Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Впервые экспериментально определены белки-партнёры гомологов ключевого бактериального белка деления FtsZ в микоплазменной клетке. Методами ко-иммунопреципитации с использованием специфических кроличьих поликлональных антител, полученных нами, и со-осаждения за стреп-таг было установлено, что белок FtsZ Acholeplasma laidlawii (микоплазмы, патогенной для растений) взаимодействует с шаперонами (Hsp20, DnaK), факторами элонгации (EFTu, EFG), транскрипционным регулятором семейства XRE, а также с ферментами – участниками метаболических путей (формат-C-ацетилтрансферазой, фитоен десатуразой). FtsZ M.gallisepticum (патогена домашней птицы) взаимодействует с фактором элонгации EFTu, липопротеином А, АТФ-синтазой, белком-транспортером OppA, а также РНК-полимеразой. Интересно отметить, что среди идентифицированных белков нет гомологов других известных бактериальных белков, вовлечённых в процесс деления, хотя гены некоторых из них есть в геномах исследуемых микоплазм (например, FtsK, FtsA, SepF). Что интересно, FtsZ A.laidlawii и M.gallisepticum взаимодействуют с несколькими цитоскелет-подобными белками – например, EFTu и DnaK. Это может указывать на их вовлечение в формирование сложного каркаса микоплазменной клетки. Методами ко-иммунопреципитации и со-осаждения за стреп-таг показано, что рекомбинантные белки FtsZ A.laidlawii и M.gallisepticum взаимодействуют с белком FtsZ E.coli, что косвенным образом указывает на традиционную функциональную активность FtsZ (участие в процессе деления) в клетках самих микоплазм. Кроме того, FtsZ A.laidlawii взаимодействует с белком MukB, который играет ключевую роль в сегрегации хромосом. Это говорит о потенциальном взаимодействии FtsZ A.laidlawii с системой сегрегации нуклеоидов в клетке микоплазмы. FtsZ микоплазм взаимодействуют также с несколькими шаперонами E.coli. С шапероном DnaK взаимодействует как FtsZ A.laidlawii, так и FtsZ M.gallisepticum. Помимо DnaK, FtsZ M.gallisepticum коэлюирует с ClpB и GroEL. Возможно, FtsZ M.gallisepticum требуется помощь шаперонов для правильного сворачивания при продукции в клетке E.coli. По данным ко-иммунопреципитации и in vivo визуализации FtsZ M.gallisepticum с помощью флуоресцентного белка видно, что этот белок проявляет сходное поведение и в клетках самой M.gallisepticum. Данное наблюдение требует дальнейшего изучения. FtsZ M.gallisepticum взаимодействует также с ДНК-гиразой E.coli. Основываясь на гомологии ДНК-гираз M.gallisepticum и E.coli, можно предположить, что FtsZ M.gallisepticum действительно участвует в предсказанном взаимодействии с ДНК-гиразой M.gallisepticum. Выявлено также взаимодействие FtsZ A.laidlawii с белками OmpF (белок наружной мембраны) и SecA (транслоказа полипептидов). Из литературы известно, что SecA взаимодействует с белком FtsZ E.coli, однако роль и механизмы этого взаимодействия не ясны. В рамках проекта мы планируем проверить взаимодействие FtsZ с рядом идентифицированных нами белков-партнёров при помощи бактериальной двухгибридной системы. Нам не удалось идентифицировать ни один из белков систем позиционирования Z-кольца, с которым бы взаимодействовали белки FtsZ A.laidlawii и M.gallisepticum в клетках E.coli. Ни метод ко-иммунопреципитации, ни метод со-осаждения за стреп-таг не позволили показать взаимодействие FstZ микоплазм с белками нуклеоидной окклюзии и Min-системы E.coli, поэтому изучение белок-белковых взаимодействий данными методами в штаммах с нарушенными системами позиционирования Z-кольца в клетках E.coli было лишено смысла и не проводилось. Чтобы проверить, взаимодействует ли данный белок с белками нуклеоидной окклюзии и Min-системы E.coli, была осуществлена визуализация структур, формируемых FtsZ A.laidlawii как в штамме E.coli, близком к дикому типу (Rosetta), так и в штаммах с нарушенными системами нуклеоидной окклюзии или Min-системы. Различий в паттернах локализации FtsZ A.laidlawii во всех проверенных нами штаммах E.coli не выявлено. Следовательно, подобного взаимодействия нет. Ранее запланированных сроков (этап 2019-2020 гг), с использованием вектора pTn4001mini_Recipient-MCS-M5 (глобальный транспозон Tn4001) нами был создан штамм M.gallisepticum, содержащий в своём геноме ген белка слияния FtsZ с флуоресцентным белком mMaple2, позволяющий осуществить субдифракционную