КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-73-20172

НазваниеСубмикронные мезопористые частицы ватерита для трансдермальной доставки биологически активных веществ

РуководительСвенская Юлия Игоревна, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Саратовский национальный исследовательский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского", Саратовская обл

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2020  , продлен на 07.2020 - 06.2022. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2017 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-406 - Химическая термодинамика. Физическая химия поверхности и межфазных границ. Адсорбция

Ключевые словаватерит, матрица-носитель, карбонат кальция, адресная доставка, трансдермальная доставка, субмикронные частицы, микрочастицы, волосяные фолликулы

Код ГРНТИ31.15.37, 34.17.53, 76.29.57


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Предлагаемое исследование нацелено на повышение терапевтической эффективности противогрибковых средств для лечения микроспории, благодаря увеличению их локальной концентрации и вероятности аккумуляции в области поражения. С этой целью осуществляется разработка неинвазивного способа эффективной трансдермальной доставки антимикотика через придатки кожи (волосяные фолликулы и воронки) к местам непосредственной локализации патологических процессов при помощи субмикронных мезопористых частиц ватерита. При разработке способа учитывается также возможность управления высвобождением противогрибкового вещества из контейнеров в прилегающие к фолликулам ткани. Такой подход обеспечивает адресацию терапевтического воздействия к области локализации грибкового возбудителя, что предполагает уменьшение дозы используемого препарата и снижение его токсического действия на здоровые ткани организма. Поверхностные грибковые инфекции являются одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний и охватывают 20-25% популяции мирового населения. Актуальной задачей является оптимизация методик лечения такого микоза, как микроспория. Данное заболевание протекает с поражением кожи и ее придатков (волос и ногтей), вызванным патогенными грибами рода Microsporum. Несмотря на существование ряда эффективных противогрибковых средств, к настоящему моменту сохраняется актуальность усовершенствования противогрибковой терапии, обусловленная необходимостью снижения риска развития побочных эффектов, оказываемых на организм, повышения биодоступности препаратов и сокращение длительности курса лечения. Основные методы терапии микроспории основаны на приеме системных антимикотических средств, причем в высоких дозах, поскольку возбудитель данного заболевания отличается самой высокой устойчивостью, по сравнению с другими дерматофитами. Это увеличивает риск проявления токсических свойств препарата. В связи с этим, актуальной задачей является повышение эффективности наружного применения антимикотиков. Такой подход является целесообразным, поскольку при микроспории, как правило, поражаются поверхностные слои кожи и ее придатки, без вовлечения в патологический процесс других органов и тканей. Особый интерес вызывает повышение эффективности интрафолликулярного проникновения антимикотиков, поскольку пространство волосяного фолликула способно служить резервуаром для хранения лекарственной субстанции, обеспечивая ее локализацию в области поражения. В последние десятилетия особенной популярностью пользуется разработка подходов, связанных с иммобилизацией антимикотических средств в различные наноразмерные и субмикронные контейнеры. Применение матриц-носителей для иммобилизации активного вещества играет ключевую роль также и в обеспечении их эффективной трансфолликулярной доставки. Физико-химические параметры таких носителей оказывают большое влияние на глубину и обильность заполнения волосяных фолликулов. Разрабатываемый подход предполагает применение мезопористых субмикронных частиц карбоната кальция в качестве матриц для иммобилизации антимикотиков. Данные частицы обладают пористой структурой с диаметром пор от 20 до 60 нм, а также рядом таких достоинств, как биосовместимость, мягкие условия разрушения, простота приготовления и низкая себестоимость. Пористость частиц ватерита определяет эффективность включения лекарственных форм в их объем. Путем изменения рН среды можно добиться растворения частиц карбоната кальция, что обеспечит высвобождение иммобилизованного в них препарата. Применение предлагаемых носителей в рамках данного проекта связано с возможностью обеспечения эффективной трансдермальной (трансфолликулярной) доставки иммобилизованных в их объем веществ. Новизна предлагаемого подхода заключается в применении контейнеров такого типа для трансдермальной доставки, обеспечивающего усовершенствование противогрибковой терапии, благодаря увеличению глубины и обильности заполнения волосяных фолликулов, а также возможности управления высвобождением антимикотика. Стоит отметить, что акцент на улучшенное внедрение антимикотика в волосяные фолликулы с целью повышения его терапевтической эффективности сам по себе является оригинальным.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения работ по проекту будет разработана новая методика терапии микозов, а в частности микроспории микроспории гладкой кожи и волосистой части головы, предполагающая адресность и локализованность терапевтического воздействия, а также возможность управления процессом высвобождения противогрибкового средства, отличающаяся за счет этого повышенной эффективностью и возможностью применения сниженных концентраций антимикробных веществ. Разработка такого подхода является значимым шагом в направлении рационального использования антимикробных веществ. Кроме того, проведение исследований в рамках проекта, позволит разработать методику эффективного внедрения матриц-носителей лекарственного вещества в сально-волосяные фолликулы in vivo и управления процессом их деградации и высвобождения иммобилизованного вещества после интрафолликулярного внедрения. Такое исследование позволит собрать необходимую информацию и оптимизировать саму систему-носитель, открывая перспективы иммобилизации других лекарственных веществ для применения в терапии дерматозов соответствующей локализации. Пространство сально-волосяного фолликула служит резервуаром для хранения активного вещества, обеспечивая доступ к стволовым и иммунным клеткам, а также к сети кровеносных сосудов, примыкающих к корню луковицы, в результате его проникновения в прилегающие к фолликулу области за счет диффузии. Таким образом открывается возможность локализации терапевтического воздействия лекарственного препарата при лечении таких нозологий, как, например, алопеция и витилиго, а кроме того становится возможной пролонгированная системная доставка лекарственных веществ. Полученные результаты смогут послужить основанием проведения доклинических и клинических испытаний предлагаемых структур и заложить основу для разработки методических рекомендаций для применения в клинической практике Клиники Кожных и Венерических болезней Саратовского Государственного Медицинского Университета и Первой Ветеринарной Клиники г. Саратова, выражающих большой интерес к данному исследованию и готовность к сотрудничеству, а также других учреждений, интерес со стороны которых может появится в будущем. Что закладывает перспективы создания нового метода лечения и улучшения качества жизни пациентов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В рамках выполнения работ по проекту в первый год получены протоколы синтеза субмикронных и микроразмерных частиц карбоната кальция в кристаллографической модификации ватерита, в том числе содержащих антимикотики «Гризеофульвин» и «Нафтифин», а также флуоресцентный краситель Цианин-7 (Cy7). Сформированы частицы ватерита размером 4.5±0.5, 1.0±0.1, 0.7±0.2, 0.6±0.1 и 0.4±0.1 мкм. В ходе выполнения данных работ, был также опробован новый подход к синтезу частиц ватерита, предполагающий осаждение частиц из насыщенного раствора