Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В процессе реализации первого этапа проекта все запланированные работы выполнены в полном объеме. В проекте использован комплекс современных экспериментальных подходов, включающих применение экспериментально-физиологических (мониторинг двигательной активности), общеморфологических (окраска гематоксилин-эозином)), иммуногистохимических и иммуноцитохимических (выявление широкого спектра нейрональных и глиальных маркеров) и биохимических (иммуноферментный анализ, выявление супероксиддисмутазы, определение пролиферации клеток (МТТ-тест)) методов исследования. Использованы культуры микро- и астроглиальных клеток, метод проточной цитометрии, а также световая и конфокальная лазерная сканирующая микроскопия. В настоящем исследовании мы определяли особенности реализации нейропротекторного действия докозагексаеновой кислоты (ДГК) (препарат получен из отходов переработки пищеварительной железы кальмара Berryteuthis magister по оригинальной методике в лаборатории авторов проекта, патент РФ № 2013129741 от 29.06.2013 «Способ получения докозагексаеновой кислоты») у крыс с моделью компрессионной травмы спинного мозга. Для моделирования компрессионной травмы спинного мозга проводили ламинэктомию на уровне Т9 позвонка, затем производили сжатие спинного мозга сосудистой клипсой с силой 50 г в течение 1 мин., данная манипуляция приводит к гибели нейронов и глиальных клеток, а также к разрушению восходящих и нисходящих спинномозговых трактов, сопровождаясь развитием моторного и вегетативного дефицита в нижних сегментах спинного мозга. Работа выполнена на 42 самках крыс линии Вистар. Животные были разделены на три группы: «Ложнооперированные» - крысы только с ламинэктомией, группа «Травма» - животные с моделью компрессионной травмы спинного мозга и группа «Травма+ДГК» - животные с травмой, получающие ДГК в дозе 45 мг/кг, препарат вводили подкожно в течение 3 недель после операции. Мониторинг двигательной активности осуществляли с использованием патентованной шкалы ВВВ (Basso, Beattie, Bresnahan, locomotors rating scale), включающей набор из 21 критерия качественной и количественной оценки движений в задних конечностях животных. Анализ локомоторной активности показал, что у животных с компрессионной травмой при терапии ДГК формируется не только более раннее (2‑я неделя), но и более полное восстановление функций нижних конечностей. У животных обеих групп восстановление вегетативных функций наблюдалось в среднем на 9 день после операции. В группе ложнооперированных животных к 7-му дню после операции показатель BBB составил 21 балл и сохранялся на данном уровне на протяжении всего наблюдения, дефицит вегетативных функций не наблюдался. Предыдущие работы свидетельствуют о том, что терапия ДГК после травмы спинного мозга может оказывать нейропротекторное действие, по крайней мере частично, посредством отрицательной модуляции экспрессии белка циклооксигеназы-2 и путем уменьшения продуктов перекисного окисления. В нашем исследовании на культуре клеток астро- и мкроглии показано, что добавление ДГК приводит к увеличению экспрессии антиоксидантного фермента супероксиддисмутазы. В целом, в настоящем исследовании мы предположили, что препарат ДГК восстанавливает двигательные функции у животных с компрессионной травмой спинного мозга путем модуляции астроглиальной, микроглиальной, пролиферативной и антиоксидантной активности, а также за счет усиления экспрессии микро- и астроглиоцитами виментина, запуска процессов ремиелинизации и восстановления катехоламинергических аксонов. Для гистологической и иммуногистохимической характеристики нейро-глиальной активности в острый и хронический посттравматический период сбор материала осуществляли на 7 и 35 день после операции. С целью охарактеризовать повреждающее действие травмы спинного мозга в острый посттравматический период и на этапах реабилитации мы провели иммуногистохимическое картирование основного белка миелина (MBP) и тирозингидроксилазы (TH, маркер катехоламинергических аксонов). При выявлении MBP установлено, что ДГК индуцирует процессы ремиелинизации как в центре поражения, так и в ростральном и каудальном сегментах спинного мозга через пять недель после операции. В то же время применение препарата ДГК после травмы обеспечивает сохранность и восстановление аксонов на 7 и 35 день после операции. Что может считаться дополнительным нейропротективным ресурсом ДГК в условиях повреждения центральной нервной системы. Сразу после травмы (острая фаза) астроциты на участке повреждения и вокруг него начинают активно пролиферировать, подвергаются морфологическим изменениям и усиливают экспрессию внеклеточных белков, в этот момент они являются основными компонентами глиального рубца. В нашем исследовании при травме наблюдается увеличение активности реактивных астроцитов в ростральном и каудальном сегментах спинного мозга. Однако, терапия ДГК наряду с улучшением показателей локомоторной активности животных, запуском процессов ремиелинизации и восстановления катехоламинергических аксонов приводит к еще более выраженному астроглиозу