визуализацию белка FtsZ в живых клетках микоплазмы. Получены первые дифракционно-ограниченные и субдифракционные изображения структур, формируемых белком FtsZ в живых клетках M.gallisepticum. В дальнейшем мы планируем оптимизировать данную конструкцию путём использования нативного промотора гена ftsZ, а также проверить функциональность белка слияния. Экспериментально определены белки-партнеры для взаимодействия с малым белком теплового шока IbpA в клетках A.laidlawii в условиях температурного и окислительного стрессов. Идентификацию белков-партнеров проводили методом ко-элюции рекомбинантного белка IbpА с гистидиновым тагом на Ni-NTA сефарозе и иммунопреципитации нативного IbpА из клеточного экстракта A.laidlawii. Даже при оптимальных условиях наблюдали ко-элюцию большого количества белков, при этом количество белковых бэндов значительно увеличивалось с повышением температуры. Возможно, это связано с общим свойством мБТШ активироваться при нагревании. Интересно, что в условиях окислительного стресса наблюдали обратную картина – с повышением температуры количество коэлюированных белков снижалось. Этот факт позволяет заключить, что белок IbpА, по всей видимости, осуществляет протекцию белков только в условиях температурного стресса, а в присутствии окисляющего агента нарушается способность IbpA взаимодействовать с белками. Анализ физико-химических характеристик белков-партнёров IbpA показал, что, по сравнению с транслированным протеомом A.laidlawii, белки, коэлюирующиеся с IbpA, характеризуются в среднем более высокой молекулярной массой, при этом обладают более низким зарядом и гидрофобностью. Подобный подход представляется недостаточным для понимания механизма распознавания субстратов данным шапероном. В связи с этим было принято решение идентифицировать мотивы и домены IbpA, участвующие в распознавании белков-субстратов (дополнительная задача сверх плана, не заявленная ранее в проекте). Мы установили, что олигомеризация IbpA в клетках A.laidlawii происходит независимо от температуры культивирования. Чтобы оценить роль N- и С- концов белка IbpA в олигомеризации, сконструированы плазмиды для продукции мутантных белков с делециями в этих участках. Белки были экспрессированы в клетках E.coli и очищены до электрофоретической гомогенности. Оценка их олигомеризации показала, что мотивы на N-конце не участвуют в олигомеризации, а для формирования крупных олигомерных комплексов необходим С-концевой мотив. При этом белки с одновременными делециями С- и N-концов сохраняли способность к образованию ди-, три- и тетрамеров, вероятно за счет альфа-кристаллинового домена. Интересно, что при 4 °С белки с неполноценным N- или С- концом не олигомеризуются, формируя только низкомолекулярные агрегаты. При температуре выше 30 °С олигомеризация происходит без участия C-концевого мотива. При этом степень олигомеризации в двойных мутантах значительно увеличивалась с ростом температуры, возможно, благодаря «активации» альфа-кристаллинового домена. Исследовали шаперонные свойства мутантных белков в отношении различных белков (коммерческих и рекомбинантных, полученных нами ранее). Для глутаминсинтетазы, трансферина человеческого, сахаразы SacC B. subtilis, амилазы B. subtilis, каталазы бычьей и соевого ингибитора трипсина не наблюдалось денатурации белка в присутствии мБТШ. У TnrA B. subtilis, GlnR L. brevis, PotN L. brevis, миоглобина лошади и альбумина человеческого скорость денатурации в присутствии IbpA была снижена. В случае альбумина куриного и гемоглобина бычьего IbpA не предотвращал денатурацию. Этот факт свидетельствует, что IbpA способен избирательно проявлять свойства шаперона в отношении субстратов. Для всех белков были рассчитаны основные физико-химические свойства, однако их анализ не выявил статистически достоверных различий между группами белков, агрегацию которых IbpA полностью предотвращал, или эффект был слабый. При этом достоверная разница была установлена только в отношении молекулярной массы: IbpA с большей эффективностью предотвращал агрегацию крупных белков, что совпадает с полученными данными в экспериментах по ко-элюции. Также была отмечена тенденция к преимущественному взаимодействию с белками с изоэлектрической точкой 5.5 и с более отрицательно заряженными белками, что также соотносится с полученными ранее данными. В случае белков