при добавлении реагентов по каплям в присутствии этиленгликоля, что позволяет варьировать концентрацию ионов [Ca2+] в реакционном растворе в каждый момент времени, влияя на процесс кристаллизации (результаты опубликованы в работе Svenskaya Yu. I. et al. Crystal Growth & Design, 2018, 18, 1, 331–337). Успешность загрузки ватеритных контейнеров флуоресцентным красителем и антимикотиками доказана методами конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, спектрофлуориметрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и спектроскопии комбинационного рассеяния. Оценена эффективность загрузки частиц ватерита флуоресцентным красителем и антимикотиками. Получены данные о процессах растворения и перекристаллизации ненагруженных частиц ватерита, а также частиц, содержащих флуоресцентный краситель Cy7 и препараты «Гризеофульвин» и «Нафтифин», в модельных растворах: воде, физиологическом растворе и питательной среде для роста клеток. Будучи наименее стабильной фазой карбоната кальция, ватерит медленно растворяется и перекристаллизуется при контакте с водными растворами. В зависимости от иммерсионной среды, частицы ватерита либо полностью растворяются, либо переходят в кальцит в результате ионизации внешнего слоя их поверхности. Этот процесс сопровождается высвобождением иммобилизованного вещества из ватеритной матрицы-носителя, причем полное высвобождение происходит, когда частицы ватерита полностью переходят в кальцитную фазу. В ходе выполнения работ по гранту, было продемонстрировано, что ватеритные контейнеры размером 4.5±0.5 и 0.6±0.1 мкм, нагруженных красителем Сy7, полностью переходят в кальцитную модификацию (кубические непористые кристаллы) в воде и физиологическом растворе через 24 часа после инкубации при температуре 37 °C. При инкубации контейнеров с антимикотиком при 37 °C в воде и физиологическом растворе установлено, что наличие антимикотика замедляло процесс перекристаллизации ватеритных контейнеров до 5 дней. При инкубации всех видов контейнеров в клеточной среде отмечено замедление процесса перекристаллизации в результате адсорбции белков, содержащихся в среде, на поверхности частиц, что привело к ее стабилизации, в результате чего частицы сохраняли свою форму в течение 9 дней наблюдения. Кроме того, в рамках реализации проекта в первый год была оценена токсичность ненагруженных частиц ватерита, а также частиц, содержащих флуоресцентный краситель Cy7 и антимикотики «Гризеофульвин» и «Нафтифин», in vitro с использованием клеток дермальных фибробластов крысы и человека. Установлено, что исследуемые контейнеры в количестве 20, 50, 100, 200, 300, 500, 750, 1000 частиц на клетку не оказывали значимого цитотоксического эффекта. Также оценена эффективность оптического просветления кожи крысы под действием 40% водного раствора глюкозы ex vivo и in vivo в спектральном диапазоне 400-900 нм. Исследовано изменение оптических и механических свойств кожи крысы под действием 40% водного раствора глюкозы (результаты представлены в работе Genina E.A. et al. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, Jun-Feb 2019, принятой к печати). На основе кинетики изменения коллимированного пропускания проведена оценка эффективности оптического просветления кожи ex vivo в спектральном диапазоне 400-900 нм. Установлено, что эффективность просветления выросла в 1.4 раза. Исследована временная зависимость коэффициента диффузного отражения кожи in vivo в области подкожной инъекции раствора глюкозы. Получены значения коэффициента диффузии глюкозы в коже ex vivo и in vivo, равные (1.11±0.78)×10-6 и (1.54±0.28)×10-6 см2/с, соответственно. Описана методика внедрения сформированных структур в волосяные фолликулы крысы in vivo, состоящая в том, что внедрение достигается путем нанесения спиртовой суспензии субмикронных частиц ватерита с последующим воздействием терапевтическим ультразвуком частотой в течение 2 минут. Трансдермальная доставка ватеритных контейнеров в результате применения разработанного протокола обеспечила эффективное и обильное заполнение внутреннего пространства волосяных фолликулов, а также внедрение частиц в стенки фолликулярного мешочка. Определены оптические просветляющие агенты, состав которых позволяет добиться увеличения оптической глубины детектирования исследуемых частиц CaCO3 в волосяных фолликулах крысы методом оптической когерентной томографии в спектральном диапазоне 930±50 нм. Проведены исследования с использованием нескольких гидрофильных и липофильных оптических просветляющих агентов (различные комбинации ДМСО, ПЭГ-400, тиазона, минерального масла, глицерина и олеиновой кислоты). Установлено, что оптимальным агентом для увеличения оптической глубины детектирования исследуемых частиц CaCO3 в волосяных фолликулах является смесь олеиновой кислоты и полиэтиленгликоля с молекулярной массой 400 в соотношении 20:80%. Ее использование обеспечило увеличение глубины детектирования 1.65-1.7 раз (до 404±37 мкм) в течение 25 минут оптического просветления. Получены данные о процессах деградации ватеритной матрицы и высвобождения иммобилизованного вещества внутри волосяных фолликулов лабораторной крысы in vivo Анализ был произведен по данным сканирующей электронной микроскопии выдернутых с корнем волос, а также конфокальной лазерной сканирующей микроскопии гистологических срезов биоптата, отобранного у лабораторных животных в различные промежутки времени после внедрения частиц. Установлено, что процесс активного растворения и перекристаллизации контейнеров происходит в течение 168 часов и завершается их полной деградацией в течение 264 часов. Флуоресцентный сигнал внутри волосяных фолликулов, обусловленный наличием красителя Cy7, сохранялся в процессе деградации ватеритной матрицы. Уменьшение сигнала флуоресценции свидетельствовало о постепенной элиминации красителя: заметный спад флуоресценции отмечался через 168 часов после внедрения частиц, когда процесс перекристаллизации ватеритной матрицы был полностью завершен для большинства внедренных контейнеров. Изучена кинетика флуоресцентного красителя Cy7 в моче крысы методом флуориметрии. Наличие флуоресцентного сигнала от красителя в моче наблюдалось в течение 264 часов, однако через 168 часов после внедрения частиц отмечалось уменьшение сигнала более, чем в 10 раз от начального. Постепенное выведение красителя из организма отражалось в дальнейшем уменьшении интенсивности флуоресцентного сигнала в моче. Оценена токсичность ватеритных матриц-носителей, содержащих флуоресцентный краситель Cy7, in vivo по данным биохимического исследования мочи лабораторных животных. Установлено, что внедрение контейнеров не оказало выраженного патологического влияния. Наблюдение за состоянием кожи лабораторных животных также позволило сделать вывод об отсутствии острых реакций на внедрение частиц: воспалительные процессы, эритема или какие-либо другие повреждения кожи не были отмечены, как в ходе эксперимента (в течение 3 недель), так и в течение месяца после. Получено разрешение Комитета по этике ФГБОУ ВО Саратовский Государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского Минздрава России (протокол № 8 от 10.04.2018 года) на исследования в рамках гранта РНФ № 17-73-20172 "Субмикронные мезопористые частицы ватерита для трансдермальной доставки биологически активных веществ " для всех исполнителей гранта. Разрешение распространяется на все in vivo исследования на здоровых лабораторных животных, запланированные в заявке. Результаты, полученные в ходе выполнения работ по проекту в течение первого года, представлены на конференциях Saratov Fall Meeting, Международная молодежная конференция «ФизикА.СПб», XV Всероссийский молодежный Самарский конкурс-конференция научных работ по оптике и лазерной физике, XXXV Рахмановские чтения: Перспективные направления диагностики и терапии в дерматовенерологии и косметологии, Юбилейная конференция по микологии и микробилогии и 2d Edition of Global Conference on Pharmaceutics and Drug Delivery Systems в 5 устных и 2 постерных докладах.

