КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-44-07002

НазваниеБезводное хранение биологического материала с применением защитных белков ангидробиотического насекомого

РуководительШагимарданова Елена Ильясовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан

Года выполнения при поддержке РНФ2017 - 2019

КонкурсКонкурс 2017 года на получение грантов Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований международными научными коллективами» (совместно с Министерством сельского, лесного и рыбного хозяйства Японии - MAFF/AFFRCS)

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые словаАнгидробиоз, сухое хранение полимераз, клетки и антитела, геномное редактирование CRISPR-Cas9, ангидробиотическая хирономида, обезвоживание, LEA белки, Sf9 клетки, определение конформации хромосом

Код ГРНТИ34.15.61


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект направлен на разработку методов безводного хранения биоматериалов используемых в биомедицине и сельском хозяйстве. Будут использованы защитные белки из ангидробиотического насекомого Polypedilum vanderplanki, для направленного повышения устойчивости модельных клеток насекомых, антител и белков, активно использующихся в биотехнологии и сельском хозяйстве к замораживанию и обезвоживанию. Реализация проекта будет осуществляться в тесном сотрудничестве с исследовательской группой Японии и будет включать два основных этапа. На первом этапе проекта методами омиксного анализа будет определен оптимальный набор защитных белков ангидробиотической хирономиды (P. vanderplanki). Метод геномного редактирования CRISP/Cas9 будет оптимизирован для использования в клеточной культуре Pv11, полученной из эмбриональной массы хирономиды. Влияние “выключения” ключевых защитных белков на способность клеток Pv11 к ангидробиозу и сохранению активности рекомбинантных белков будет проанализирован с использованием рекомбинантного флюоресцентного белка, экспрессируемого в клетках. Таким образом будет проанализирован эффект нокдауна LEA белков, специфичных для хирономиды антиоксидантов, а также группы изоаспартил-метилтрасфераз найденных только в этом виде животных. Дополнительно будет исследована внутриклеточная локализация рекомбинантных LEA белков, находящихся под контролем ранее идентифицированного промотора, в клетках хирономиды и в модельных клетках других насекомых, в частности Sf9 (Spodoptera). Кроме того, с использованием метода определения конформации хромосом (Hi-C) будет идентифицирована ко-локализация кандидатных защитных белков в топологически ассоциированных доменах (ТАД) в геноме и их регуляция в ответ на обезвоживание. На основе сопоставления полученных данных с детальным профилем экспрессии генов в ответ на обезвоживание будет выделен наиболее перспективный набор кандидатных защитных белков для in vitro экспериментов. На втором этапе проекта, данные белки будут использованы в in vivo (экспрессия рекомбинантных белков в клеточной линии Sf9 в комбинации с воздействием трегалозы), а также in vitro (с использованием модельных ДНК полимераз и антител) экспериментах. Эффект защитных белков из хирономиды P. vanderplanki в комбинации с трегалозой будет использован для повышения стабильности модельных клеток и белков при обезвоживании и заморозке с целью разработки методов энергосберегающего длительного хранения биоматериалов в условиях сельскохозяйственных и медицинских биобанков.