IbpA с делециями N- и C- концов на примере глутаминсинтетазы показано, что только в случае с удаленными обоими N- и C- концами наблюдалась денатурация как самого IbpA, так и глутаминсинтетазы. При этом делеция только одного мотива (или N-, или C-) сохраняла шаперонную активность IbpA. Интересно, что ранее для белка IbpA из кишечной палочки было показано, что делеции даже одного мотива приводят к полному подавлению шаперонной активности. Наши данные позволяют предположить, что N- и C-концевые мотивы IbpA A.laidlawii, в отличие от белка E.coli, способны компенсировать отсутствие друг друга и сохранять шаперонную активность белка в условиях повышенной температуры.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Малые белки теплового шока служат первой линией защиты клеток от стресс-индуцированной агрегации белков. Несмотря на значительные различия между аминокислотными последовательностями этих белков, их третичные структуры высококонсервативны у различных организмов от бактерий до млекопитающих, включая центральный альфа-кристаллиновый домен с N- и C-концевыми областями. В ходе выполнения этапа была дана функциональная характеристика N - и C-концевых доменов в мБТШ AlIbpA из A. laidlawii и показана их роль для проявления шаперон-подобной активности и формирования четвертичной структуры белка. N-конец AlIbpA содержит двойной WDPF-подобный мотив, который в других мБТШ необходим для олигомеризации и проявления шаперон-подобной активности. В то время как усечение N-конца обычно блокирует олигомеризацию мБТШ и их взаимодействие с белками-субстратами, удаление 12 или 25 N-концевых аминокислотных остатков AlIbpA или частичный мутагенез первого мотива W/FD/FPF не повлияли на способность AlIbpA к олигомеризации и связыванию инсулина. Кроме того, стабильность белка и способность предотвращать температурную агрегацию инсулина даже увеличились по сравнению с полноразмерным белком. Дальнейший анализ олигомеризации показал, что и AlIbpA∆N12, и AlIbpA∆N25 присутствуют в растворе преимущественно в форме фибрилл, в то время как полноразмерный белок представляет собой смесь 24-мерных глобул, фибрилл и белковых агломератов с преобладанием глобул. Аналогично, AlIbpAN11N12 присутствует преимущественно в виде глобул, состоящих из 24 мономеров с небольшой фракцией длинных фибрилл. Ранее было показано, что очищенные IbpA и IbpB из E. coli также присутствуют соответственно в виде фибрилл и огромных агломератов, в то время как в их смеси EcIbpB блокирует образование фибрилл белком EcIbpA. Поэтому можно предположить, что N-концевой домен AlIbpA действует как автоингибирующий мотив, который дополняет отсутствие IbpB и подавляет образование фибрилл, а также негативно регулирует шаперон-подобную активность белка. На С-конце AlIbpA расположен консервативный LEL-мотив, также участвующий в олигомеризации и шаперон-подобной активности мБТШ. Удаление С-конца AlIbpA полностью аннулировало шаперон-подобную активность белка, в то время как, в отличие от EcIbpA, взаимодействие с инсулином наблюдалось. Только удаление обоих N - и C-концов приводило к полному отсутствию как шаперон-подобной активности, так и связывания инсулина, подтверждая, что N-конец также участвует в связывании субстрата, в то время как шаперон-подобная активность, по-видимому, обеспечивается только С-концевым доменом. Со структурной точки зрения AlIbpA∆C14 был представлен преимущественно в виде глобул или их агрегатов, в то время как одновременные удаления как N -, так и C-концов приводили к низкоуровневой олигомеризации белка с образованием ди- и тетрамеров, вероятно, за счет самоолигомеризации альфа-кристаллинового домена. Эти данные позволяют утверждать, что N-конец, по-видимому, сдвигает олигомеризацию к форме глобулярной структуры, тем самым подавляя образование фибрилл, обеспечиваемое С-концевым доменом. Таким образом, наши данные демонстрируют нетривиальные особенности N-концевого домена мБТШ AlIbpA из A. laidlawii. N-конец обеспечивает образование 24-мерных глобул AlIbpA, а также ведет себя как автоингибитор и регулятор активности C-конца, который, в свою очередь, необходим для шаперон-подобной активности и олигомеризации белка в форме фибрилл. Кроме того, наши данные показывают четкую корреляцию между способностью AlIbpA предотвращать денатурацию инсулина и образованием фибрилл. В то время как