Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Водоплавающие птицы являются резервуаpaми для низкопатогенных вирусов гриппа птиц (LPAIV) в приpoде, и их мигpaция способствует циркуляции LPAIVs между гнездовьями в высоких шиpoтах и зимовками в более низких шиpoтах. Существует все больше доказательств, что перелетные птицы могут также быть непосредственно вовлечены в paспpoстpaнение высокопатогенного гриппа птиц (HPAIV), что было неднокpaтно подтверждено paспpoстpaнением вируca гриппа субтипов H5N1, H5N8, H5N6. Паpaллельное исследование перелетов диких птиц и филогеогpaфическое картогpaфиpoвание связей HPAIV - это два paзных подхода, которые в сочетании могут дать новый взгляд на poль диких птиц в paспpoстpaнении высокопатогенного гриппа Н5N1 и других высокопатогенных вирусов гриппа. Согласно данным международных платформ GISAID и GenBank, с 1961 по 2017 гг. на территории Российской Федерации от птиц выделялись вирусы гриппа типа А 44-х различных субтипов. Наиболее часто на территории Российской Федерации в популяциях птиц обнаруживались вирусы гриппа типа А субтипов H3Nx, H3N8, H4Nx, H4N6, H5N1, H5N8, H13N2, H13N6. На основе анализа нуклеотидных последовательностей, включенных в базу данных, разработаны праймеры для амплификации фрагментов сегментов генома, кодирующих HA и NA вирусов гриппа типа А, циркулирующих среди птиц (субтипы гемагглютинина H3, H4, H5, H13 и нейраминидазы N1, N2, N3, N6, N8). Совместно с иностранными коллегами проведено исследование 6091 образцов, собранных в 2007-2012 гг. на Дальнем Востоке России от 171 вида птиц, принадлежащих к 36 различным семействам. Выделено и охарактеризовано в общей сложности 40 штаммов вируса гриппа различных субтипов: H3, H4, H6, H10 и H11 субтипы гемагглютинина и N1, N2, N6 и N8 субтипы нейраминидазы в различных комбинациях. Наиболее широко распространенными были вирусы гриппа А субтипов H3N6, H3N8 и H6N6 (KA Sharshov , MV Sivay, VV Muzyka, SG Sayfutdinova, AYu Alekseev, Y Sakoda, T Saito, JA Runstadler, H Kida, AM Shestopalov. Avian influenza virus circulation in wild birds migrating along the East Asian-Australian Flyway in Russian Far East. Australian Veterinary Journal (2018 г.)). Регионы Сибири и Дальнего Востока находятся на пересечении пяти миграционных путей: Черноморского, Среднеземноморского, Восточноафриканского - Евроазиатского, Центрально-Азиатского и Восточноазиатского - Австралийского. Проведя анализ миграционных путей, оценив доступность потенциально интересных мест сбора материала, были выбраны регионы организации экспедиций – Приморский край (Ханкайский район, Хасанский район), Амурская область (Благовещенский район), Республика Тыва (окрестности озера Убсу-Нуур), Новосибирская область (Карасукский, Здвинский, Убинский районы). Собран материал (клоакальные мазки) от 22 видов птиц водно-болотной экологической группы, принадлежащих к 5 отрядам (гусеобразные, ржанкообразные, пеликанообразные, поганкообразные, журавлеобразные). Следует отметить, что наиболее широко представленный видовой состав птиц, отличался в разных районах. Все образцы были использованы для выделения вирусов. В результате было выявлено 87 изолятов гемагглютинирующего вируса, из которых 49 составили вирусы гриппа типа А. Образцы аллантоисной жидкости, в которых методом ПЦР был выявлен генетический материал вируса гриппа А, были использованы для формирования коллекции штаммов вируса гриппа А. В рамках исследования вирусных патогенов, циркулирующих среди диких перелетных птиц на Дальнем Востоке РФ, была определена нуклеотидная последовательность полного генома парамиксовируса 4 типа, изолированного на острове Тюлений от тонкоклювой кайры (Uria aalge) без клинических признаков заболевания. На данный момент штамм APMV-4 Uria_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015 является единственным, выделенным на территории Российской Федерации, штаммом парамиксовируса 4 типа для которого известна полная последовательность генома. Штамм Uria_aalge/Russia/Tyuleniy_Island/115/2015 характеризуется геномом стандартной длины, согласно результатам филогенетического анализа, относится к генотипу генотипу Ib, что соответствует кладе B по альтернативной классификации, которая