Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Участниками Проекта выполнены все поставленные на 2017 г. научные задачи, осуществлены запланированные поездки в экспедиции и на конференции. Проведён ряд экспериментальных исследований, касающихся различных аспектов биоразнообразия фитопатогенных грибов, апробированы и усовершенствованы методики микологических исследований. Проведено исследование морфологии и молекулярной филогении 24 штаммов фомоидных грибов (ранее относимых в род Phoma), ассоциированных с культурными и сорными растениями семейства Asteraceae (сложноцветные). Для всех штаммов была проанализирована микроморфология и секвенированы 4 участка генома, что дало возможность реконструировать филогению. Все штаммы были отнесены к семейству Didymellaceae, к 13 видам 6 родов: Ascochyta, Boeremia, Didymella, Neoascochyta, Nothophoma и Stagonosporopsis. Два штамма по нашему мнению, являются новым для науки видом, т.к. на филогенетическом древе формировали отдельную кладу в пределах рода Ascochyta, которая не включала в состав ни одной референсной последовательности. Четыре вида фомоидных грибов (D. bellidis, D. rosea, S. heliopsids и Nothophoma quercina) согласно доступной нам информации обнаружены в России впервые. Комплексное молекулярно-филогенетическое и морфологическое исследование также было проведено в отношении 51 штамма фомоидных грибов, выделенных с растений семейства Convolvulaceae (вьюнковые), и потенциально представляющих интерес в качестве агентов биоконтроля сорных растений. Большинство штаммов оказались представителями семейства Didymellaceae (Didymella spp., Boeremia exigua, Epicoccum plurivorum, Stagonosporopsis cucurbitacearum, S. heliopsidis и S. inoxydabilis). Семнадцать штаммов Didymella, Ascochyta, Nothophoma, Paraboeremia, Epicoccum и Phomatodes вероятно представляют 10 новых для науки видов. К семейству Phaeosphaeriaceae были отнесены 11 штаммов рода Paraphoma. Интерпретация полученных данных позволила предложить новую комбинацию (Paraphoma convolvuli) и описать новый для науки вид Paraphoma melnikii. Третье семейство (Cucurbitariaceae) было представлено одним штаммом Pyrenochaeta acicola. Проведен качественный и количественный анализ микобиоты зерна новых и уже зарекомендовавших себя сортов пшеницы и ячменя. Проанализировали 39 образцов зерна пшеницы и ячменя разных сортов из Краснодарского края и Ленинградской области. Анализ включал определение видового состава и зараженности зерна грибами (% зараженных зерен), оценку количества ДНК грибов Fusarium и определение контаминации зерна микотоксинами дезоксиниваленолом (ДОН) и Т-2 токсином. Зараженность зерна грибами рода Fusarium в Краснодарском крае составляла 2–36 %. Основным представителем фузариевых грибов был F. graminearum, также были выявлены F. sporotrichioides, F. tricinctum, F. incarnatum, F. equiseti и др. Количество ДНК группы видов Fusarium, продуцирующих трихотеценовые токсины, колебалось в диапазоне 0,14–0,42 пг/нг ДНК пшеницы. Микологический анализ зерна из Ленинградской области выявил высокую зараженность Fusarium spp. – 56–89 %. Значительная доля микобиоты была представлена видами, продуцирующими трихотеценовые микотоксины, в том числе F. graminearum и F. culmorum, что было подтверждено молекулярным анализом. Количество микотоксина ДОН было высоким (до 4471 мкг/кг). Сравнительный анализ загрязнения микотоксинами зерна двух культур показал, что в образцах пшеницы количество ДОН было достоверно выше, чем в образцах ячменя. Для Т-2 была характерна обратная зависимость. Комплексная характеристика сортов пшеницы и ячменя по совокупности проанализированных параметров позволила выделить один высокоустойчивый сорт озимой пшеницы и 4 сорта ячменя, относительно устойчивых как к заражению грибами Fusarium, так и к накоплению микотоксинов. Осуществлена молекулярная идентификация и изучение культуральных свойств 33 морфологических сходных штаммов Microdochium, выделенных из зерновых культур. С помощью видоспецифичной ПЦР было установлено, что из 33 анализированных штаммов 14 относятся к M. nivale, а 18 – к M. majus. Один штамм после секвенирования ITS-областей рДНК был определён как M. seminicola. Штаммы Microdochium sp. по внешнему виду колоний и скорости роста в широком диапазоне температуры не имели чётких отличий друг от друга. С помощью микологических методов и ПЦР в реальном времени определили органотропную специализацию видов Microdochium при заражении ими пшеницы. M. nivale и M. majus присутствовали во всех надземных органах растения. Первый вид в большем количестве выявлен в нижней части стебля, в то время как второй обнаруживался преимущественно в колосе и поражённых участках флаг-листа. Установлено присутствие гриба M. majus в стеблях и листьях проростков озимой пшеницы, выращенных из заражённых грибами рода Microdochium семян. Для изучения SNP полиморфизма в популяциях гриба Puccinia triticina было протестировано 11 молекулярных