макроаутофагии формы LC3-II и белка BNIP3, способного регулировать как апоптоз, так и аутофагию. Показано, что нокаут Atg13, важного для макроаутофагии, не влияет на накопление LC3-II в гипоксии, т.е. накопление LC3-II, вызванное гипоксией, не связано с макроаутофагией. Нокаут Atg13 также не влиял на содержание белка BNIP3. В клетках с дефицитом BNIP3 наблюдается высокий уровень апоптоза как в нормоксии, так и в гипоксии, что подтверждает роль поврежденных митохондрий в стимуляции гибели клеток. Таким образом, клетки, в которых экспрессия BNIP3 подавлена, более чувствительны к комбинированной терапии. Установлено, что стимуляция митофагии в результате деполяризации митохондрий существенно подавляет гибель клеток. Напротив, ингибирование митофагии стимулировало апоптоз. Таким образом, сочетание противоопухолевых препаратов с ингибиторами митофагии представляет собой перспективный подход к элиминации опухолевых клеток. Ранее нами показано, что в результате митотической катастрофы (МК) клетки могут погибнуть как по механизму некроза, так и апоптоза. В данном проекте мы показали, что стимуляция МК в клетках HCT116 способна завершиться не только апоптозом или некрозом, но и аутофагией с последующим развитием апоптоза. Стимуляция апоптоза в клетках с нокаутом Atg 13 вызывала значительное подавление МК. Ключевую роль во взаимоотношении аутофагии и МК играют митохондрии и их расположенность к апоптозу. Стимуляция МК является критическим событием, в результате которого клетка решает, как ей предстоит погибнуть, в то время как митохондрии являются регулятором баланса между МК, аутофагией и апоптозом. Нами показано, что ингибитор гликолиза 2-дезоксиглюкоза (2-ДГ) значительно усиливал апоптоз в клетках нейробластомы. Однако, в клетках HCT116 наблюдалась обратная ситуация – 2-ДГ защищала их от апоптоза. Анализ метаболического профиля опухолевых клеток различной этиологии (SK-N-BE(2) и HCT116) установил более активное митохондриальное дыхание в клетках HCT116, чем в SK-N-BE(2). Обработка 2-ДГ приводила к существенному снижению уровня АТФ в клетках SK-N-BE(2), а в клетках HCT116 подавление продукции АТФ было слабее за счет компенсаторной активности митохондрий. Анализ показал, что ответ на индукцию стресса ЭР зависит от уровня аутофагии и 2-ДГ может как усилить апоптоз, вызванный цисплатином, так и снизить, что необходимо учитывать при комбинировании цитотоксических агентов с модуляторами энергетики. Для выяснения влияния белков BNIP3 и TSN на апоптоз и аутофагию проведен анализ гибели клеток, индуцированной цисплатином, в клетках А549 дикого типа и нокаутных по этим белкам. Показано, что нокаутные клетки более чувствительны к цисплатин-индуцированному апоптозу. Этот эффект был нивелирован при использовании комбинации ингибиторов аутофагии (Пепстатин и Е64d) с цисплатином. Установлен низкий базальный уровень LC3-II в клетках А549, который не меняется после индукции цисплатином. Аналогичная ситуация наблюдалась в нокаутных по TSN клетках, что означает отсутствие влияния TSN на процесс аутофагии. Нокаут BNIP3 в клетках А549 привёл к повышению базального уровня аутофагии. Таким образом, в клетках A549, нокаутных по BNIP3, наблюдается самая высокая чувствительность к цисплатину. Опухоли имеют способность к инвазии и метастазированию, связанную с эпителиально-мезенхимальным переходом (ЭМП). Анализ «на зарастание раны» показал, что в нокаутных по BNIP3 клетках A549 заживление «царапины» происходит значительно медленнее, чем в клетках дикого типа. При добавлении бафиломицина происходило подавление миграции в этих клетках. Установлено, что в клетках A549 дикого типа в ответ на снижение содержания сыворотки в среде резко повышалось содержание MAPK 42/44 (ERK 1/2). Нокаутные по BNIP3 клетки менее активно реагировали на нехватку питательных веществ. Соответственно изменялось и содержание Akt, являющегося мишенью ERK 1/2 и расположенного ниже в каскаде. Снижение активности MAPK-каскада приводит к снижению способности клеток опухоли к миграции и метастазированию. С использованием двухгибридного скрининга дрожжей нами установлена новая неапоптотическая функция каспазы-2 и новый белок (FAN), взаимодействующий с ней. Каспаза-2-зависимое дерегулирование высвобождения IL-6, везикулярного гомеостаза и задержанное «зарастание раны» четко указывает на связь между каспазой-2 и FAN. В совокупности эти данные позволили расширить наши знания о неапоптотической роли фермента в регуляции клеточных функций. Для анализа физиологической роли каспазы-2 необходимо вывести чистые линии гомозигот, имеющие делеции в гене каспазы-2 для его нокаута. Нами на основе CRISPR/Cas9 созданы конструкции для введения делеций 7 и 20 нуклеотидов в последовательности в экзоне 5 для получения генно-модифицированных мышей. Аккумуляция каспаз в ядре продемонстрировала универсальность явления транслокации при стимуляции апоптоза ФНО или стауроспорином. В клетках с нарушением функции каспазы-3, расщепление инициаторными каспазами своих субстратов является особенно важным для протекания апоптоза. Получены видеоматериалы по визуализации маркеров аутофагии и выяснению взаимосвязи апоптоза и аутофагии. Показано, что стимуляция апоптоза в клетках НСТ116 цисплатином сопровождается аутофагией, которая существенно возрастает в условиях подавления гликолиза. Охарактеризован стресс ЭР в нормальных и гипоксических условиях. Показано, что ингибирование комплекса II под действием TTFA стимулировало ЭР стресс в условиях нормоксии, но не гипоксии. Антиоксиданты обращали гибель клеток в условиях нормоксии, что подтвердило факт участия окислительного стресса в стимуляции гибели клеток TTFA. Учитывая роль митохондрий в инициации и реализации апоптоза, исследован эффект различных препаратов на митохондрии. Установлено, что этопозид вызывал быстрое снижение скорости дыхания за счет непосредственного и обратимого взаимодействия с комплексом I дыхательной цепи митохондрий, приводящее к стимуляции окислительного стресса. Однако, комплекс II оставался интактным. Этопозид также вызывал образование АФК, что приводило к апоптозу, возрастающему в условиях депривации глютамина. Установлено, что сочетание этопозида с ингибиторами антиоксидантых систем клетки может быть успешным для повышения эффективности препарата. За отчетный период нами опубликовано 6 статей в международных журналах, входящих в список WoS/Scopus, все журналы относятся к группе Q1. Было сделано 20 докладов на международных и отечественных конференциях (из них 10 приглашенных и 5 устных), получен 1 патент на изобретение, сотрудниками получено 6 премий, защищены 2 кандидатские диссертации, три магистерских диплома, организованы и проведены 2 курса для студентов МГУ.