разделяет парамиксовирусы 4 типа на 5 отдельных генотипов (A, B, C, D, E). Штамм обладает гемагглютинирующей активностью (128 ГАЕ на 50 мкл) и характеризуется высокой инфекционностью для куриных эмбрионов EID50=-7,8lg/ml, вирус является непатогенным или низкопатогенным для кур и цыплят (IVPI=0.0; ICPI=0.0). Вирус гриппа является удобной моделью для изучения круга хозяев и механизма преодоления межвидового барьера, поскольку его геном имеет фрагментарное строение, и вклад отдельных генов можно определить, используя метод реассортации или адаптации к различным экспериментальным животным. В лабораторных условиях нами была проведена направленная адаптация пандемического вируса гриппа к модельным животным (мышам линии BALB/c). Проведенные эксперименты на модельных животных с целью адаптации пандемического вируса гриппа A(H1N1)pdm09 позволили получить летальный для мышей штамм A/Russia/01-MA/2009, который показал схожие симптомы заболевания с таковыми при инфицировании высоко патогенным вирусом гриппа птиц А/H5N1, а именно пневмонию и острый респираторный дистресс синдром. Полученный адаптированный вариант охарактеризован как высоколетальный патоген, благодаря которому дополнена база данных молекулярных маркёров патогенности (Prokopyeva E., Romanovskaya A., Sharshov K., Sobolev I., Alekseev A., Durymanov A., Shestopalov A. Molecular determinants possibly involved in the adaptation of pandemic A(H1N1)09 influenza virus to a new host. Future Virology (2017 г.), 12(9),491–498). 08-09 сентября 2017 г. в ФГБНУ «НИИ экспериментальной и клинической медицины» состоялось III Российско-Японское Совещание «Медицинская орнитология в Азиатско-Тихоокеанском регионе». Участники Совещания обсудили современную эпизоотическую ситуацию по гриппу А птиц и другим инфекционным заболеваниям, связанным с мигрирующими дикими птицами, в Азиатско-Тихоокеанском регионе. Были согласованы планы ближайших мониторинговых исследований, протоколы полевых и молекулярно-вирусологических исследований, достигнута договорённость о признании сертификатов специалистов в области мечения (в том числе – спутникового) мигрирующих диких птиц (http://centercem.ru/nauchnaya_deyatelnost/konferencii/).

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Входе второго этапа Проекта проведены все запланированные работы и достигнуты ожидаемые результаты, основные из которых представлены ниже. 1. В соответствии с задачей была продолжена работа по изучению миграций диких птиц с помощью спутниковой телеметрии. Проведен обзор доступной информации о результатах работ по мечению птиц, главным образом водного и околоводного комплекса для дальнейшего анализа роли миграций в распространении современных вариантов вируса гриппа птиц. Получены данные спутникового трэкинга перелетных птиц, отмеченных на территориях РФ и Японии. Японской стороной в 2018 в рамках Проекта были установлены 10 передатчиков на крякву (Anas platyrhynchos). Три из помеченных особей не мигрировали и остались в районе мечения на территории Японии. Для остальных особей показана миграция в северные районы острова Сахалин (РФ) и северо-восточные районы Северной Кореи. Анализ результатов мечения продолжается. Российскими участниками проведена организационная работа и начато мечение диких птиц. В настоящее время (ноябрь-декабрь) передатчики находятся на месте установки в ДВФО и эти работы ведутся совместно с двумя организациями: Дальневосточным Федеральным университетом (Приморский край) и Институтом биологических проблем Севера ДВО РАН (о.Сахалин). 2. Собрана уникальная коллекция образцов биологического материала. В результате анализа данных, полученных в течение первого года выполнения проекта, были скорректированы места проведения экспедиций. Российские участники проекта собирали клоакальные мазки и другие образцы от птиц в местах гнездования диких птиц в Сибири и на Дальнем Востоке. Сбор проб осуществлялся от домашних и диких птиц во время весенних и осенних миграций на озерах Новосибирской области (Здвинский район - озеро Чаны, Карасукский район - озеро Кротовая Ляга), на озере Увс-Нуур (республика Тыва), в Хасанском районе и на озере Ханка (Приморский край), в южной части о. Сахалин. Целевые