 

Публикации

1. - Подведены итоги конкурсов РНФ Новости Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского, 6 июля, 2017 - 11:15 (год публикации - ).

2. Генина Э.А., Башкатов А.Н., Тучина Д.К., Тимошина П.А.,Тучин В.В. Kinetics of skin optical clearing at topical application of 40%-glucose: ex vivo and in vivo studies Journal of Selected Topics in Quantum Electronics, - (год публикации - 2018).

3. Гуслякова О.И., Ленгерт Е.В., Свенская Ю.И. Иммобилизация противогрибкового препарата «нафтифин» в пористые частицы карбоната кальция Успехи медицинской микологии (Advances in Medical Mycology), Т. 18. - С. 131-135 (год публикации - 2018).

4. Зайцев С. М., Свенская Ю. И., Ленгерт Е. В., Башкатов А. Н., Тучин В. В., Генина Э. А. Результаты исследования увеличения оптической глубины детектирования частиц CаCO3 в коже с помощью ОКТ при оптическом просветлении Проблемы оптической физики и биофотоники SFM-2017, Mатериалы 5-го Международного симпозиума и Международной молодежной научной школы Saratov Fall Meeting 2017. - C. 43-47 (год публикации - 2017).

5. Ленгерт Е. В., Верховский Р.А., Свенская Ю.И. Cубмикронные мезопористые частицы ватерита для трансдермальной доставки противогрибкового средства Гризеофульвин Успехи медицинской микологии (Advances in Medical Mycology), Т. 18. - С. 131-135 (год публикации - 2018).

6. Свенская Ю.И., Ленгерт Е. В., Генина Э.А., Верховский Р.А., Терентюк Г.С., Тальникова Е.Е., Утц С.Р. Разработка подходов к трансдермальной доставке антимикотиков Успехи медицинской микологии (Advances in Medical Mycology), Т. 18. - С. 131-135 (год публикации - 2018).

7. Свенская Ю.И., Фатта Х., Иноземцева О.А., Иванова А.Г., Штыков С.Н., Горин Д.А., Парахонский Б.В. Key Parameters for Size- and Shape-Controlled Synthesis of Vaterite Particles Crystal Growth & Design, - (год публикации - 2017).

