КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-74-10102

НазваниеИсследование регуляции экспрессии белков-транспортеров ауксина в корне Arabidopsis thaliana в норме и при пониженных температурах

РуководительКоврижных Василина Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Новосибирский национальный исследовательский государственный университет", Новосибирская обл

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2019 

КонкурсКонкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-206 - Физиология и биохимия растений

Ключевые словаауксин, морфогенез, фитогормон, ниша стволовых клеток, корень, регуляция транскрипции, поляризация, компьютерный анализ

Код ГРНТИ34.31.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Рациональное и эффективное применение регуляторов роста и развития растений является одной из актуальных задач сельского хозяйства. Широко-используемый в сельском хозяйстве фитогормон ауксин, как известно (Luštinec et al., 2014; Campanoni et al., 2005; Pagnussat et al., 2009; и др.), имеет различную биологическую активность в зависимости от концентрации. Поэтому для различных целей следует использовать различную дозу и способ применения активного вещества. В неблагоприятных условиях внешней среды особенно важным является сохранение корневых меристем в почве, которые могут дать начало новому растению после гибели надземной части. Поэтому исследование механизмов поддержания ниши стволовых клеток корня является одной из актуальных задач биологии развития растений. Ключевую роль в этом процессе играет фитогормон ауксин и его транспортеры семейства PIN (Sabatini et al., 1999; Grieneisen et al., 2007; Mironova et al., 2012). Однако для корневой меристемы больше ауксина не значит лучше – высокие дозы ауксина напротив подавляют активность транспортеров PIN и замедляют ростовые процессы (Omelyanchuk et al., 2016; Titapiwatanakun et al., 2009; Vieten et al., 2005). Актуальным является исследование концентрационно-зависимых механизмов действия ауксина на свои транспортёры, а также работа этих механизмов при неблагоприятных условиях среды. Для этой цели в данном проекте планируется решить следующие задачи: 1) Экспериментальное исследование паттернов экспрессии PIN в корне Arabidopsis thaliana после обработки различными концентрациями ауксина; в норме и при пониженных температурах. 2) Биоинформатический анализ генных сетей регуляции экспрессии PIN транспортеров. Поиск и предсказание регуляторов экспрессии PIN. 3) Компьютерный анализ и моделирование экспрессии PIN в корне и его эффектах на распределение ауксина в норме и при пониженных температурах. Новизной проекта является интегрированный экспериментально-компьютерный подход. Наличие обратных связей в пути передачи сигнала ауксина сильно влияет на результат работы системы в целом, поэтому в данной области широко используются методы математического моделирования (Goh et al., 2014; Band et al., 2014). В данной работе результаты экспериментальной работы будут проверяться в математических моделях, а предсказания модели, будут поводом для нового раунда экспериментальной проверки. Будут использованы математические модели, развитые ранее для описания транспорта ауксина в корне (Mironova et al., 2012), учитывающие концентрационно-зависимые особенности регуляции ауксином экспрессии PIN. Модели будут дорабатываться с учетом данных биоинформатического анализа. На основе анализа литературных данных и в результате исследования полногеномных данных по экспрессии генов в корне Araidopsis thaliana при различных условиях выращивания, будут реконструированы генные сети регуляции экспрессии генов PIN. Будут изучены промоторные области PIN с целью выявления потенциальных цис-регуляторных элементов (с использованием ТОМТОМ и данных O’Malley et al., 2016). В результате будут предсказаны потенциальные регуляторы экспрессии PIN. Вклад потенциальных регуляторов в изменение распределения ауксина будет исследоваться в математических моделях и в экспериментах на мутантах по этим генам. Мутантные растения Arabidopsis thaliana будут заказаны из коллекции NASC. Так как различные концентрации ауксина по разному влияют на экспрессию своих транспортеров, будет предпринят поиск концентрационно-зависимых регуляторов такого механизма с использованием полногеномных данных по действию различных концентраций ауксина на проросток арабидопсиса (из базы данных GEO). Экспериментальная работа будет проведена в сотрудничестве с коллегами из лаборатории Чен Ксу (Сингапур) и Мироновой Виктории (ИЦиГ, Новосибирск). Будут исследованы паттерны экспрессии PIN1, PIN2-PIN4, PIN7 в корне Arabidopsis thaliana в норме, при холодовом стрессе, и в мутантах по потенциальным регуляторам. В мутантах и при холодовом стрессе экспрессия PIN и его потенциальных регуляторов будет также изучена методом qPCR. Практика современной селекции показала, что консервативности генных сетей растений достаточно, чтобы переносить знания, полученные на модельных растениях с модификациями или даже без них в селекцию и агротехнику других видов. Устойчивость к низким температурам и засухе связана с транскрипционными факторами DREB, открытыми впервые у арабидопсиса (Liu et al., 1998). Экспрессия этих генов под конститутивными промоторами вызывает задержку роста у арабидопсиса, риса, кукурузы и других видов (Petolino and Davies, 2013). В данной работе мы не только выберем кандидатные гены- регуляторы распределения ауксина, но и изучим представленность их гомологов в других видах растений, а также изучим распределение полиморфизмов в гомологичных генах у различных экотипов арабидосписа, в том числе отличающихся по устойчивости к пониженным температурам.