виды птиц, от которых были собраны образцы, принадлежали к 7 отрядам и имели разные пути перелета. Было принято решение о замене экспедиции в Амурскую область на сбор в Республике Бурятия и Сахалинской области в связи с природно-климатическими условиями полевого сезона 2017-2018 (поздний пролет мигрирующих целевых видов, более узкий временной промежуток миграции в связи с погодными условиями). Кроме того, был собран материал от домашних и синантропных птиц, в местах регистрации вспышек гриппа в Новосибирской, Амурской областях и Приморском крае (более 200 образцов). Результаты его исследования описаны ниже. Таким образом, в результате работ 2018 собран уникальный биологический материал от мигрирующих, синантропных и домашних птиц в Азиатской части РФ. Собрано более 1000 образцов. Задача выполнена полностью. 3. Впервые проведена молекулярно-биологическая характеристика вирусов гриппа птиц, выделенных от перелетных птиц в Японии и на Дальнем Востоке России. Впервые получены результаты сравнительного генетического и филогеографического анализа вирусов гриппа птиц, выделенных от перелетных птиц в Сибири и Японии. Проведен детальный анализ впервые выделенного на территории России вируса гриппа H9N2-субтипа гетотип G1 (G1-like) - штамм Amur-2018. Это один из наиболее значимых результатов проекта в 2018. Вирусы гриппа H9N2 получили широкое распространение в птицеводстве от Восточной Азии до Ближнего Востока, Европы и Южной Африки. Многочисленные генотипы циркулируют у домашних птиц материкового Китая с 1994 года и представляют собой наиболее распространенный субтип вирусов птичьего гриппа (AIV) в популяциях кур. Вирус H9N2 увеличивает свое генетическое разнообразие, подвергаясь частым реассортациям с другими вирусами гриппа, давая генетические реассортанты с HPAI, включая вирус H5N1. Несмотря на низкую патогенность в птицеводстве, документально подтвержденная прямая передача вируса H9N2 людям вызывает беспокойство по поводу пандемического потенциала вируса Amur-2018 был идентифицирован как субтип H9N2 по сиквенсу и рассматривался как вирус низкопатогенный LPAI с индексом внутривенной патогенности IVPI=0,0 для кур. Аминокислотная последовательность сайта протеолитического расщепления также соответствует низкопатогенным вариантам (PARSSR / GLF). BLAST анализ показал, что все 8 сегментов РНК штамма Amur-2018 принадлежат генотипу G1-like и имеют идентичность >99% с штаммами H9N2, выделенными в Израиле в 2006-2007 гг. Филогенетический анализ показал, что гемагглютинин и другие гены изолята Amur-2018 относятся к филогенетической группе G1-подобных H9N2 и кластеру вирусов H9N2, выявленных ранее на Ближнем Востоке и в Северной Африке. Важно, что Amur-2018 показал в BLAST высокое сходство с А/chicken/Israel/215/2007, который используется в качестве вакцинного штамма с 2008 года. В рамках Проекта была разработана гипотеза о возможном происхождении и источнике вируса. Мы рассматриваем три пути распространения вируса G1-подобного вируса H9N2 в Дальневосточном регионе, Россия. Первая связана с миграцией диких птиц, которая предположительно играет ключевую роль в появлении LPAIV, в частности H9N2. Экологически Дальневосточный регион связан с соседними регионами и странами миграцией диких птиц. Однако до недавнего времени в этом азиатском регионе России у диких птиц не было обнаружено вируса G1-подобного H9N2. После анализа информации, мы предполагаем низкую вероятность инвазии вируса H9N2 Amur-2018 с миграцией птиц. Второй возможный путь передачи - это транспортировка продуктов птицеводства (например, живой птицы, мяса или кормов) из пострадавших районов. Такие случаи действительно были задокументированы ранее для вируса H9N2 (Mase et al. 2007,). Кроме того, было известно о распространенности множественных генотипов H9N2 в соседнем материковом Китае (Guan et al., 1999; Wei et al., 2016). В этом исследовании мы выделили G1-подобный H9N2, содержащий все 8 сегментов, тесно связанных с штаммами Ближнего Востока (Израиль) и не имеющий филогенетических связей с азиатскими вирусами, изолированными в 2016-2017. Это может свидетельствовать о появлении вирусов типа " Amur-2018 " из Западного региона России. Третьим наиболее возможным путем является незаконное использование дешевых незарегистрированных вакцин частными фермерами в России. Эти вакцины могут быть недостаточно инактивированы, что приводит к распространению вируса. Незаконный импорт незарегистрированных вакцин был выявлен в некоторых странах после того, как антигенный дрейф полевых вирусов сделал существующие плохо подобранные вакцины менее эффективными. Незаконная вакцинация также описана в областях, где использование вакцин против птичьего гриппа запрещено.