8. Тальникова Е.Е., Свенская Ю.И., Добдина А.Ю., Фатахова Х.В., Утц С.Р. Витилиго: современные методы терапии Саратовский научно-медицинский журнал, № 3. - Т. 13. - С. 667-672 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках выполнения работ по проекту во второй год получены протоколы модификации поверхности частиц карбоната кальция биосовместимыми биодеградируемыми полиэлектролитами: полиаргинин (Pa) и декстран сульфата натриевая соль (Ds), а также белковыми молекулами: гепарин (Hp), для формирования мультислойных оболочек с различным числом слоев и различной композицией. Целью являлась стабилизация поверхности ватеритных контейнеров, контроль процесса их перекристаллизации в кальцит и пролонгация кинетики высвобождения вещества, иммобилизованного в них. Таким образом, были сформированы частицы ватерита, содержащие флуоресцентный краситель родамин Б (RdB), размером 1.1±0.4 мкм; ватеритные носители фотосенсибилизатора «Фотодитазин» (Fd) размером 1.2±0.4 мкм; контейнеры, нагруженные антимикотиками «Гризеофульвин» (Gf) и «Нафтифин» (Nf), размером 1.1±0.4 мкм и 0.8±0.2 мкм, соответственно. Проведена модификация их поверхности оболочкой Hp; одним бислоем полиэлектролитов (Pa/Ds)1; двумя бислоями полиэлектролитов (Pa/Ds)2; двумя бислоями полиэлектролитов и слоем гепарина (Pa/Ds)2/Hp. Исследован процесс деградации модифицированных контейнеров и кинетики высвобождения иммобилизованного флуоресцентного красителя в модельных средах: деионизированная вода (H2O), физиологический раствор (NaCl) и среда для культивирования клеток (MEM). Установлено, что наименее устойчивыми к перекристаллизации в H2O и NaCl являются не модифицированные оболочкой контейнеры. Оболочка (Рa/Ds)1 не оказала заметного стабилизирующего эффекта на поверхность ватеритных носителей, в то время, как модификация оболочкой (Рa/Ds)2 обеспечила существенное замедление процесса перехода ватеритных контейнеров в кальцит в H2O и NaCl. Показано, что наилучшую стабилизацию поверхности контейнеров обеспечивает оболочка (Рa/Ds)2/Hp. Кроме того, контейнеры, имеющие Hp в составе оболочек, были наиболее устойчивы к агрегации и хорошо диспергировались. В среде MEM все типы частиц сохраняли сферическую форму в течение всего периода наблюдения (7 дней), что объясняется дополнительной стабилизацией поверхности частиц белковыми молекулами, адсорбированными из клеточной среды. Также продемонстрирована возможность пролонгации процесса высвобождения модельных веществ из частиц ватерита путем покрытия их поверхности полиэлектролитной оболочкой. Установлено, что наибольший эффект пролонгации высвобождения иммобилизованного RdB и Fd обеспечивают оболочки (Pa/Ds)1 и (Pa/Ds)2. Исследован процесс деградации ватеритных носителей и кинетика высвобождения иммобилизованного антимикотика в модельных средах: H2O, NaCl и MEM. При сопоставлении скорости перекристаллизации ненагруженных контейнеров и контейнеров с антимикотиком Nf, в том числе покрытых оболочкой различной композиции, установлено, что наличие Nf в структуре частиц оказывает стабилизирующий эффект. Начало процесса (для образцов с оболочками (Pa/Ds)1 и (Pa/Ds)2) и полный переход в фазу кальцита (для всех образцов) в H2O отодвигаются во времени. Наибольшее эффективное замедление процесса перекристаллизации контейнеров в H2O и NaCl обеспечивает модификация их поверхности оболочками (Pa/Ds)2 и (Pa/Ds)2/Hp. При инкубации исследуемых ватеритных носителей Nf в MEM не было отмечено их трансформации в кальцит, что объясняется стабилизацией за счет эффекта «короны», формируемой белковыми молекулами среды. Установлено, что наибольший эффект пролонгации высвобождения иммобилизованного Nf обеспечивает оболочка (Pa/Ds)2/Hp. Проведена оптимизация протокола иммобилизации противогрибкового средства Gf. Использование данного протокола позволяет добиться увеличения содержания антимикотика в ватеритной матрице. Таким образом, были получены частицы карбоната кальция со средним диаметром 1.1±0.4 мкм, эффективность загрузки Gf которых составила 1.5%. Проведена оптимизация протокола инкубации субмикронных частиц ватерита с клетками фибробластов мыши L929, с целью определения длительности инкубации, в результате которой обеспечивается наиболее эффективный захват частиц клетками. Проведена инкубация частиц карбоната кальция в количестве 10 частиц на клетку в течении 4, 8 и 15 часов. Исследование было выполнено при помощи CLSM, полученные конфокальные флуоресцентные изображения и Z-последовательности оптических срезов позволили оценить количество частиц, поглощенных за время инкубации. Установлено, что оптимальной является инкубация частиц с клетками в течение 8 часов. Изучено влияние полиэлектролитной оболочки на эффективность интернализации частиц ватерита, нагруженных антимикотиком Nf, в клетки дермальных фибробластов человека (NHDF). Проведена инкубация контейнеров в количестве 10 частиц на клетку в течение 8 часов. При инкубации контейнеров с оболочкой (Pa/Ds)2 наблюдалось наибольшее количество клеток, не захвативших ни одного контейнера, а также отсутствовали клетки, захвативших более 6 частиц. Для образца с оболочкой (Pa/Ds)2/Hp был отмечен захват в количестве от 1 до 8 частиц на клетку, однако поглощение более 6 частиц наблюдалось в меньшем количестве случаев. При инкубации контейнеров без оболочки и с оболочкой Hp отмечено наименьшее количество клеток без частиц, а также равновероятным было наличие в клетках частиц в количестве от 1 до 10, что говорило об их эффективном поглощении. Разработан протокол оценки захвата субмикронных частиц карбоната кальция методом проточной цитометрии. Поскольку методом проточной цитометрии с визуализацией можно анализировать тысячи клеток в секунду, то применение разработанного алгоритма для определения локализации частиц в клетке, в случае достоверности данных, позволяет осуществлять быструю оценку качества эндоцитоза исследуемого образца и делать выводы о том, какой из образцов линейки лучше, а какой хуже захватывается клетками. Проведено исследование захвата и локализации контейнеров с антимикотиком Gf, в том числе покрытых полиэлектролитной оболочкой, клетками фибробластов мыши L929 методами проточной цитометрии на цитофлуориметре с режимом визуализации. Чтобы убедиться в достоверности данных об эндоцитозе, полученных методом цитометрии, было проведено контрольное исследование захвата частиц клетками методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. По данным, полученным в результате анализа ортогональных проекций z-срезов последовательностей оптических срезов, было рассчитано число