Ожидаемые результаты
Российская и японская исследовательские группы будут работать в комплементарном режиме, для достижения ряда ключевых целей в ходе реализации проекта. Первая часть проекта будет сконцентрирована на исследовании фундаментальных механизмов ангидробиоза в хирономиде и разработке прикладных методов для функционального анализа защитных белков и их генов. Ожидаемые результаты будут включать в себя: 1. Создание обновленной сборки генома хирономиды и получение детальной карты генома. Создание новой аннотации генома с использованием новых данных по малым РНК и некодирующих РНК. 2. Характеристика пространственной организации хроматина в клетках Pv11 в нормальных условиях и при обезвоживании. Будут идентифицированы топологически ассоциированные домены (ТАДы) и локализация в них ключевых для ангидробиоза групп генов-паралогов (anhydrobiosis-associated islands). 3. Оптимизация методики редактирования генома на основе CRISP/Cas9 для клеточной культуры Pv11 и целевой анализ эффекта нокаутирования ключевых защитных генов (кандидатов на эксперименты in vitro ) на способность клеток выживать при обезвоживании и при этом сохранять активность рекомбинантых белков (в частности люциферазы). 4. Характеристика внутриклеточной локализации защитных рекомбинантных LEA белков в клетках хирономиды Pv11 и в клетках других насекомых. Все результаты представляют фунтаментальный научный интерес, так как исследования такого уровня для сложноорганизованных ангидробиот не проводились. В то же время, полученные результаты станут основой второго - прикладного - этапа проекта, ориентированного на разработку методик непосредственного использования белков хирономиды для повышения стабильности биоматериалов при их длительном хранении: 5. Комбинированием эффекта рекомбинантных защитных белков хирономиды и трегалозы предполагается повышение стабильности и жизнеспособности клеточной линии Sf9 (активно использующейся в биотехнологии для производства рекомбинантных белков) при умеренной заморозке и обезвоживании с последующим хранением. 6. Будут разработаны методики сохранения активности чувствительных к обезвоживанию рекомбинантных ДНК полимераз (включая Aac, активно использующейся в генодиагностике) и антител при сухом хранении на основе внутриклеточного синтеза (в клетках Pv11) и in vitro. Таким образом, выполение проекта сделает значительный вклад как в понимание фундаментальных основ ангидробиоза, так и в развитие научно-технической платформы для методик полностью безводного хранения чувствительных к обезвоживанию клеток и белков, без потери жизнеспособности и активности.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект выполняется совместно с коллегами из Национального института агробиологических наук, Цукуба, Япония и направлен на изучение возможности безводного хранения биологического материала с применением защитных белков ангидробиотической хирономиды P. vanderplanki. Это насекомое представляет собой пример самого высокоорганизованного живого существа, способного переживать полное обезвоживание в течение чрезвычайно длительного времени. За годы исследования этого феномена были обнаружены белки и гены, их кодирующие, отвечающие за такую феноменальную устойчивость. Выполнение данного проекта – попытка использовать полученные фундаментальные знания о механизмах устойчивости для создания нового биотехнологического подхода. При этом, параллельно также решаются и задачи фундаментальной науки. За период работы в 2017 году была значительно улучшена сборка генома хирономиды за счет интеграции данных секвенирования геномной ДНК культуры клеток Pv11, полученных с использованием технологий Illumina и длинных прочтений на платформе PacBio, а также привлечения данных секвенирования РНК на разных стадиях обезвоживания. Это, во-первых, позволило исправить ряд ошибок при характеристике генов ответа на стресс обезвоживания (в частности белков теплового шока). Во-вторых, улучшить аннотацию генов, что важно, для детальной характеристики особенностей генома и, как следствие, выяснения механизмов адаптации к полной потере воды. Выполнение этой задачи позволит применить технологию Hi-C для оценки пространственной организации хроматина в нормальных условиях и при моделировании обезвоживания. Поскольку клетки Pv11 являются немодельным объектом, на данном этапе был отработан протокол Hi-C и проведена его оптимизация, что позволит полноценно провести этот анализ на следующих этапах выполнения Проекта. Другой задачей исследования являлось получения данных секвенирования для анализа вовлеченности малых и некодирующих РНК в ангидробиоз у P. vanderplanki. Для этого, с использованием признанной модели ангидробиоза, культуры клеток ангидробиотического насекомого Pv11 выделяли РНК, получали библиотеки в нормальных условиях и после добавления трегалозы к среде. Ранее было показано, что закономерности экспрессии генов после добавления трегалозы к культуре клеток Pv11 схожи с экспрессионным ответом в личинках. Полученные данные также будут анализироваться на следующих этапах выполнения Проекта. С точки зрения прикладной науки, были получены генетические конструкции, несущие в себе последовательность одного их гена Lea-белков. Были отработаны протоколы трансфекции этих конструкции в культуру клеток Pv11 и Sf9. Это очень важный шаг для последующей оценки улучшения выживаемости клеток при гиперэкспрессии защитных белков в клетках. Кроме того, это позволит провести оценку внутриклеточной локализации Lea-белков и приблизиться к уточнению их функций.