полноразмерный белок присутствует в виде смеси агломератов, фибрилл и глобул, демонстрируя умеренную шаперон-подобную активность на инсулине, активность усеченных версий AlIbpA, не имеющих N-конца и представленных в растворе в виде фибрилл, значительно выше. Поэтому мы предполагаем, что конкуренция между N - и C-концами, по-видимому, за взаимодействие с альфа-кристаллиновым доменом управляет сдвигом четвертичной структуры белка в фибриллярную или глобулярную форму, тем самым представляя молекулярный механизм регуляции функции AlIbpA. За отчетный период были также выполнены исследования, направленные на идентификацию межбелковых взаимодействий с участием таких белков, как FtsZ и GapD M. gallisepticum, а также FtsZ, IbpA и Gap A. laidlawii. Взаимодействие между собой белков FtsZ и GapD M. gallisepticum методом перекрестного со-осаждения подтвердить не удалось. При этом были идентифицированы взаимодействия между белками FtsZ, IbpA и Gap A. laidlawii, однако в данном случае требуется дополнительная верификация этих взаимодействий методом бактериальной двухгибридной системы. Кроме того, нам удалось выявить несколько кандидатов на роль белков-партнеров для GapD в клетках M. gallisepticum и Gap в клетках A. laidlawii. Среди этих белков стоит выделить белок EFTu, который по предварительным данным взаимодействует с обоими указанными белками. По литературным данным, этот белок в других видах бактерий может участвовать в формировании цитоскелета, поэтому, с учетом установленной нами ранее как минимум для белка GapD M. gallisepticum способности формировать цитоскелет-подобные структуры, представляется интересным проверить независимым методом взаимодействие между белком EFTu и белками GapD и Gap. Это также планируется прояснить с помощью бактериальной двухгибридной системы. Для работы с двугибридной системой нами был сконструирован штамм с делетированной аденилатциклазой, а также (с опережением плана работ) ряд плазмид с генами слияния одного из двух доменов аденилатциклазы с несколькими белками интереса, в том числе FtsZ, FtsK, FtsA, IbpA и других. Были исследованы физико-химические свойства белков FtsZ A. laidlawii и M. gallisepticum и белка GapD M. gallisepticum. Среди этих белков только для FtsZ A. laidlawii было достоверно показано формирование филаментов, которые, по-видимому, являются полимерами данного белка. В то же время, для всех указанных белков была показана способность формировать агрегаты. Ни для одного из белков не удалось продемонстрировать значимый уровень ГТФазной активности, кроме контрольного белка FtsZ E. coli, не содержащего аффинные таги. Возможно, очищенные нами рекомбинантные белки являются недостаточно функциональными, в частности, из-за наличия у них аффинных тагов для выделения. Кроме того, мы предполагаем, что из-за возможной ошибки в аннотировании гена ftsZ M. gallisepticum выделяемый нами белок имеет “лишний” N-концевой пептид (104 аминокислоты), что может приводить к его необычно высокой для предсказанного цитоплазматического белка склонности к образованию агрегатов. На следующем этапе выполнения проекта будут получены и протестированы функциональные варианты белков FtsZ. Пока же для прояснения вопроса о возможной полимеризации белка FtsZ A. laidlawii в клетках микоплазмы была выполнена задача сверх плана: были получены мутантные формы FtsZ A. laidlawii без N-конца (18 аминокислот), без C-конца (удаление участка после 315 аминокислоты), без обоих концов и с аминокислотной заменой в позиции А110Т. Была оценена способность мутантных форм FtsZ к полимеризации in vitro и ГТФазная активность. Все мутанты формировали агрегаты независимо от присутствия ГТФ в буфере для полимеризации, кроме FtsZ A. laidlawii без N-конца, и не проявляли какой-либо активности. В клетках E. coli FtsZ без C-конца нарушает деление клеток, а другие мутантные формы – нет. Был получен штамм M. gallisepticum с эндогенно-экспрессируемым флуоресцентно-меченым белком FtsZ, ген которого находится под контролем нативного промотора. Этот штамм должен позволить разобраться в роли белка FtsZ в M. gallisepticum. После верификации данного штамма планируется выяснить, какие структуры формирует FtsZ в клетках этого вида, а также проанализировать уровень экспрессии и его стохастичность на уровне одиночных клеток. В настоящий момент проверена стохастичность экспрессии флуоресцентного белка mMaple2, находящегося под контролем различных промоторов M. gallisepticum и установлен её высокий уровень независимо от используемого промотора.