частиц, содержащихся в клетках, для каждого образца. Данные, полученные методом CLSM, и данные, полученные методом проточной цитометрии для исследованной линии образцов, продемонстрировали отличную корреляцию. Идентичность тенденций говорит о возможности применения проточной цитометрии для быстрого анализа захвата частиц и выбора оптимального образца контейнеров из целой серии. В результате исследования установлено, что контейнеры, покрытые оболочками (Pa/Ds)2 и (Pa/Ds)2/Hp, лучше захватываются клетками, чем немодифицированные частицы, однако оптимальными были показатели захвата для контейнеров с оболочкой (Pa/Ds)2. Наличие Hp негативно влияло на захват клетками контейнеров, как покрытых оболочкой, так и без нее. Исследована токсичность матриц-носителей противогрибковых препаратов Gf и Nf, в том числе модифицированных оболочками Hp, (Pa/Ds)1, (Pa/Ds)2 и (Pa/Ds)2/Hp, с использованием клеток дермальных фибробластов человека (NHDF) in vitro. Установлено, что все исследуемые контейнеры в количестве 10, 50, 100, 200, 300, 500, 750, 1000 частиц на клетку не оказывали значимого цитотоксического эффекта. Изучено цитотоксическое действие ватеритных частиц, нагруженных фотосенсибилизаторм Fd, без и с оболочкой, а также эквивалентных концентраций Fd, на клеточных линиях мышиной меланомы B16-F10, фибробластов мыши L929 и фибробластов эмбриона человека ФЭЧ-Т. Установлено, что с увеличением числа частиц, приходящихся на клетку, а также с увеличением концентрации Fd наблюдается повышение степени подавления метаболической активности культур клеток. Цитотоксичность частиц, покрытых полимерной оболочкой, в большинстве случаев была ниже, чем для непокрытых носителей, что обусловлено разницей скорости высвобождения вещества из контейнеров и хорошо согласуется с ранее полученными данными. Наличие полимерной оболочки замедляет скорость выхода фотосенсибилизатора из частиц ватерита, и, как следствие, снижает цитотоксический эффект. Разработан протокол управления деградацией частиц карбоната кальция внутри волосяных фолликулов in vivo с помощью низкоинтенсивного терапевтического ультразвука. С целью ускорения процесса деградации контейнеров было изучено влияние ультразвукового пост-воздействия при помощи того же терапевтического ультразвука частотой 1 МГц, что применяется нами для осуществления трансдермальной доставки контейнеров. Исследование проводилось на белых лабораторных крысах и мышах линии Balb/c in vivo. По данным исследования методом СЭМ распределения и состояния частиц в волосяных фолликулах экстрагированных волос, а также in vivo мониторинга исследуемых участков кожи с помощью оптической когерентной томографии, установлено, что применение ультразвукового пост-воздействия существенно сокращает длительность процесса резорбции внедренных контейнеров (с 12 дней вплоть до 8) и обеспечивает управление этим процессом путем варьирования длительности пост-воздействия. Изучена кинетика выведения с мочой флуоресцентного красителя цианин 7 (Cy7) из организма крысы in vivo при его внутривенном и трансдермальном внедрении в свободном виде, а также после иммобилизации в частицы карбоната кальция. Осуществлено сравнение разработанного протокола трансдермальной транспортировки (поверхностное нанесение нагруженных Cy7 ватеритных носителей с последующим УЗ-воздействием) со стандартным внутривенным введением раствора Cy7, а также с контрольными протоколами трансдермальной транспортировки: поверхностное нанесение нагруженных Cy7 носителей без обработки ультразвуком и поверхностное нанесение раствора Cy7 с последующей ультразвуковой обработкой. Профили экскреции доставленного красителя с мочой продемонстрировали, что разработанная в ходе выполнения работ по проекту методика трансдермальной доставки лекарств, обеспечивает их успешный системный захват. Наличие выраженного флуоресцентного сигнала от красителя в моче наблюдалось в течение 192 часов, в то время, как контрольные эксперименты продемонстрировали быстрое снижение интенсивности флуоресценции. В контрольных экспериментах наблюдалось выведение основной массы красителя в течение 24 часов. Более того, интенсивность флуоресценции даже в пиковой точке была, по меньшей мере, в 5 раз ниже, чем при доставке с использованием разработанной методики, что подчеркивает важность внутрифолликулярной доставки лекарств по сравнению с другими видами трансдермального транспорта. Проведена оценка местно-раздражающего действия частиц карбоната кальция, нагруженных антимикотиком Gf, в совокупности с ультразвуковым воздействием на кроликах калифорнийской породы in vivo. Были исследованы группы без воздействия, с аппликацией спиртового раствора при УЗ- воздействии, с аппликацией ненагруженных частиц ватерита при УЗ-воздействии, с аппликацией раствора Gf при УЗ-воздействии, а также с аппликацией ватеритных контейнеров, нагруженных Gf, при УЗ-воздействии. При аппликации на кожу кроликов испытуемых препаратов симптомов интоксикации не отмечено. При исследовании раздражающего действия препаратов установлено, что при однократном воздействии препаратов на кожу, проявлялось кратковременное легкое покраснение, так как препараты были приготовлены на спирте. При дальнейшем обследовании обработанного участка кожи в сравнении с исходным периодом и контрольными животными не наблюдали признаков, которые свидетельствовали бы о выраженном раздражающем действии испытуемых препаратов. Ватеритные носители Gf не вызывали видимых функциональных нарушений кожи, таких как выраженная эритема, отеки, трещины, изъязвления, изменения локальной температуры кожи. Результаты, полученные в ходе выполнения работ по проекту в течение второго года опубликованы в виде 3 научных статей в журналах [Svenskaya Yu.I. et al. A simple non-invasive approach toward efficient transdermal drug delivery based on biodegradable particulate system//ACS applied materials & interfaces, 2019], [Lengert E. et al. Mesoporous carriers for transdermal delivery of antifungal drug//Materials Letters, 2019, V. 248, p.211-213], [Гуслякова О.И. и др. Спектральный мониторинг процесса Иммобилизации препарата Нафтифин в субмикронные частицы ватерита//Оптика и спектроскопия, 2019, Т. 126 (5), с. 620-626], индексируемых базами WOS и Scopus. А также представлены на конференциях Saratov Fall Meeting (SFM-2018); Symposium on Lasers in Medicine and Biophotonics (ICLO-2018); 13th International Conference on Surfaces, Coatings and Nanostructured Material (NANOSMAT-2018); International Conference On Nanomedicine And Nanobiotechnology (ICONAN-2018) в виде 3 устных и 4 постерных докладов.