 

Публикации

1. - Медики «оправдали» фермент-убийцу Наука в МГУ, - (год публикации - ).

2. - Учёные усилили противоопухолевый препарат, адресовав его митохондриям Наука в МГУ, - (год публикации - ).

3. - Найдены неожиданные функции белка, ответственного за программируемую гибель клеток Газета.Ру, - (год публикации - ).

4. - Медики из МГУ разработали способы лечения раковой опухоли в легких Наука в МГУ, - (год публикации - ).

5. - В МГУ предложили новый подход к лечению рака легких Аргументы и Факты, - (год публикации - ).

6. - Предложен новый метод таргетированной терапии рака Индикатор.ру, - (год публикации - ).

7. - На результат химиотерапии влияет процесс разрушения митохондрий Индикатор.ру, - (год публикации - ).

8. Абдрахманов А., Куликов А., Лучкина Е., Животовский Б., Гогвадзе В. Involvement of mitophagy in cisplatin-induced cell death regulation Biological Chemistry, - (год публикации - 2018).

9. Абдрахманов А.А., Максимчик П.В.,Гогвадзе В.Г.,Животовский Б.Д. Исследование чувствительности опухолевых клеток к терапии в условиях гипоксии Гены и Клетки, Том XII, № 3, стр.21 (год публикации - 2017).

10. Денисенко ТВ, Пивнюк АД, Животовский Б p53-autophagy-metastasis link Cancers, - (год публикации - 2018).

11. Животовский Б. Программируемая гибель клеток и регенерация тканей Гены и Клетки, Том XII, № 3, стр.8 (год публикации - 2017).

12. Замараев АА., Копеина ГС., Бухбиндер ДХ., Животовский Б., Лаврик ИН Caspase-2 is a negative regulator of necroptosis Int. J. Bioch. Cell Biol., - (год публикации - 2018).

13. Копеина Г.С., Замараев А.В., Лаврик И.Н., Животовский Б.Д. Способ выделения белкового высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2 человека -, 2016126059/15(040776) (год публикации - ).

14. Максимчик ПВ, Абдрахманов А., Иноземцева Е,Тюрин-Кузьмин ПА, Животовский Б, Гогвадзе В. 2-Deoxyglucose has distinct and cell line-specific effects on the survival of different cancer cells upon antitumor drug treatment FEBS Jоурнал, - (год публикации - 2018).

15. Прохорова ЕА, Копеина ГС, Лаврик ИН, Животовский Б Apoptosis regulation by subcellular relocation of caspases. Sci. Rept, - (год публикации - 2018).

16. Сеничкин В.В., Копеина Г.С., Лаврик И.Н., Животовский Б.Д ультивирование в бессывороточной среде усиливает цисплатин-индуцированную программируемую гибель опухолевых клеток независимо от аутофагии Гены и Клетки, Том XII, № 3, стр.221 (год публикации - 2017).

17. Форсберг Дж., Ли Ж., Замараев А., Панаретакис Т., ЖивотовскийБ., Улсон М. Caspase-2 associates with FAN through direct interaction and overlapping functionality Biochemical Biophysical Research Communications, - (год публикации - 2018).


Возможность практического использования результатов
Готовится предложение для использования разработанных технологий при планировании химиотерапии аденокарциномы легких и нейробластомы.