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На третьем этапе реализации проекта оценили шаперонную активность полноразмерного белка IbpA Acholeplasma laidlawii (AlIbpA), а также его мутантных и усечённых форм, после сшивки глутаральдегидом по изменению температуры полуплавления самих белков и их смеси с модельным субстратом. Сшивка глутаровым альдегидом резко снижает температурную стабильность и шаперонную активность полноразмерного белка AlIbpA. По всей видимости, это является следствием отсутствия возможности белка принять активную фибриллярную форму. При этом шаперонная активность белков, изначально находящихся в форме фибрилл (ΔN12, ΔN25, SEPΔN25), не падает. Кроме того, степень олигомеризации AlIbpA анализировали с помощью гельфильтрации в PBS с различным рН. Показано, что изменение рН в любую сторону приводит к диссоциации белка. Значение рН может являться как фактором, модулирующим шаперонную активность IbpA A. laidlawii, так и препятствием к её осуществлению в результате диссоциации белка на мономеры. Проведена оценка взаимодействия модельных белков с AlIbpA in vitro с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Анализ связывания субстратов мутантными и усечёнными формами AlIbpA позволил установить, что (W/F)(D/F)PF-домен, по-видимому, не требуются для такого взаимодействия. Одновременное усечение 12 N-концевых и 14 C-концевых аминокислот полностью отменяло взаимодействие AlIbpA как с инсулином, так и с АДГ. Интересно, что стабильность, связывание субстрата и шаперонная активность у AlIbpASEP∆N12 и AlIbpASEP∆N25 увеличивались по сравнению с AlIbpASEP и были сопоставимы с полноразмерным AlIbpA, оставаясь при этом значительно ниже, чем у AlIbpA∆N12 и AlIbpA∆N25. Взятые вместе, эти данные ясно демонстрируют, что как N-, так и C-конец определяют взаимодействие AlIbpA с субстратными белками. В дополнение к этому идентифицировали белки-партнеры для взаимодействия методом ко-элюции рекомбинантного белка AlIbpA-His6 и его усечённых форм на Ni-NTA сефарозе из клеточного экстракта клеток A. laidlawii, которые культивировали при оптимальной и стрессовых температурах. В зависимости от температуры менялся не спектр, а количество некоторых белков, ко-элюированных с рекомбинантным белком AlIbpA. Чтобы определить локализацию AlIbpA в клетке ахолеплазмы, было проведено разделение клеточного экстракта A. laidlawii, находящихся в условии стресса, на цитоплазму и мембрану с предварительной сшивкой белков параформальдегидом. Содержание AlIbpA в образцах оценивали иммуноблотингом. Локализация AlIbpA в клетке ахолеплазмы имеет прямую зависимость от температуры: при оптимальной температуре белок содержится в основном в цитоплазме, а при температурном стрессе локализуется в мембране клетки. Следовательно, AlIbpA может играть роль в стабилизации мембран как самих клеток микоплазм, так и внеклеточных везикул в условиях стресса. Исследовали также влияние экспрессии модифицированного AlIbpA на термотолерантность рекомбинантных клеток E. coli в условиях температурного стресса в отсутствии их собственных мБТШ. Нокаутирование генов ibpA и ibpB в клетках E. coli проводили путем замены целевого гена на кассету устойчивости к антибиотику. Штамм E. coli c нокаутом собственных белков IbpAB, продуцирующий рекомбинантный AlIbpА, сохранял в 10 раз больше живых клеток, способных к образованию колоний, по сравнению с контрольным штаммом, указывая на то, что AlIbpА увеличивает выживаемость клеток при тепловом стрессе. Клетки, продуцирующие рекомбинантный AlIbpА с нарушенным N-концом (∆N12, ∆N25, N11N12), образовывали лишь 10˄4 КОЕ. При этом удаление С-конца белка или мутация SEP-мотива полностью нивелировало положительный эффект белка на выживаемость клеток, хотя дополнительное нарушение N-конца частично компенсировало негативный эффект. Оценка жизнеспособности клеток после теплового шока с помощью дифференциальной флуоресцентной микроскопии также подтвердила, что рекомбинантные AlIbpA (∆N12, ∆N25, N11N12) повышают выживаемость клеток. Таким образом, наши результаты показывают, что повышенная экспрессия N-модифицированного AlIbpA способна защитить клетки E. coli от теплового шока