 

Публикации

1. Гуслякова О.И., Ленгерт Е.В., Аткин В.С., Тучин В.В., Свенская Ю.И. Спектральный мониторинг процесса иммобилизации препарата Нафтифин в субмикронные частицы ватерита Optics and Spectroscopy, Springer (Оптика и спектроскопия), Т. 126, вып. 5, с. 620-626 (год публикации - 2019).

2. Гуслякова О.И., Ленгерт Е.В., Свенская Ю.И. Immobilization of anti-fungal drug "Naftifine" in porous calcium carbonate particles 2018 Saratov Fall Meeting (SFM): proceedings, 24-29 september 2018, Saratov, Russia, - (год публикации - 2018).

3. Зайцев С. М., Башкатов А. Н., Тучин В. В., Генина Э. А. Оптическое просветление как способ увеличения глубины детектирования наночастиц в коже при окт-визуализации Известия Саратовского университета, Новая серия, Серия Физика, Т. 18, вып. 4, с. 275-284 (год публикации - 2018).

4. Ленгерт Е., Верховский Р., Юрасов Н., Генина Э., Свенская Ю. Mesoporous carriers for transdermal delivery of antifungal drug Materials Letters, Elsevier, T. 248, с. 211-213 (год публикации - 2019).

5. Ленгерт Е.В., Верховский Р.А., Тучин В.В., Свенская Ю.И. Submicron mesoporous vaterite particles for transdermal delivery of antimycotic drug griseofulvin Abstracts book on 13th International Conference on Surfaces, Coatings and Nanostructured Materials (NANOSMAT 2018), Gansk, Poland, C. 21-22 (год публикации - 2018).

6. Ленгерт Е.В., Савельева М.В., Верховский Р.А., Свенская Ю.И. Submicron mesoporous vaterite particles for transdermal delivery of antimycotic drug griseofulvin 2018 Saratov Fall Meeting (SFM): proceedings, 24-29 september 2018, Saratov, Russia, - (год публикации - 2018).

7. Свенская Ю.И., Генина Э.А., Ленгерт Е.В., Терентюк Г.С., Синдеева О.А., Тучин В.В., Сухоруков Г.Б. Follicle-mediated transdermal drug delivery by means of porous biodegradable inorganic particles Book of abstracts on International Conference on Nanomedicine and Bionanotechnology (ICONAN 2018), Rome, Italy, C. 41 (год публикации - 2018).

8. Свенская Ю.И., Генина Э.А., Парахонский Б.В., Ленгерт Е.В., Тальникова Е.Е., Терентюк Г.С., Утц С.Р., Горин Д.А., Тучин В.В., Сухоруков Г.Б. A simple non-invasive approach toward efficient transdermal drug delivery based on biodegradable particulate system ACS Applied Materials & Interfaces, American Chemical Society, - (год публикации - 2019).