Ожидаемые результаты
В результате работы по проекту будут впервые реконструированы генные сети регуляции экспрессии PIN транспортеров Arabidopsis thaliana. Особое внимание будет уделено путям авторегуляции ауксином своих транспортеров. Ранее нами было показано, что наличие положительных и отрицательных обратных связей в регуляции экспрессии PIN транспортеров ауксина обеспечивают формирование стабильных паттернов распределения ауксина в корне (Mironova et al., 2012; Omelyanchuk et al., 2016; Коврижных, автореферат диссертации), однако регуляторы этих обратных связей были неизвестны. Для того чтобы использовать эти знания на практике (например, в сайт-направленной селекции), необходимо идентифицировать непосредственных регуляторов, что планируется провести в данной работе с использованием интегрированного экспериментально-компьютерного подхода. На основе анализа полногеномных данных (RNA-Seq и микрочип данные по обработке ауксином; Chip-Seq данные с ключевыми транскрипционными факторами), будут предсказаны кандидатные гены-регуляторы экспрессии PIN на транскрипционном и пост-транскрипционном уровнях. В том числе те, которые опосредуют концентрационно-зависимую регуляцию экспрессию PIN. В компьютерных экспериментах с существующими математическими моделями (Mironova et al., 2012) будет исследован механизм действия пониженных температур на распределение ауксина в корне, а также роль потенциальных регуляторов в этом процессе. Роль некоторых генов-кандидатов в регуляции экспрессии PIN будет изучена с использованием мутантных линий Arabidopsis. В экспериментах будут проверены и другие предсказания математического моделирования. Полученные результаты могут иметь важнейшее научно-практическое значение. Понимание механизмов адаптации к холоду позволит в будущем разработать эффективные меры защиты от холодового стресса культурных растений, которые выращивают на территории России.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Проведен анализ экспрессии PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, PIN7 в корнях 6-дневных проростков Arabidopsis thaliana в линиях PIN::PIN-GFP и PIN::GUS в норме, при обработках различными концентрациями ИУК (низкая, средняя, высокая) при фиксированном времени, при обработке 4С во временной динамике. Для каждого из PIN мы зафиксировали статистически-достоверные различия между разными репортерными линиями, между разными доменами корня, между разными концентрациями ауксина, между разными временными точками. Эти данные будут использованы для моделирования действия холода на распределение ауксина в корне. Биоинформатический анализ промоторных последовательностей генов PIN1, PIN2, PIN3, PIN4, PIN7 с использованием данных DAP-Seq для 512 транскрипционных факторов, выявил список потенциальных регуляторов транскрипции PIN. В промоторах трех генов PIN выявлены экспериментально-показанные районы связывания регулятора ответа на ауксин ARF5. Предсказаны ТФ, которые могут осуществлять вторичный ответ на ауксин и регулировать PIN через ауксин опосредованно. Впервые выявлена концентрационно-зависимая регуляция экспрессии PIN1, PIN2, PIN4, PIN7 в корне на салициловую кислоту (СК), гормон стресса растений. Предсказано, что концентрационно-зависимая экспрессия PIN обеспечивает дифференциальную реакцию корня растения на низкие и высокие дозы СК (Pasternak et al., Plant Physiology, Under review). Найдены ауксин-чувствительные элементы специфически связывающие ARF5 в промоторе WOX4. В результате совместной работы был выявлен механизм регуляции ауксином радиального роста стабля путем модулирования активности WOX4 транскрипционным фактором ARF5 (Brackmann et al., Nature Comm, 2018). В математической модели с реалистичным клеточным ансамблем, имитирующим кончик корня, впервые показана ауксин-зависимая самоорганизация паттернов экспрессии всех пяти транспортеров ауксина (ранее было продемонстрировано только для трех PIN белков). Модель будет использована для исследования действия разнообразных стрессов (холод, жара, обработка СК) на меристему корня.