через 7 и 35 дней после операции. Исходя из данных литературы, повышение уровня активности астроцитов может быть связано с возможным защитным действием, направленным на рядом расположенные нейроны и их аксоны. Также в настоящем исследовании мы установили, что терапия ДГК животных после повреждения спинного мозга, наряду с выраженным астроцитозом, приводит к усилению экспрессии виментина на 7 и 35 день после операции. Параллельно с этим в экспериментах in vitro на культуре астроглиоцитов с помощью метода иммуноферментного анализа, мы показали, что введение ДГК приводит к увеличению экспрессии внутриклеточного виментина практически в два раза. Ранее установлено, что увеличение экспрессии виментина астроцитами, который в данном случае функционирует как фактор роста аксонов в конечном итоге приводит к росту 5-HT-положительных аксонов за пределы глиального шрама и восстановлению функции задних конечностей у мышей с травмой спинного мозга. В совокупности эти данные демонстрируют, что экспрессия виментина может быть увеличена в реактивных астроцитах при действии ДГК, что способствует восстановлению аксонов и улучшению двигательной активности после компрессионной травмы спинного мозга. С целью охарактеризовать уровень активности микроглии/макрофагов на 7 и 35 день после компрессионной травмы спинного мозга мы провели иммуногистохимическое выявление маркера iba-1. На 35 день после операции в группе с введением ДГК наблюдалось выраженное усиление активности микроглии/макрофагов. Подобное явление мы зарегистрировали и на культуре клеток микроглии с помощью метода проточной цитометрии, где при добавлении 1μM ДГК спустя 4 дня наблюдается усиление процессов пролиферации. Данная парадоксальная, на первый взгляд, ситуация протекает на фоне восстановления двигательной активности, усиления процессов ремиелинизации и восстановления катехоламинергичсеких аксонов после травматического повреждения спинного мозга. Одним из возможных объяснений данного явления следует считать биохимическую и функциональную гетероморфность микроглиальных/макрофагальных клеток. Последние исследования в данной области демонстрируют, что функциональное состояние активированной и реактивной микроглии/макрофагов имеет двойственную функциональную организацию, представленную провоспалительной (М1-тип, классический) и антивоспалительной (М2-тип, альтернативный) функциями. Именно поэтому далее мы решили дифференцировать М1- и М2-тип микроглии/макрофагов. Микроглия/макрофаги М1-фенотипа экспрессирует провоспалительные молекулы, которые включают фактор некроза опухоли (TNF), интерлейкин-1β (IL-1β), интерферон-γ (IFN-γ) и оксид азота (NO), а также маркеры CD86 и CD68. В нашей работе мы исследовали уровень активности М1-типа микроглии/макрофагов после компрессионной травмы спинного мозга и терапии ДГК путем картирования маркера клеточной поверхности CD86. Установлено, что к 35 дню после травмы, когда воспалительные процессы несут на себе деструктивную функцию, введение ДГК приводит к снижению уровня активности CD86-позитивной микроглии/макрофагов. Напротив, микроглия/макрофаги М2-типа экспрессирует анти-воспалительные молекулы, такие как IL-4, IL-10 и маркеры клеточной поверхности CD163 и CD206, а также оказывает нейропротекторное действие. Кроме того, реализация фагоцитарной активности микроглия/макрофагальными клетками многими авторами рассматривается как важный элемент восстановления и репарации тканей после повреждения. В нашем исследовании на 7 и 35 день после травмы терапия ДГК приводит к усилению активности CD163-позитивных макрофагов, что, очевидно, в конечном итоге, является решающим фактором в восстановлении нервных волокон и двигательной активности животных. Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что ДГК обладает анти-воспалительным и нейропротективным действием, реализуемым в течение посттравматического процесса в центральной нервной системе, что свидетельствует о ее высоком терапевтическом потенциале. В то же время, многие механизмы реализации нейропротективного и регенераторного действия ДГК нуждаются в дополнительных детальных исследованиях, способных обеспечить его внедрение в клиническую практику для лечения посттравматической патологии центральной и периферической нервной системы. В результате реализации первого этапа проекта опубликована статья в журнале Neuroscience Letters (Impact factor 2.180), еще одна рукопись направлена на рецензирование в Journal of Neuroimmunology (Impact factor 2.720). Данные, опубликованные в журнале Neuroscience Letters, отражены на портале медицинских услуг Доктис.ру со ссылкой на поддержку РНФ: https://www.doctis.ru/info/news/2018/3/27/ribii-jir-pomojet-lecit-travmi-spinnogo-mozga/