Это согласуется с высокой идентичностью вакцинных штаммов Амур-2018 и G1, используемых с 2008 года (израильский вакцинный штамм). Мы предполагаем дальнейшую циркуляцию вирусов H9N2 субтипа и их возможное распространение в другие регионы. Эти результаты подчеркивают важность эпиднадзора за вирусами гриппа в Азиатско-Тихоокеанском, а также контроля импортируемых продуктов птицеводства и вакцинации как потенциальных источников появления вируса гриппа H9N2. Впервые проведен сравнительный анализ вирусов гриппа птиц, выделенных от перелетных птиц в Сибири и Японии. Для изучения филогенетических связей штаммов вируса гриппа типа А, выделенных от птиц в России и Японии, были использованы полученные в ходе работы над проектом нуклеотидные последовательности сегментов генома вируса гриппа, кодирующих внутренние белки (PB2, PB1, PA, NP, MP, NS) вириона. Филогенетический анализ выявил наличие нескольких генетических кластеров, образованных как российскими и японскими штаммами по отдельности, так и совместно. Так, генетическое сходство по сегменту PB2 и принадлежность этих штаммов к различным субтипам указывают на распространение генетического материала вируса гриппа между Приморским регионом РФ и Японией, а также на реассортацию (обмен генетическим материалом) между вирусами гриппа типа А различных субтипов. Кроме того, в результате филогенетического анализа последовательностей сегмента NS было показано, что штаммы 2012, 2014 и 2017 гг., выделенные от птиц в Новосибирской области (озеро Чаны, Убинское озеро, Карасукский район), а также штамм A/pintail/Russia Primorje/222/2015 (H11N9) формируют общую филогенетическую группу со штаммами из Японии, Китая, Кореи и Монголии. При этом штамм A/pintail/Russia Primorje/222/2015 (H11N9) наиболее родственен Японским штаммам 2016 года, принадлежащим к субтипам H3N8 и H11N9. Прочие штаммы из Приморского региона A/gadwall/Russia Primorje/394/2016 (H1N1), A/teal/Russia Primorje/390/2016 (H1N1) и A/mallard/Russia Primorje/844/2017 (H4N6) относятся к иной филогенетической группе и схожи с японскими и китайскими штаммами 2014-2016 гг.. В целом, по структуре NS все использованные в анализе штаммы подразделяются на три основных филогенетических кластера с дальнейшим делением на подгруппы. Два кластера формируются главным образом из российских (сибирских и приморских) и японских штаммов, а в третий входят более ранние штаммы с Алтая и из Монголии, схожие со штаммами из Китая, Грузии, Германии и с Аляски. В результате секвенирования геномов как ранее выделенных изолятов вируса гриппа птиц, так и более современных были обнаружены варианты вируса, вероятно, находящиеся в процессе реассортации и содержащие по несколько одноименных сегментов генома. В частности, A/mallard/Chany/126K/2014 (H5N3) и A/mallard/Chany/126K-2/2014 (H8N4), представляющие собой одну вирусную популяцию, но содержащую два сегмента HA (H5 и H8), два сегмента NA (N3 и N4), а также два сегмента PA, филогенетически различных и входящих в две разные генетические группы дендрограммы. После трансляции нуклеотидных последовательностей сегментов генома, кодирующих внутренние белки, были получены аминокислотные последовательности, в которых был осуществлен поиск мутаций, оказывающих влияние на изменение биологических свойств вируса (в частности, патогенность и вирулентность). В белке PB2 известны несколько аминокислотных замен (D701N, E158G, T588I, E627K), приводящих к увеличению вирусопродукции, патогенности и трансмиссивности. В исследованных штаммах вируса гриппа птиц, выделенных на территории азиаткой части РФ, не было обнаружено мутаций D701N, E158G, T588I, а замена E627K (обуславливает повышение вирулентности и патогенности при инфицировании