 

Публикации

1. - The Plant Hormone Auxin Coordinates Wood Formation AKSON Russian Science Communication Association, April 4, 2018 (год публикации - ).

2. - Найден новый белок-регулятор развития древесины Издание Сибирского Отделения Российской Академии Наук "Наука в Сибири", Опубликовано 16 апреля 2018 (год публикации - ).

3. - Ученые нашли генетический механизм, регулирующий рост древесины Интерфакс Россия, Опубликовано 16 апреля 2018 года в 10:47 (год публикации - ).

4. Брокманн, Ци, Геберт, Жуанна, Шламп, Грюнвальд, Валнер, Новикова, Левицкий, Агусти, Санчес. Spatial specificity of auxin responses coordinates wood formation Nature Communications, 9(1):875 (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
За прошедший отчетный период мы получили новые данные о действии ауксина на своих транспортеров PIN в условиях холодового стресса. А именно, провели мета-анализ полногеномных данных и предсказали более десяти наиболее вероятных регуляторов транскрипции PIN, опосредующих ответ на холод и ответ на ауксин. Среди предсказанных регуляторов мы нашли, что RVE1, DOF1.8 и DOF2.2 являются общими для всех PIN. Предсказано, что механизм активации экспрессии PIN ауксином ассоциирован с подавлением активности их репрессоров. Анализируя списки ДЭГ в ответ на обработку ауксином и воздействие холодом мы определили специфичных регуляторов экспрессии для каждого PIN и механизм их влияния на экспрессию (активация или подавление). Именно эти гены скорее всего опосредуют концентрационно-зависимую регуляцию экспрессии PIN ауксином. Кроме того, на основе данных мета-анализа мы реконструировали генные сети регуляции экспрессии PIN в ответ на обработку ауксином и воздействие холода. В этих сетях мы отметили большое числом прямых и косвенных взаимодействий между ее участниками, что создает сложный регуляторный контур образуемый всеми генами определенными в результате нашего мета-анализа. Анализ консервативности промотора PIN1 методом филогенетического футпринтинга выявил четыре А/Т богатые консервативные области. В консервативных областях были идентифицированы последовательности, похожие на сайты связывания ТФ, предсказанных в результате анализа данных DAP-seq, например ATHB5 и RVE1. Провели серию in silico экспериментов по изучению механизмов поддержания доменов экспрессии PIN белков в кончике корня и их изменение в ответ на обработку разными дозами салициловой кислоты. В математической модели было показано, что различия в экспрессии PIN в ответ на низкие и высокие дозы салициловой кислоты обусловливает перераспределение ауксина, что в свою очередь приводит к различным морфо-физиологические реакциям. А именно, разрастанию апикальной меристемы корня и появлению дополнительных клеточных делений во внешних тканях корня при воздействии низких доз салициловой кислоты и уменьшению размеров надземной части растения при воздействии высоких доз. С помощью математической модели было предсказано, что обработка растения низкими дозами салициловой кислоты может защитить от губительного воздействия холода. По результатам исследования воздействия салициловой кислоты была опубликована статья Pasternak et al., Plant Physiology, 2019 и сделан доклад на международной конференции “Plant Organ Growth Symposium”.

 

Публикации

1. Пастернак Т., Грут Э., Казанцев Ф.В., Тель В., Омельянчук Н.А., Коврижных В.В., Пальме К., Миронова В.В. Salicylic acid affects root meristem patterning via auxin distribution in a concentration-dependent manner Plant Physiology, 00130 (год публикации - 2019).

2. Савина М.С., Казанцев Ф.В., Миронова В.В. What can we learn about stress-induced root growth by mathematical modeling of auxin distribution? Proceedings of the Plant Organ Growth Symposium, - (год публикации - 2019).

3. Савина М.С., Хонг Дж.Х., Ксу Дж., Миронова В.В. Mathematical modeling of the effects of chilling stress on Arabidopsis thaliana root stem cell niche Proceedings of the International Symposium “Auxins and Cytokinins in Plant Development ... and Interactions with Other Phytohormones”, - (год публикации - 2018).


Возможность практического использования результатов
Предсказанный в математической модели механизм влияния различных концентраций экзогенной СК на PIN опосредованное поддержание распределения ауксина может использоваться в сельском хозяйстве для создания методики обработки растений салициловой кислотой с целью уменьшения стрессового воздействия холода