 

Публикации

1. - Таланты насекомых. У иных козявок людям стоит поучиться живучести газета Поиск, Поиск. Наука, №41 (2017) (год публикации - ).

2. Несмелов А.А., Шагимарданова Е.И., Кикавада Т., Гусев О.А. Involvement of Heat Shock Proteins in Invertebrate Anhydrobiosis Heat Shock Proteins in Stress, Springer, Dordrecht, Netherlands, - (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Хирономида P.vanderplanki является уникальным организмом, представителем класса насекомых, способным выживать при полной потере воды. Применение омиксных технологий позволило приоткрыть завесу тайны молекулярных механизмов, обеспечивающих индукцию состояния ангидробиоза, при котором метаболические процессы в клетках животного не фиксируются. В рамках выполнения проекта за текущий год был проведен анализ результатов данных, полученных с помощью метода Hi-C, что позволило значительно улучшить сборку генома хирономиды до уровня хромосом. Эта версия геномной сборки на сегодняшний день является самой полной для P.vanderplanki и оптимальной для использования при анализе транскриптомных данных. Также эта сборка легла в основу новой базы данных Midgebase 2.0, которую создали на платформе zenbu (http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/). Также в браузер zenbu добавленные все имеющиеся данные по секвенированию РНК-библиотек, CAGE-библиотек, в будущем возможно добавлять любые новые данные. Эта платформа является очень удобной для анализа данных и визуализации в интерактивном режиме и позволяет проводить исследование экспрессии генов на разных этапах жизненного цикла хирономиды или в цикле обезвоживания. Детальный анализ длинных некодирующих РНК выявил целый ряд кандидатов, которые могут играть важную роль в процессе ангидробиоза. Эксперименты с культурой клеток позволили разделить все белки группы Lea, которые, как известно, являются ключевым участником процесса ангидробиоза на группы, согласно их локализации. Это позволяет приблизиться к пониманию функции каждого отдельного представителя семейства Lea белков в клетках ангидробиотической хирономиды.

 

Публикации

1. Мазин П.В., Шагимарданова Е.И., Козлова О.С., Черкассов А.В., Сутормин Р., Степанова В.В., Ступников А., Логачева М.Д., Пенин А.А., Согаме Й., Корнетт Р., Токумото С., Мията Й., Кикавада Т., Гельфанд М.С., Гусев О.А. Cooption of heat shock regulatory system for anhydrobiosis in the sleeping chironomid Polypedilum vanderplanki Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, №10, V.115, P: E2477–E2486 (год публикации - 2018).

2. Несмелов А.А., Воронина Т., Кондратьева С.А., Шагимарданова Е.И. Localization of LEA proteins in the cells of anhydrobiotic insect Febs Open Bio, Том: 8 Стр.: 292-292 Приложение: 1 Аннотация к встрече: P.09-265-M (год публикации - 2018).

3. Несмелов А.А., Шагимарданова Е.И., Кикавада Т., Гусев О.А. Involvement of Heat Shock Proteins in Invertebrate Anhydrobiosis Heat Shock Proteins and Stress. Heat Shock Proteins. Springer, Cham, In: Asea A., Kaur P. (eds) Heat Shock Proteins and Stress. Heat Shock Proteins, vol 15.P.179-192 (год публикации - 2018).