млекопитающих) была выявлена только в более ранних (2006 г.) штаммах высокопатогенного гриппа птиц H5N1 A/chicken/Reshoty/02/2006_PB2 и A/duck/Omsk/1822/2006. Аминокислотные замены, приводящие к росту патогенности и вирулентности, R185K, T97I, S224P (повышают активность полимеразного комплекса) в аминокислотных последовательностях PA, N319K в белке NP, F103L и M106I в NS1 российских штаммов вируса гриппа птиц также отсутствуют. В целом, в результате филогенетического исследования последовательностей сегментов «внутренних» белков генома вирусов гриппа типа А, выделенных от птиц в азиатской части РФ и в Японии было показано наличие широтного распространения вируса гриппа птиц в Тихоокеанском регионе (в частности, между Россией, Японией, Кореей и Китаем). Обилие субтипов и паттерны распределения штаммов по филогенетическим группам в зависимости от анализируемого сегмента генома указывают на процессы реассортации, что создает возможность появления все новых вариантов вируса, в т.ч. высокопатогенных. Генетическое сходство штаммов, выделенных в Азиатской части РФ со штаммами из Китая, Европы, США (Аляска), Африки указывает на широчайший ареал распространения вируса гриппа птиц из и через исследуемый регион. Эти результаты непосредственно связаны с тематикой и задачами проекта и позволят эффективно реализовать финальную часть проекта. 4. По результатам второго этапа сформирована Коллекция изолятов и охарактеризованных штаммов вирусов гриппа и парамиксовирусов (целесообразность их изучения очевидна по результатам первого года). 5. Получены данные о последовательностях митохондриальной ДНК птиц для отработки методики установления таксономической принадлежности и происхождения перелетных птиц, обеспечивающих распространение вируса гриппа (определен полный митохондриом 10 особей одного вида нырковых уток - Oxyura leucocephalа. В настоящее время проводится анализ последовательностей. 6. Оптимизированы праймеры и зонды для дальнейшей работы. 7. Получены результаты экспериментов на животных для выявления мутаций, влияющих на патогенность и адаптацию вируса гриппа птиц к новым хозяевам. Изоляты, выбранные в результате генетического анализа, описанного выше, использованы в экспериментах на животных. Получена панель сывороток к новым штаммам вируса гриппа. Мыши использованы как модель для адаптации вируса гриппа птиц к организму млекопитающих для выявления аминокислотных замен, ответственных за адаптацию к новому виду хозяев. Результаты этого раздела представлены выше, а также включены в три публикации Scopus (см. список публикаций). Получены результаты сравнительных гистопатологических исследований, определение летальности для мышей и накопления вируса в органах экспериментальных животных. 8. Все значимые результаты проекта представлены на многочисленных конференциях, а также согласно плану подготовлены, опубликованы или направлены в печать статьи (в том числе Q1). В целом, результаты двух лет способствуют лучшему пониманию экосистемы Сибири в качестве очага распространения вируса, а также к созданию системы раннего предупреждения появления потенциально опасного вируса гриппа птиц на пути в Приморский край, Японию, Китай, Европу и Северную Америку. Выявление мутаций генома, которые способствуют трансмиссии вируса гриппа от диких птиц домашней птице, будет способствовать оценке возможности вируса к адаптации и распространению в популяциях птиц. Поскольку некоторые вирусы гриппа птиц, в том числе высокопатогенные, представляют потенциальную опасность для человека, результаты этого проекта также будут полезны для системы здравоохранения в Евразии с целью предупреждение распространения зоонозных инфекций в системе человек-животные. Результаты будут способствовать развитию российско-японской интеграции в создании новых технологий и стратегии по борьбе с высокопатогенным птичьим гриппом. Таким образом, получены все запланированные результаты, которые могут быть эффективно применены для улучшения мер по борьбе с высокопатогенным гриппом птиц в Приморском крае и в Японии и, в целом, в Тихоокеанском регионе путем создания системы мониторинга, а также усовершенствования методов профилактики и диагностики.