9. Свенская Ю.И., Ленгерт Е.В., Терентюк Г.С., Тальникова Е.Е. Биодеградируемые контейнеры для трансдермальной доставки антимикотиков журнал "Проблемы медицинской микологии", Материалы Российско-китайского Конгресса по медицинской микробиологии, эпидемиологии, клинической микологии и иммунологии (XXII Кашкинские чтения), тезисы № 138 (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
При реализации исследований в третий год выполнения проекта, проведено сравнительное исследование глубины проникновения флуоресцентного красителя цианина 7 (Cy7) в волосяные фолликулы, а также скорости его выведения из прилегающих к фолликулу тканей, при трансдермальном внедрении in vivo в свободном виде и после иммобилизации в частицы карбоната кальция. Исследование было выполнено на самцах белой лабораторной крысы. Целью являлось изучение влияния разработанных нами носителей в совокупности с оптимизированным протоколом их внедрения на эффективность трансдермальной транспортировки веществ. В результате анализа методом конфокальной лазерной микроскопии (КЛСМ) гистологических срезов кожи животных после внедрения препаратов установлено, что использование частиц карбоната кальция обеспечивает распределение иммобилизованного в них Cy7 в эпидермисе и различных областях волосяного фолликула по всей его длине, вплоть до самой луковицы, таким образом увеличивая глубину проникновения красителя в 4 раза, по сравнению с его доставкой в свободной форме. Кроме того, внедрение Cy7 с использованием частиц обеспечивает в 3 раза более длительное его хранение в придатках кожи (264 часа), по сравнению с внедрением раствора Cy7 (96 часов). Продемонстрирована возможность неинвазивной in vivo визуализации с помощью растровой сканирующей оптоакустической мезоскопии (РСОМ) проникновения фотосенсибилизатора фотодитазин (Fd) в волосяные фолликулы и приповерхностные кровеносные сосуды при его трансдермальном внедрении в свободном виде и после иммобилизации в частицы карбоната кальция. Исследование было выполнено на мышах линии Balb/c. Показано, что при применении раствора Fd оптоакустический сигнал в волосяных фолликулах проявляется сразу после его применения и спадает через 8 часов. Внедрение иммобилизованного в частицы ватерита Fd обеспечивало нарастание сигнала в течение 8 часов, сменяющегося прологированным спадом в течение нескольких дней (сигнал исчезал через 96 часов после внедрения). С помощью РСОМ исследовано также влияние оболочки, сформированной на поверхности ватеритных контейнеров биосовместимыми полиэлектролитами, а также ультразвукового (УЗ) пост-воздействия на область внедрения носителей, на длительность выведения Fd из придатков кожи. Установлено, что такая модификация поверхности частиц полиэлектролитной оболочкой, обеспечивая пролонгацию высвобождения Fd из контейнеров, увеличивает продолжительность обнаружения оптоакустического сигнала в волосяных фолликулах (120 часов). УЗ-пост-воздействие на область внедрения частиц ватерита с Fd с помощью терапевтического ультразвука, обеспечивая ускорение высвобождения Fd из контейнеров и его элиминации из фолликулов, приводило к спаду оптоакустического сигнала в течение более короткого промежутка времени (72 часа). Оптимизированы протоколы иммобилизации антимикотиков «Нафтифин» (Nf) и «Гризеофульвин» (Gf) в частицы карбоната кальция с целью повышения эффективности их загрузки. Применение методики индуцированной кристаллизацией адсорбции из раствора для иммобилизации Nf обеспечило повышение эффективности его загрузки в контейнеры в 1.7 раз, по сравнению с ранее использованными протоколами. Для оптимизации загрузки Gf в частицы карбоната кальция, их синтез был проведен путем совместного осаждения антимикотика с частицами в процессе их формирования при нагреве до 60°С. Удалось добиться повышения эффективности загрузки ватеритных носителей Gf в 10 раз. Осуществлена визуализация Gf методом КЛСМ в тканях волосяного фолликула белой лабораторной крысы в результате применения разработанного в ходе выполнения работ по проекту протокола его трансдермальной доставки. Исследование было выполнено на самцах белой лабораторной крысы с целью подтверждения транспортировки Gf в волосяные фолликулы и прилегающие к ним ткани с помощью частиц карбоната кальция. С использованием программного обеспечения Gwyddion был проведен анализ КЛСМ-изображений криосрезов кожи, забранной из контрольной (интактной) области и из области с внедрением нагруженных Gf контейнеров. Установлено, что интенсивность флуоресцентного сигнала в приповерхностной области после внедрения контейнеров увеличилась в 2.6 раз по сравнению с интактной областью, а толщина флуоресцирующей приповерхностной области – в 1.6, что свидетельствует об успешной аккумуляции антимикотика в придатках кожи. С целью подтверждения системной транспортировки Gf через волосяные фолликулы при его трансдермальном внедрении, методом флуориметрии проведено исследование кинетики выведения Gf из организма крысы с мочой. Исследование было выполнено на самцах белой лабораторной крысы. Обработка спектров мочи животных проведена при помощи программы, разработанной с использованием языка программирования python. Установлено, что при внедрении ватеритных контейнеров, нагруженных Gf, концентрация антимикотика в моче достигает максимального значения через 24 часа. Затем флуоресцентный сигнал от Gf спадает, и через 144 часа наблюдается второй пик. Продемонстрирована возможность пролонгации выведения Gf из организма крысы путем формирования полиэлектролитной оболочки на поверхности внедряемых ватеритных контейнеров. Установлено, что применении покрытых контейнеров приводит к сдвигу пиков Gf в моче во времени. Так, первый пик Gf в моче наблюдался через 48 часов после внедрения контейнеров, а второй – через 264 часа. C помощью тест-полосок для анализа мочи измерены 11 основных физиологических показателей животных, и сделан вывод об отсутствии патологических процессов, связанных с состоянием углеводного обмена, функции почек и печени, кислотно-щелочного баланса и инфекции мочевыводящих путей. Оценена противогрибковая эффективность частиц карбоната кальция, нагруженных Nf, в отношении культуры грибов Candida albicans АТСС 885-653 in vitro. Методом последовательных микроразведений исследована динамика роста грибка при инкубировании с раствором Nf и частицами ватерита, нагруженными Nf. Обнаружен эффект пролонгации терапевтического воздействия при применении контейнеров с антимикотиком, связанный с постепенным высвобождением Nf из ватеритной матрицы в питательную среду. Несмотря на то, что через 12 часов инкубации более заметный антимикотический эффект оказывал свободный Nf, через 36 часов для концентраций, начиная с 31.25 мкг/мл, угнетающее действие на грибок, оказываемое контейнерами с Nf, превзошло действие раствора Nf. Продемонстрировано повышение антигрибковой эффективности при инкубации с ватеритными контейнерами вплоть до 4.4 раз. Такой результат создает предпосылки для уменьшения кратности процедур нанесения Nf. Изучен эффект применения разработанной методики трансдермальной доставки Nf и Gf, иммобилизованных в ватеритную матрицу-носитель, для лечения дерматомикоза in vivo. Исследование проводилось на морских свинках с моделью трихофитии, обусловленной Trichophyton mentagrophytes. Изучение эффекта осуществлено в сравнении с лечением кремом для наружного применения "Микодерил" (препарат сравнения), а также с контролями (инфицированные животные без лечения и с лечением ненагруженными частицами ватерита). Показано, что лечение животных с применением частиц, нагруженных Nf и Gf, а также препарата сравнения, ведет к заметному ослабеванию клинических проявлений заболевания (уменьшение размера очага, степени эритемы, коркообразования и шелушения) уже через неделю после начала лечения. Наибольший терапевтический эффект был достигнут по завершении курса противогрибковой терапии с применением нагруженных Nf контейнеров. Микроскопическое исследование патологического материала из очага поражения подтвердило отсутствие грибка как в кожных чешуйках, так и в волосах животных, после лечения контейнерами с Nf и препаратом сравнения. Посевы биоматериала от животных этих групп также дали отрицательный результат, подтвердив эффективность проведенной терапии. При применении нагруженных Gf контейнеров отмечено заметное улучшение клинической картины, по сравнению с контрольными группами, однако эффективность лечения была меньшей, чем для двух других экспериментальных групп. Стоит отметить, что лечение препаратом сравнения проводилось каждый день в течение двух недель, в то время, как лечение с применением нагруженных Nf и Gf контейнеров осуществлялось с периодичностью раз в три дня. Таким образом, применение разработанного протокола трансдермальной доставки Nf обеспечивает оптимизацию лечения поверхностных микозов за счет повышения терапевтической эффективности и сокращения числа процедур нанесения в 3 раза. Исследована обратимость местно-раздражающего воздействия частиц ватерита, нагруженных Gf, при их трансдермальном внедрении. Исследование выполнено на кроликах калифорнийской породы in vivo. При отсутствии видимого повреждения кожи, гистологическое исследование препаратов кожи выявило развитие неспецифической воспалительной реакции в дерме, а также проявление лимфоидной инфильтрации в ответ на введение контейнеров. Через 2 недели было отмечено нарастание выраженности морфологических изменений, однако через месяц строение кожи приблизилось к норме, что свидетельствовало об обратимости описанных изменений. Обнаруженный ответ лимфатической системы у здоровых животных на введение разработанных контейнеров с антимикотиком рассматривается как позитивное явление, поскольку такая неспецифическая стимуляция иммунного ответа способна сыграть особую роль в терапии дерматомикозов. В рамках выполнения работ по проекту, с целью расширения области применения разработанной системы трансдермальной доставки лекарств, проведена апробация ее применимости для неинвазивной профилактической вакцинации - трансдермальной доставки вакцин. Исследование выполнено на мышах линии Balb/c in vivo. Разработан протокол иммобилизации гриппозной вакцины Флю-М в частицы карбоната кальция. Данные пилотного эксперимента продемонстрировали, что трансдермальное внедрение полученных контейнеров обеспечивает в 1.13 раза более эффективную иммунизацию животных, чем внутримышечное введение эквивалентного количества свободной вакцины. Проведена также апробация разработанного протокола трансдермальной доставки лекарств для задач фотохимиотерапии витилиго. Проведен пилотный эксперимент по репигментации очага витилиго у добровольца методом ПУВА-терапии с использованием трансдермальной доставки фотосенсибилизатора. Установлено, что применение частиц карбоната кальция, нагруженных псораленом, в совокупности с УФА излучением обеспечило появление очагов репигментации, как по периферии, так и в центре очага, с четкой тенденцией к перифолликулярной локализации. Предлагаемый способ может позволить в будущем увеличить эффективность фотохимиотерапии, снизить риск развития побочных эффектов, упростить процедуру лечения, а также повысить приверженность к терапии со стороны пациента. Результаты, полученные в ходе третьего года выполнения работ по проекту, опубликованы в виде 3 научных статей [Svenskaya Yu. et al. Enhanced topical psoralen–ultraviolet A therapy via targeting to hair follicles// Br J Dermatol. 2020], [Zaytsev S. et al. Optimized skin optical clearing for optical coherence tomography monitoring of encapsulated drug delivery through the hair follicles// J. Biophotonics 2020, e201960020], [Верховский Р. И др. Исследование интернализации контейнеров с антимикотиком клетками фибробластов методами визуализирующей проточной цитометрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии// Оптика и спектроскопия, 2020, 128(6), 795-804] в журналах, индексируемых базами WOS и Scopus. А также представлены на конференциях Наука будущего - наука молодых, Conference on Metamaterials and Nanophotonics (METANANO 2019), Saratov Fall Meeting (SFM-2019), UK-Russia Workshop on Patient-tailored biomaterials for tissue regeneration, combating microbial contamination and drug delivery в виде 5 устных и 2 постерных докладов.