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В процессе реализации второго этапа проекта (2018-2019 гг) все запланированные работы выполнены в полном объеме. В работе использован комплекс современных экспериментальных подходов, включающих применение экспериментально-физиологических (тестирование параметров развития нейропатического болевого синдрома), общеморфологических (окраска гематоксилин-эозином), иммуногистохимических (выявление широкого спектра нейрональных и глиальных маркеров) и биохимических (иммуноферментный анализ, определение цитотоксичности, выявление оксида азота, активных форм кислорода и лизосомальной активности) методов исследования, методы культивирования микроглиальных и макрофагальных клеток, а также световую и конфокальную лазерную сканирующую микроскопию. В настоящем исследовании проведено визуальное и инструментальное тестирование параметров болевого синдрома у экспериментальных животных с моделью хронической боли и терапией докозагексаеновой кислотой (ДГК) и алкил-глицериновыми эфирами (АГЭ). В результате охарактеризована выраженность моторной дисфункции, уровня развития гипералгезии и холодовой аллодинии на разных сроках после операции и терапии исследуемыми препаратами. Системное введение ДГК и АГЭ животным с повреждением периферического нерва снижает интенсивность и сроки реализации нейрогенного болевого синдрома и препятствует развитию дистрофических изменений в тканях денервированной конечности. Была выявлена динамика морфо-химических изменений в исследуемых популяциях глиальных и нейрональных клеток дистального сегмента поврежденного седалищного нерва и задних рогов спинного мозга на отдельных этапах структурных и пластических перестроек центральной и периферической нервной системы при болевой патологии. Установлено, что ДГК снижает активность патофизиологических, патохимических и патоморфологических процессов, а также препятствует деградации основного белка миелина в дистальном сегменте поврежденного седалищного нерва, и стабилизирует уровень активности астроглии и SP-позитивных нервных волокон в поверхностных пластинах задних рогов спинного мозга. В целом, ДГК обладает комплексным влиянием на течение посттравматического процесса в центральной и периферической нервной системе, что свидетельствует о ее высоком терапевтическом потенциале. Также представлена обширная иммунногистохимическая характеристика дистального сегмента поврежденного седалищного нерва. В результате установлено, что лигирование и перерезка седалищного нерва приводят к местному воспалительному ответу, который вызывает дезорганизацию нервных волокон, нарушение иннервации периферических тканей, увеличение активности GFAP- и виментин-позитивных структур, деградацию S100β-позитивных Шванновских клеток и активацию провоспалительных CD86- и антивовоспалительных CD163-позитивных макрофагов. Наблюдаемые процессы коррелируют с увеличением активности микро- и астроглии в вентролатеральном моторном ядре передних рогов спинного мозга, что свидетельствует об активном участии моторного ядра в патофизиологическом процессе после повреждения седалищного нерва. В другой группе экспериментов, установлена иммуностимулирующая активность алкил-глицериновых эфиров в экспериментах in vitro. Так, АГЭ в концентрациях 0.1-5 мкг/мл является сильным стимулятором лизосомальной активности, повышает уровень образования активных форм кислорода, синтез NO и интерлейкина-6 в культуре мышиных макрофагов Raw 264.7. Таким образом, АГЭ можно рассматривать в качестве мощного иммуностимулятора, оказывающего комплексное влияние на активность макрофагов в относительно большом не цитотоксическом диапазоне концентраций. В перспективе, учитывая низкую токсичность данного соединения, установленную ранее в экспериментах in vivo и полученные нами результаты in vitro, данный препарат можно будет использовать для терапии различных бактериальных инфекций, онкологических заболеваний и иммунодефицитных состояний. Также было проведено фармакологическое исследование алкил-глицериновых эфиров при терапии аффективных расстройств вызванных нейропатическим болевым синдромом. Нейропатическая боль, возникающая вследствие нарушений в периферической нервной системе, часто вызывает развитие патологических процессов центральной нервной системы. Наше исследование показало, что вызванные болью поведенческие изменения основаны на нейровоспалительном ответе, который охватывает в первую очередь лимбическую систему, включая гиппокамп, который участвует в нейропластичности, поведении и познании. Таким образом, эффективным способом устранения когнитивных и эмоциональных последствий нейропатической боли, является направленное действие на функциональную активность резидентных макрофагов мозга. В тоже время АГЭ оказывает влияние на функции клеток микроглии как in vitro, так и in vivo. Мы предполагаем, что АГЭ предотвращают патологические эффекты, вызванные нейропатической болью, включая активацию провоспалительной микроглии, нарушение нейрогенеза и памяти. Однако результаты экспериментов in vitro подчеркивают сложность механизмов, лежащих в основе фармакологического действия АГЭ. Этот факт указывает на значительный терапевтический потенциал АГЭ и перспективность его дальнейшего изучения в качестве препарата для лечения последствий нейропатической боли. В результате реализации второго этапа проекта опубликована статья в журнале International Journal of Molecular Medicine (IF 2.784 (Q1)) и приняты к публикации две статьи в журнал Natural Product Communications (IF 0.809) и Нейрохимия (IF 0.404). Также по результатам первого этапа проекта была дополнительно опубликована статья в журнале Acta Histochemica (IF 1.652). По результатам проекта один из основных исполнителей гранта принял участие в конференции ASCB|EMBO (San Diego, США) со стендовым докладом.