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Входе третьего этапа Проекта проведены все запланированные работы и достигнуты ожидаемые результаты, основные из которых представлены ниже. 1. В соответствии с задачей была продолжена работа по изучению миграций диких птиц с помощью спутниковой телеметрии. Проведен обзор доступной информации о результатах работ по мечению птиц, главным образом водного и околоводного комплекса для дальнейшего анализа роли миграций в распространении современных вариантов вируса гриппа птиц. Получены данные спутникового трэкинга перелетных птиц, отмеченных на территориях РФ и Японии. Российскими участниками были проведены работы по установке передатчиков в 4 локациях: дельта р. Лена (Северная Якутия), Якутский городской округ (Центральная Якутия), Чукотка (район Марково) и Сахалин (залив Одопту). В дельте Лены на территории Усть-Ленского заповедника помечено 14 черных казарок. Две особи кряквы помечены в Центральной Якутии. На Чукотском полуострове и острове Сахалин было проведено мечение 5 особей чирка – свистунка спутниковыми передатчиками Microwave Telemetry. Получены первые данные по локальным перемещениям осенью(Онлайн приложение). Перелеты птиц с датчиками контролируются японской группой с помощью GPS-GSMнавигации. Полученные данные использованы для выяснения способа, с помощью которого высокопатогенный вирус гриппа птиц может проникнуть в Приморье и Японию, представляя опасность для птицеводства в обоих регионах. Получены все запланированные результаты (Онлайн приложение). Обосновано использование в системе прогнозирования распространения вируса гриппа. 2. Собрана уникальная коллекция образцов биологического материала. Из образцов, собранных во время весенней миграции птиц, не было выделено ни одного изолята вируса. Аналогичная картина наблюдалась и в предыдущие два года выполнения Проекта. Из 1098 образцов, собранных на территории России от диких птиц в период осенней миграции, было выделено 96 изолятов, положительных в РГА. Таким образом, в среднем процент выделения гемагглютинирующих вирусов составил 8,7%. Вместе с тем, уровень выделения вирусов отличался для образцов, собранных в разных регионах, что может быть связано с видовым составом птиц, от которых был собран материал. Так, наименьший уровень выделения вирусов наблюдался из проб, собранных в республике Тыва (2,9%), где 48,5% образцов получено от серебристой чайки (отряд Ржанкообразные) и 37,1% образцов собрано от черного коршуна (отряд Ястребообразные). Наибольший процент выделения вирусов отмечался из проб, полученных из Сахалинской (15,2%) и Амурской (21,8%) областей, где 56,5% и 43,7% образцов собрано от чирка-свистунка (отряд Гусеобразные), соответственно. От птиц данного вида традиционно выделяется наибольшее количество вирусов гриппа и парамиксовирусов птиц. 3. В рамках выполнения Проекта создана уникальная Коллекция вирусов гриппа типа А и парамиксовирусов. Из общей коллекции 30 штаммов были приняты в Государственную коллекцию возбудителей вирусных инфекций и риккетсиозов ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора на патентное депонирование (таблица 10). Заполнены детальные паспорта с информацией о вирусологических и молекулярно-биологических характеристиках. Эта информация была использвана при написании статей WOS. В частности, была исследована морфология вирионов высокопатогенного вируса H5N8 (рисунок, онлайн приложение). Штаммы Коллекции могут быть использованы в медицине, ветеринарии и микробиологии для диагностики вируса гриппа методами РТГА и ПЦР, исследования эффективности вакцин и противовирусных препаратов in vitro и in vivo. Возможно внедрение в практическую работу по оценке иммуногенных и профилактических свойств вакцин против гриппа; в качестве референс-штаммов при проведении диагностических работ методом ПЦР; для оценки эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа в ходе разработки средств и методов лечения и профилактики гриппа, разработки средств и методов индикации вируса гриппа. Для дальнейшего использования штаммов запланировано оформление результатов интеллектуальной деятельности, касающихся штаммов вируса, которые в дальнейшем могут быть поданы в качестве заявки на изобретение. Возможна коммерциализация результатов интеллектуальной деятельности 4. Впервые получены последовательности полного митохондриома 10 особей Oxyura leucocephala, собранных на территории Западной Сибири и приграничных районов Казахстана. 