маркеров (SSR-локусов и ген RPB2). Оптимизирован протокол ПЦР и протокол очистки амплификата после секвенирующей ПЦР. После этого сравнили сами маркеры по информативности. В результате отобрано 7 стабильно амплифицирующихся полиморфных маркеров. Продолжены исследования внутривидовой изменчивости изолятов Puccinia triticina, полученных с ди-, тетра- и гексаплоидных видов пшеницы, по вирулентности и молекулярным маркерам. Изучено 218 монопустульных изолятов. Полученные результаты существенно дополнили ранее проведенный анализ субпопуляций P. triticina на разных видах пшеницы и эгилопсов в Дагестане, который относится к первичному генетическому центру происхождения пшеницы. Подтверждена существенная дифференциация изолятов P. triticina на видах-хозяевах разной плоидности. SSR маркеры оказались более нейтральными при анализе изученной коллекции изолятов. Результаты данной работы могут быть использованы в анализе дивергенции гриба P. triticina на разных видах и актуальны для интрогрессивной селекции пшеницы. Исполнителями проекта проведены экспедиционные сборы в Дагестане и Калининградской области. Собраны необходимые для работы образцы растений с симптомами заболеваний и получены изоляты гриба Puccinia triticina с разных видов пшеницы и эгилопс. Принято участие в работе 9 конференций и конгрессов, в т.ч. двух зарубежных, где сделаны инициативные и приглашённые доклады. Опубликовано 24 печатные работы, включая 9 статей в журналах, индексируемых в WoS и Scopus.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 г. проводилась работа по шести направлениям: (1) идентификация изолятов рода Colletotrichum, ассоциированных с сорными растениями; (2) ревизия таксономии рода Alternaria; (3) определение зараженности зерна из основных зерносеющих регионов России токсинопродуцирующими микромицетами; (4) ревизия трудно идентифицируемых изолятов грибов рода Fusarium; (5) выявление молекулярными методами внутривидового полиморфизма у гриба Puccinia triticina; (6) определение информативности ДНК-метабаркодинга для анализа патогенной и симбионтной микобиоты сельскохозяйственных растений. Была изучена микроморфология и культуральные свойства 21 «проблемного» изолята грибов рода Colletotrichum, выделенных из сорных растений. Для большинства этих изолятов секвенировано по три гена и реконструирована молекулярная филогения методом максимального правдоподобия (maximum likelihood) с использованием последовательностей референсных штаммов из базы данных GenBank. Изоляты формировали три крупные клады, которые соответствуют двум кладам рода: destructivum и dematium и группе видов C. coccodes. Для ряда изолятов уточнена видовая принадлежность. Два изолята формировали отдельную кладу, не включающую в свой состав референсных штаммов Colletotrichum, и, вероятно, являются представителями нового для науки вида. Морфологические описания изолятов в основном согласовывались с данными, полученными методами молекулярной филогении. Все выявленные виды ранее были обнаружены на территории России, но большинство наших находок сделаны для своих питающих растений впервые. Полностью завершена ревизия рода Alternaria, начатая несколько лет назад совместно с несколькими зарубежными коллективами. Проведён анализ номенклатурных баз данных Mycobank и IndexFungorum (около 700 записей в каждой) и литературы по таксономии Alternaria. Установлено, что на настоящий момент стоит говорить о 366 видах рода. Проведен анализ морфологических описаний 44 видов рода Alternaria (в широком смысле), которые имеют легитимные названия и считаются на данный момент идентифицируемыми по морфологии, но пока что не были включены в ревизию. В результате все эти виды были отнесены с какой-либо секции рода. Для приведения номенклатуры в соответствие современной системе рода Alternaria в 19 случаях были сделаны необходимые номенклатурные новации, которые были зарегистрированы в базе данных MycoBank. Описан новый вид Alternaria – A. kamtschatica. Проведен анализ зараженности грибами и контаминации микотоксинами 59 образцов зерна пшеницы и ячменя урожая 2017 г. из Поволжья, Западной Сибири и с Урала. Оценку состояния зерна пшеницы и ячменя проводили с использованием количественных показателей, характеризующих присутствие грибов в зерне: доля зараженных грибами зерновок (микологический анализ), содержание ДНК грибов (реал-тайм ПЦР) и количество микотоксинов грибов (ИФА). Кроме того, исследовали состав летучих органических соединений (ЛОС), продуцируемых тремя видами рода Microdochium (18 изолятов) с использованием хромато-масс-спектрометрии. Выявлен ряд широко распространённых видов, в т.