4. Черкасов А.В., Рябова А.В., Батуллин Н., Ананьева А.В., Гусев О.А., Шагимарданова Е.И. Three-dimensional organization of genome of sleeping chironomid Polypedilum vanderplanki Febs Open Bio, Том: 8 Стр.: 136-136 Приложение: 1 Аннотация к встрече: P.02-018-W (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На данном этапе проекта нами были проанализировано внутриклеточное распространение защитных белков LEA как в клетках хирономиды, так и при их экзогенной экспрессии в модельных клетках насекомых Sf9. Мы обнаружили, что внутриклеточная локализация белков не является консервативной в ряде случаев, что необходимо учитывать при генно-инженерных работах с использованием защитных белков хирономиды. В то же время, значительное количество LEA белков сохраняли внутриклеточную локализацию вне зависимости от типа клеток, что открывает возможности планирования специфичной защиты отдельных клеточных органелл от обезвоживания. Также мы охарактеризовали новую необычную группу белков хирономидч, происхождение которых связано с классическими LEA белками, но структурно отличными от них. Это мембранные белки (Lea island located, Lil), характеризующиеся повышением экспрессии при обезвоживании, что указывает на их роль в ангидробиозе P. vanderplanki. Эти гены являются орфанными и не было обнаружено ортологов в других видах живых, включая двукрылых насекомых к которым относятся хирономиды. Таким образом можно утверждать, что мы обнаружили новую группу белков специфично взаимодействующих с мембранами клеток при обезвоживании. Тем не менее, экспрессия отдельно рекомбинантных LEA и Lil белков не приводила к повышению устойчивости модельных клеток Sf9, что свидетельствует о том что, для формирования защитного молекулярного щита в клетке необходимо синергетическая активность различных групп белков хирономиды. Нами также были проанализированы некодирующие длинные и малые РНК хирономиды и определены те из них, которые связаны в своей транскрипционной активности с генами активно вовлеченными а ангидробиоз. Стоит отметить, что основная масса некодирующих РНК связанных с ангидробиозом располагалась в определенном участке генома - на четвертой хромосоме, там же где и другие уникальные гены хирономиды связанные с толерантностью к обезвоживанию.

 

Публикации

1. Воронина Т.А., Несмелов А.А., Кондратьева С.А., Девятияров Р.М., Мията Ю., Токумото Ш., Корнетт Р., Гусев О.А., Кикавада Т., Шагимарданова Е.И. LEA-like, but not really: new group of transmembrane proteins associated with desiccation in anhydrobiotic midge Polypedilum vanderplanki Scientific Reports, - (год публикации - 2020).

2. Кондратьева С.А., Несмелов А.А., Черкассов А.В., Мията Ю., Токумото Ш., Кикавада Т., Гусев О.А., Шагимарданова Е.И. Intracellular localization and gene expression analysis provide new insights on LEA proteins’ diversity in anhydrobiotic midge PLOS ONE, - (год публикации - 2019).

3. Мията Й., Токумото Ш., Девятияров Р.М., Корнетт Р., Гусев О.А., Шагимарданова Е.И., Сакурай М., Кикавада Т. Identification of a novel strong promoter from the anhydrobiotic midge, Polypedilum vanderplanki, with conserved function in various insect cell lines SCIENTIFIC REPORTS, Volume 9, Номер статьи 7004 (год публикации - 2019).

4. Рябова А.В., Корнетт Р., Черкасов А.В., Ватанабе М., Окуда Т., Шагимарданова Е.И., Кикавада Т., Гусев О.А. Combined metabolome and transcriptome analysis reveal new key components of complete 5 desiccation tolerance in anhydrobiotic insect eLife, - (год публикации - 2020).

5. Ямада Т., Хики Ю., Хирои Н., Шагимарданова Е.И., Гусев О.А., Корнетт Р., Кикавада Т., Фунахаши А. Identification of a master transcription factor and a regulatory mechanism for desiccation tolerance in the anhydrobiotic cell line Pv11 PLOS ONE, - (год публикации - 2020).