10 геномов варьировали по размеру 16,541-16,544 bp, эти митохондриальные геномы включают 13 генов, кодирующих белок (PCGs), 22 гена т-РНК (tRNA), 2 гена рибосомальной РНК (rRNA) и 1 некодирующую область-область D-петли (D-loop region). Все PCGs начинаютс с ATG, за исключением COX1, COX2, ND5 (GTG) и ND6 (CTA). Эти гены имели пять типов терминальных кодонов, включая TAA, TAG, AGG, AGA и неполный терминальный кодон "T". Среди 13 генов, кодирующих белок, самым длинным был ген ND5 (1839bp), который был расположен между Trna Leu и Cytb, а самым коротким-ген ATPase8 (168bp), который был расположен между tRNA Lys и ATPase6. Мы обнаружили один контролирующий регион (D-петли) между tRNA Lys and ATPase6. Область D-петли составляет 981bp в длину. Общий состав мтДНК оценивался как 28,7% для А, 22,4% для Т, 32,8% для С и 16,1% для G. Построены предварительные филогенетические дендрограммы. В настоящее время продолжается молекулярно-биологический и филогенетический анализ последовательностей, подготовлен драфт статьи, которая будет опубликована в журнале Mitochondrial DNA со ссылкой на грант в 2020. 5. Впервые проведена молекулярно-биологическая характеристика вирусов гриппа птиц, выделенных от перелетных птиц в Японии и на Дальнем Востоке России. Впервые получены результаты сравнительного генетического и филогеографического анализа вирусов гриппа птиц, выделенных от перелетных птиц в Сибири и Японии. Финальные дендрограммы представлены в итоговом отчете – онлайн приложении. Для изучения филогенетических связей штаммов вируса гриппа типа А, выделенных от птиц в России и Японии, были использованы полученные в ходе работы над проектом нуклеотидные последовательности сегментов генома вируса гриппа, кодирующих внутренние белки (PB2, PB1, PA, NP, MP, NS) вириона Большинство исследованных штаммов выделены на территории Новосибирской области. Кроме того, были исследованы штаммы из Дагестана и из Якутии. При этом, штаммы, изолированные одновременно и в одном регионе генетически различны и формируют филогенетические группы с различным окружением. Генетическое разнообразие выделенных на территории РФ штаммов, позволяет, зависимости от рассматриваемого сегмента генома разделить их на несколько филогенетических групп: 6 по РВ2, 6 по РВ1, 8 по РА, 7 по NP, 6 по MP и 8 по NS. При этом, в отдельные филогенетические группы входит ряд схожих штаммов и из Новосибирской области, и из Дагестана, и из Якутии. Таким образом, на обширной территории РФ, в различных регионах были обнаружены штаммы вируса гриппа с филогенетически близкородственными сегментами генома. Несмотря на генетическое разнообразие исследованного пула выделенных на территории РФ штаммов вируса гриппа птиц, все они, формируя различные филогенетические группы, схожи со штаммами, изолированными в регионах, через которые проходит Восточноазиатский-Австралийский пролетный путь (Монголия, Китай, Корея, Япония). При этом большинство исследованных штаммов (до 27 из 30, в зависимости от сегмента) в пределах своих филогенетических групп родственны штаммам из Западной Европы (Бельгия, Швеция, Нидерланды), Южной Азии (Бангладеш) и Северо-Восточной Африки (Египет). Таким образом, выделенные филогенетические группы охватывают всю Евразию. Кроме того, несколько штаммов характеризуются сходством только с вариантами вируса гриппа, обнаруженными в Восточной Азии: штамм из Бурятии подобен штаммам из Монголии и Китая, а штамм из Якутии – штаммам из Китая, Кореи и Японии. При этом эти два штамма и их окружение филогенетически различны. Таким образом, выявлены штаммы, для которых на данный момент известны филогенетически близкие варианты, обнаруженные исключительно в отдельном регионе, через который проходит Восточноазиатский-Австралийский пролетный путь. Отдельно был изучен вирус гриппа Н12 субтипа. Поскольку подтип H12 редко обнаруживается у диких птиц, в этом исследовании мы изучили биологические характеристики и провели полногеномный анализ пяти вирусов