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В процессе реализации третьего этапа проекта все запланированные работы выполнены в полном объеме. В проекте использован комплекс современных экспериментальных подходов, включающих применение экспериментально-физиологических, общеморфологических, иммуногистохимических, иммуноцитохимических (выявление широкого спектра нейрональных и глиальных маркеров) и биохимических (иммуноферментный анализ) методов исследования, методы получения и культивирования микроглиальных клеток, метод Гольджи-Кокса, а также световой и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. В настоящей работе использовали модель хронической нейропатической боли путем наложения трех лигатур на седалищный нерв правой задней лапы крысы. В ходе исследования проведен комплексный анализ клеточных и молекулярных механизмов, обеспечивающих вовлеченность нейроглии в модуляцию болевой импульсации, а также в процессы пролиферации и нейрогенеза. При этом на данном этапе реализации проекта основное внимание уделяется герминативным центрам (гиппокамп) головного мозга. Впервые с использованием данной экспериментальной модели, а также микроглиальной культуры клеток проведено изучение механизмов реализации нейропротекторного и антивоспалительного действия комплекса алкил-глицериновых эфиров (АГЭ) (препарат получен из отходов переработки кальмара Berryteuthis magister в лаборатории авторов проекта). При повреждении периферической нервной системы и терапии АГЭ проведено визуальное и инструментальное тестирование параметров двигательной активности и когнитивных функций экспериментальных животных. В результате установлено, что нейропатический болевой синдром сопровождается развитием неврологических расстройств (нарушение памяти, снижение когнитивных функций, тревожность). Системное введение АГЭ снижает интенсивность и сроки реализации нейрогенного болевого синдрома, а также препятствует нарушению долговременной и рабочей памяти у животных с повреждением периферического нерва. В нашей работе впервые показано, что болевая импульсация поступающая в гиппокамп вызывает нейропластические изменения и приводит к нарушению в формировании нейритов, длине дендритов и морфологии дендритных шипиков. Кроме того, изменения в морфологии дендритов в субрегионах гиппокампа вовлеченных в обработку болевой информации различны из-за анатомической и функциональной неоднородности гиппокампа. Подробные механизмы установленных морфологических изменений еще предстоит изучить, однако установлено, что ключевую роль играет белок Arc, участвующий в глутаматергической передаче и обеспечивающий связь между синаптической активностью и структурно-функциональной пластичностью нейронов. Кроме того в настоящем исследовании показано, что вызванные болью поведенческие изменения основаны на нейровоспалительном ответе, который охватывает в первую очередь лимбическую систему, включая гиппокамп, который участвует в нейропластичности, поведении и познании. Таким образом, эффективным способом устранения когнитивных и эмоциональных последствий нейропатической боли, является направленное действие на функциональную активность микроглии головного мозга. При этом введение АГЭ способствует разрешению патологических процессов, вызванных нейропатической болью, включая активацию провоспалительной микроглии, нарушение нейрогенеза и памяти. Полученные результаты указывают на значительный терапевтический потенциал АГЭ и перспективность его дальнейшего изучения в качестве препарата для терапии нейропатической боли. Комплексный подход в оценке нейрональных и глиальных популяций при повреждении периферической нервной системы отличает данное исследование от других и способствует получению приоритетных данных о фундаментальных механизмах работы мозга при развитии нейропатического болевого синдрома. Результаты исследования позволяют по-новому взглянуть на патогенез некоторых заболеваний центральной и периферической нервной системы и сформировать основу для направленного поиска новых биологически активных препаратов с нейро- и глиотропной активностью. Кроме того экспериментально охарактеризован новый препарат на основе алкил-глицериновых эфиров, установлена его способность модулировать нейротрансмиттерную и глиальную активность, а также выраженность процессов воспаления в герминативных центрах головного мозга. Полученные данные сопоставимы по уровню и научной новизне с результатами исследований проводимых в ведущих российских и зарубежных научных центрах. Результаты исследований представлены в виде оригинальных статей в журнале International Journal of Molecular Medicine (IF 2.928 (Q1)), Journal of Pain Research (IF 2.236 (Q1)) и Cells Tissues Organs (IF 1.333). Кроме того, ряд данных представлен со стендовым докладом на профильной конференции IBRO (Daegu, Южная Корея).