ч. два вида Microdochium и 11 видов Fusarium. Впервые в Сибири выявлен вид F. globosum (третья находка в мире). Спектр ЛОС у видов M. nivale и M. majus был сходен, однако в спектре ЛОС штамма гриба M. semenicola было выявлено содержание некоторых сесквитерпенов: α- и γ-мууролена, β-гурьюнена и других, которые ранее для грибов Microdochium не описывались. Установлена положительная корреляция между результатами микологического и молекулярно-генетического анализов. Зараженность зерна грибом F. graminearum и содержание образуемых им метаболитов – ДОН и ЗЕН также имели статистически существенную связь. Корреляционный анализ выявил достоверную связь и между ДНК F. sporotrichioides и количеством Т-2 токсина. Установлено, что в Уральском и Западно-Сибирском регионах наибольшую опасность, с точки зрения потенциальной контаминации зерна микотоксинами, представляют F. sporotrichioides, образующий Т-2 и НТ-2 токсины, а также F. avenaceum и F. poae – продуценты монилиформина и ниваленола, соответственно. Проведена ревизия 31 изолята рода Fusarium, относящегося к группе видов Fusarium fujikuroi (FFSC), которая включает более 50 видов, в том числе продуцентов микотоксинов. Выборка состояла из изолятов разного происхождения, предварительно идентифицированных по морфологическим признакам как FFSC, и трёх типовых штаммов F. anthophilum, F. nygamai и F. phyllophilum. Для изолятов секвенировали ген фактора элонгации трансляции, определяли патогенные свойства и диапазон температуры, оптимальной для роста. Патогенные свойства оценивали в лабораторных условиях путем инокуляции отрезков листьев пшеницы двух сортов Безостая 100 и Васса, которые характеризуются различной относительной устойчивостью к фузариозу зерна. Оценку накопления биомассы изолятов проводили при температуре 10-40 °С. Установлено, что 23 изолята относились к виду F. proliferatum и по два – к видам F. verticillioides, F. globosum и F. fujikuroi. В среднем существенных различий по патогенности между изолятами трёх видов FFSC F. proliferatum, F. globosum и F. fujikuroi не выявлено. Однако среди изолятов F. proliferatum выявлены как слабо-, так и высокоагрессивные. Оптимум температуры для изолятов F. proliferatum, F. verticillioides и F. globosum, находился в диапазоне 20-25 ºС. Показано, что температуры 10 и 35 ºС были критическими для штаммов F. globosum, в то же время штаммы видов F. proliferatum и F. verticillioides способны к росту при таких условиях. Для SNP анализа внутривидового полиморфизма Puccinia triticina было использовано 30 изолятов из Дагестана, Новосибирской области и Казахстана с 14 ди-, тетра- и гексаплоидных видов-хозяев родов Aegilops и Triticum. Для осуществления SNP анализа были секвенированы три локуса ctg1-3, ctg5-1 и ctg84-1. Полученные для российских изолятов данные сравнили с представленными M. Liu с соавторами (2014). Филогенетическое дерево для мультилокусных последовательностей построено с помощью программы MrBayes v3.2, с использованием модели нуклеотидных замен GTR+G+I и генерации 1×10^6 марковских цепей методом Монте-Карло. Проведён анализ дифференциации популяций, предложены гипотезы, касающиеся филогенеза данного вида гриба. Комплексный анализ с использованием признака вирулентности и молекулярных маркеров разного типа позволил наиболее полно охарактеризовать генетическую изменчивость и микроэволюционные процессы в популяциях патогена. Для определения информативности ДНК-метабаркодинга была исследована микобиота, ассоциированная с корневой гнилью озимой пшеницы в Ленинградской области. Образцы были проанализированы как стандартными микологическими методами, так и с помощью высокоэффективного секвенирования. В результате классического анализа было получено более 300 изолятов, которые были идентифицированы посредством микроскопии и отнесены к 13 видам. Наиболее обильно представленным был фитопатоген Microdochium nivale. Использование указанных праймеров позволило в совокупности получить 81222 рида, отнесённых к грибам, из которых было сформировано 215 операционных таксономических единиц (ОТЕ), что примерно соответствует количеству видов. Набор выявленных ОТЕ был подвергнут таксономическому и экологическому анализу. Показано, что наибольшей встречаемостью в пробах характеризовались различные дрожжеподобные грибы, относящиеся как к Basidiomycota (Vishniacozyma victoriae, Dioszegia crocea, Leucosporidium golubevii, Holtermanniella sp.) и Ascomycota (Candida sp.). В значительном количестве были зарегистрированы фитопатогенные грибы Phaeosphaeria nodorum, Zymoseptoria tritici, Oculimacula yallundae, O. anguioides, Gibellulopsis nigrescens, Typhula incarnata, Tilletia sp. Из патогенов, потенциально способных вызывать корневые гнили, были выявлены Fusarium spp., Microdochium spp. и Rhizoctonia zeae. Для проведения подобных исследований можно рекомендовать праймеры 5.8S_Fun/ITS4_Fun (Taylor et al., 2016), которые позволяют выявлять максимально широкий диапазон таксонов грибов, и минимизировать влияние на анализ присутствия в пробе ДНК растений. Для идентификации большего разнообразия фитопатогенных грибов при использовании «классических» праймеров ITS3/ITS4 нами был сконструирован блокирующий праймер, предотвращающий амплификацию ITS-областей ДНК высших растений.