H12N5 и одного вируса H12N2 и провели сравнение с данными базы GISAID с точки зрения эволюционной экологии вирусов гриппа птиц в Северной Евразии. Полученные данные дополняют наши знания об экологии редких субтипов ВГА. Кроме того, мы провели оценку патогенного риска этих вариантов с точки зрения их потенциальной угрозы для человека. H12N2 из Дальневосточного региона оказался двойным реассортантом, содержащим сегменты HA, NS и NP американской линии, и остальные сегменты из классической евразийской avian-like линии. Вирусы H12N5 содержали сегменты евразийской линии. Мы предложили филогеографическую схему событий реассортации, связанных с географическими группами водных птиц и их миграционными пролетами. Вирус H12N2 представляет особый интерес, так как этот подтип был обнаружен у чирка-свистунка в российском регионе Дальнего Востока, и он тесно связан с североамериканскими линиями ВГА и ясно демонстрирует, что вирусный обмен между двумя континентами действительно имеет место. В целом, в результате филогенетического исследования последовательностей сегментов «внутренних» белков генома вирусов гриппа типа А, выделенных от птиц в азиатской части РФ и в Японии было показано наличие широтного распространения вируса гриппа птиц в Тихоокеанском регионе (в частности, между Россией, Японией, Кореей и Китаем). Обилие субтипов и паттерны распределения штаммов по филогенетическим группам в зависимости от анализируемого сегмента генома указывают на процессы реассортации, что создает возможность появления все новых вариантов вируса, в т.ч. высокопатогенных. Генетическое сходство штаммов, выделенных в Азиатской части РФ со штаммами из Китая, Европы, США (Аляска), Африки указывает на широчайший ареал распространения вируса гриппа птиц и миграции через исследуемый регион. Эти результаты непосредственно связаны с тематикой и задачами проекта и позволяют эффективно реализовать основную задачу проекта. 6. Оптимизированы праймеры и зонды для использования в мониторинге и ранней диагностике гриппа. 7. Получены результаты экспериментов на животных для выявления мутаций, влияющих на патогенность и адаптацию вируса гриппа птиц к новым хозяевам. Изоляты, выбранные в результате генетического анализа, описанного выше, использованы в экспериментах на животных. Получена панель сывороток к новым штаммам вируса гриппа. Мыши использованы как модель для адаптации вируса гриппа птиц к организму млекопитающих для выявления аминокислотных замен, ответственных за адаптацию к новому виду хозяев. Результаты этого раздела представлены выше, а также включены в три публикации Scopus (см. список публикаций). Получены результаты сравнительных гистопатологических исследований, определения летальности для мышей и накопления вируса в органах экспериментальных животных. 8. Все значимые результаты проекта представлены на многочисленных конференциях, а также согласно плану подготовлены и опубликованы статьи (в том числе Q1). В целом, результаты трех лет способствуют лучшему пониманию экосистемы Сибири в качестве очага распространения вируса, а также к созданию системы раннего предупреждения появления потенциально опасного вируса гриппа птиц на пути в Приморский край, Японию, Китай, Европу и Северную Америку. Выявление мутаций генома, которые способствуют трансмиссии вируса гриппа от диких птиц домашней птице, будет способствовать оценке возможности вируса к адаптации и распространению в популяциях птиц. Поскольку некоторые вирусы гриппа птиц, в том числе высокопатогенные, представляют потенциальную опасность для человека, результаты этого проекта также будут полезны для системы здравоохранения в Евразии с целью предупреждение распространения зоонозных инфекций в системе человек-животные. Результаты будут способствовать развитию российско-японской интеграции в создании новых технологий и стратегии по борьбе с высокопатогенным птичьим гриппом. Таким образом, получены все запланированные результаты, которые могут быть эффективно применены для улучшения мер по борьбе с высокопатогенным гриппом птиц в Приморском крае и в Японии и, в целом, в Тихоокеанском регионе путем создания системы мониторинга, а также усовершенствования методов профилактики и диагностики.