 

Публикации

1. Верховский Р.А., Ленгерт Е.В., Савельева М.С., Козлова А.А., Тучин В.В., Свенская Ю.И. Исследование интернализации контейнеров с антимикотиком клетками фибробластов методами визуализирующей проточной цитометрии и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Оптика и спектроскопия (Optics and Spectroscopy), том 128, вып. 6, с. 795-804 (год публикации - 2020).

2. Зайцев С. М., Свенская Ю.И., Ленгерт Е.В., Терентюк Г.С., Башкатов А.Н., Тучин В.В., Генина Э.А Optimized skin optical clearing for optical coherence tomography monitoring of encapsulated drug delivery through the hair follicles Journal of Biophotonics, - (год публикации - 2020).

3. Свенская Ю.И., Тальникова Е.Е., Парахонский Б.В., Тучин В.В., Сухоруков Г.Б., Горин Д.А., Утц С.Р. Enhanced topical psoralen–ultraviolet A therapy via targeting to hair follicles British Journal of Dermatology, - (год публикации - 2019).


Возможность практического использования результатов
Разработана новая методика терапии дерматозов, обеспечивающая повышение терапевтической эффективности топических лекарственных средств, благодаря увеличению их локальной концентрации и вероятности аккумуляции в области поражения в результате обеспечения эффективной интра- и трансдермальной доставки. Предлагаемая методика отличается, таким образом, локализованностью и адресностью терапевтического воздействия, а также возможностью снижения дозы применяемых препаратов и кратности их нанесения. Применение данного подхода позволит в будущем рационализировать использование лекарственных препаратов, обеспечивая, в частности, усовершенствование и удешевление классических терапевтических схем, снижение риска развития побочных эффектов, упрощение процедуры лечения, а также повышение приверженности к терапии со стороны пациента. Полученные результаты могут служить основанием для проведения доклинических и клинических испытаний и, как результат, для разработки методических рекомендаций к применению в клинической практике. Таким образом, результаты проекта закладывают основу для формулирования практических подходов, ориентированных на создание технологий здоровьесбережения.