Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проект выполняется совместно с коллегами из Национального института агробиологических наук, Цукуба, Япония и направлен на изучение возможности безводного хранения биологического материала с применением защитных белков ангидробиотической хирономиды P. vanderplanki. Это насекомое представляет собой пример самого высокоорганизованного живого существа, способного переживать полное обезвоживание в течение чрезвычайно длительного времени. За годы исследования этого феномена были обнаружены белки и гены, их кодирующие, отвечающие за такую феноменальную устойчивость. Выполнение данного проекта – попытка использовать полученные фундаментальные знания о механизмах устойчивости для создания нового биотехнологического подхода. При этом, параллельно также решаются и задачи фундаментальной науки. За период работы в 2017 году была значительно улучшена сборка генома хирономиды за счет интеграции данных секвенирования геномной ДНК культуры клеток Pv11, полученных с использованием технологий Illumina и длинных прочтений на платформе PacBio, а также привлечения данных секвенирования РНК на разных стадиях обезвоживания. Это, во-первых, позволило исправить ряд ошибок при характеристике генов ответа на стресс обезвоживания (в частности белков теплового шока). Во-вторых, улучшить аннотацию генов, что важно, для детальной характеристики особенностей генома и, как следствие, выяснения механизмов адаптации к полной потере воды. Выполнение этой задачи позволит применить технологию Hi-C для оценки пространственной организации хроматина в нормальных условиях и при моделировании обезвоживания. Поскольку клетки Pv11 являются немодельным объектом, на данном этапе был отработан протокол Hi-C и проведена его оптимизация, что позволит полноценно провести этот анализ на следующих этапах выполнения Проекта. Другой задачей исследования являлось получения данных секвенирования для анализа вовлеченности малых и некодирующих РНК в ангидробиоз у P. vanderplanki. Для этого, с использованием признанной модели ангидробиоза, культуры клеток ангидробиотического насекомого Pv11 выделяли РНК, получали библиотеки в нормальных условиях и после добавления трегалозы к среде. Ранее было показано, что закономерности экспрессии генов после добавления трегалозы к культуре клеток Pv11 схожи с экспрессионным ответом в личинках. Полученные данные также будут анализироваться на следующих этапах выполнения Проекта. С точки зрения прикладной науки, были получены генетические конструкции, несущие в себе последовательность одного их гена Lea-белков. Были отработаны протоколы трансфекции этих конструкции в культуру клеток Pv11 и Sf9. Это очень важный шаг для последующей оценки улучшения выживаемости клеток при гиперэкспрессии защитных белков в клетках. Кроме того, это позволит провести оценку внутриклеточной локализации Lea-белков и приблизиться к уточнению их функций.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Хирономида P.vanderplanki является уникальным организмом, представителем класса насекомых, способным выживать при полной потере воды. Применение омиксных технологий позволило приоткрыть завесу тайны молекулярных механизмов, обеспечивающих индукцию состояния ангидробиоза, при котором метаболические процессы в клетках животного не фиксируются. В рамках выполнения проекта за текущий год был проведен анализ результатов данных, полученных с помощью метода Hi-C, что позволило значительно улучшить сборку генома хирономиды до уровня хромосом. Эта версия геномной сборки на сегодняшний день является самой полной для P.vanderplanki и оптимальной для использования при анализе транскриптомных данных. Также эта сборка легла в основу новой базы данных Midgebase 2.0, которую создали на платформе zenbu (http://fantom.gsc.riken.jp/zenbu/). Также в браузер zenbu добавленные все имеющиеся данные по секвенированию РНК-библиотек, CAGE-библиотек, в будущем возможно добавлять любые новые данные. Эта платформа является очень удобной для анализа данных и визуализации в интерактивном режиме и позволяет проводить исследование экспрессии генов на разных этапах жизненного цикла хирономиды или в цикле обезвоживания. Детальный анализ длинных некодирующих РНК выявил целый ряд кандидатов, которые могут играть важную роль в процессе ангидробиоза. Эксперименты с культурой клеток позволили разделить все белки группы Lea, которые, как известно, являются ключевым участником процесса ангидробиоза на группы, согласно их локализации. Это позволяет приблизиться к пониманию функции каждого отдельного представителя семейства Lea белков в клетках ангидробиотической хирономиды.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На данном этапе проекта нами были проанализировано внутриклеточное распространение защитных белков LEA как в клетках хирономиды, так и при их экзогенной экспрессии в модельных клетках насекомых Sf9. Мы обнаружили, что внутриклеточная локализация белков не является консервативной в ряде случаев, что необходимо учитывать при генно-инженерных работах с использованием защитных белков хирономиды. В то же время, значительное количество LEA белков сохраняли внутриклеточную локализацию вне зависимости от типа клеток, что открывает возможности планирования специфичной защиты отдельных клеточных органелл от обезвоживания. Также мы охарактеризовали новую необычную группу белков хирономидч, происхождение которых связано с классическими LEA белками, но структурно отличными от них. Это мембранные белки (Lea island located, Lil), характеризующиеся повышением экспрессии при обезвоживании, что указывает на их роль в ангидробиозе P. vanderplanki. Эти гены являются орфанными и не было обнаружено ортологов в других видах живых, включая двукрылых насекомых к которым относятся хирономиды. Таким образом можно утверждать, что мы обнаружили новую группу белков специфично взаимодействующих с мембранами клеток при обезвоживании. Тем не менее, экспрессия отдельно рекомбинантных LEA и Lil белков не приводила к повышению устойчивости модельных клеток Sf9, что свидетельствует о том что, для формирования защитного молекулярного щита в клетке необходимо синергетическая активность различных групп белков хирономиды. Нами также были проанализированы некодирующие длинные и малые РНК хирономиды и определены те из них, которые связаны в своей транскрипционной активности с генами активно вовлеченными а ангидробиоз. Стоит отметить, что основная масса некодирующих РНК связанных с ангидробиозом располагалась в определенном участке генома - на четвертой хромосоме, там же где и другие уникальные гены хирономиды связанные с толерантностью к обезвоживанию.