in vivo. Известно, что мБТШ IbpA и IbpB у E. coli опосредованно, через взаимодействие с белком NlpI, участвуют в регуляции клеточного деления. Методом иммуноблотинга нами продемонстрирована ко-элюция AlIbpA и FtsZ из клеточного экстракта A. laidlawii независимо от температуры, что указывает на их прямое взаимодействие в клетках ахолеплазмы. С помощью ППР была определена KD взаимодействия FtsZ - AlIbpA (800 ± 54 нМ). Изучено влияние усечений N- и C-концов на характер связывания AlIbpA-FtsZ, и он оказался схож со связыванием с АДГ, за исключением варианта ∆N25С14. Кроме ко-элюции и ППР, мы продемонстрировали взаимодействие пары FtsZ/IbpA in vivo при помощи бактериальной двугибридной системы и показали взаимодействие белков по C-концевым доменам. Значимых различий в активности β-галактозидазы между клетками, выращенными при разных температурах, не наблюдалось, что свидетельствует о конститутивном взаимодействии между AlIbpA и FtsZ. Эти данные входят в противоречие с предположением, что мБТШ ахолеплазмы взаимодействует с FtsZ только в качестве холдазы. Вероятно, связь FtsZ - AlIbpA функционально значима для клеток микоплазмы. За отчетный период создан и проверен штамм M. gallisepticum с флуоресцентно-меченым FtsZ, ген которого находится под контролем нативного промотора. В дополнение к плану были созданы штаммы M. gallisepticum с флуоресцентно-меченым белком FtsK (ДНК-транслоказа), а также DnaK и EFTu, идентифицированными в качестве белков-партнёров FtsZ по результатам ко-элюции. Для этого сконструированы плазмиды на основе вектора pTn4001mini_Recipient-MCS-M5, и секвенированием определены сайты встраивания транспозона в геном каждого из полученных штаммов. Генетические модификации не нарушали нормальную физиологию клеток микоплазмы. Для штамма M. gallisepticum с флуоресцентно-меченым белком FtsZ была осуществлена оценка уровня экспрессии данного белка методом полуколичественного иммуноблоттинга. В среднем уровень экспрессии флуоресцентно-меченого FtsZ не отличается от такового для нативного белка. Применение эндогенного флуоресцентного мечения белков фотопереключаемой меткой (mMaple2) позволило успешно визуализировать структуры, формируемые мечеными белками FtsZ, FtsK, DnaK, Ef-Tu в живых клетках микоплазм с помощью метода SRRF в рамках отдельных временных точек. Было обнаружено, что в большинстве клеток микоплазм FtsZ распределен относительно равномерно, но в некоторых случаях наблюдали его на одном или обоих полюсах клетки, а также было замечено расположение белка FtsZ в сайте деления между двумя клетками, предположительно в момент их деления. Эти результаты хорошо соотносятся с полученными нами ранее данными методом иммунофлуоресцентной микроскопии. Отдельно стоит отметить, что мы не наблюдали в клетках M. gallisepticum классическое Z-кольцо. Возможно, при делении микоплазмы обходятся без формирования этой консервативной структуры. При визуализации штаммов с меченым Ef-Tu во всех клетках наблюдали равномерное распределение белка. Следовательно, белок слияния Ef-Tu с белком mMaple2 можно считать отрицательным контролем, который не демонстрирует формированиe выраженных внутриклеточных структур. Кроме того, добавление флуоресцентного белка mMaple2 само по себе не способствует мультимеризации белков интереса и возникновению структур-артефактов на изображениях. В случае DnaK также преимущественно наблюдали равномерное распределение белка в клетке, но при этом в ряде случаев было отмечено его расположение в виде отдельных скоплений на полюсах клетки. FtsK в большинстве клеток был распределен равномерно. В некоторых случаях наблюдали скопление белка на полюсах и на перетяжке между будущими дочерними клетками. Это косвенно подтверждает участие FtsK в сегрегации ДНК. За отчетный период были успешно получены данные о межбелковых взаимодействиях ряда белков A. laidlawii и M. gallisepticum при помощи бактериальной двугибридной системы. Показано, что белок FtsZ A. laidlawii взаимодействует с белками SepF, FtsK, Gap и IbpA, а также способен к димеризации. Взаимодействие с Ef-Tu практически отсутствует. Белок FtsZ M. gallisepticum взаимодействует с белками Ef-Tu, FtsK, GapD, а также способен к димеризации. Взаимодействие с предполагаемым гомологом белка FtsA практически отсутствует. Белки Gap и GapD видов A. laidlawii и M. gallisepticum взаимодействуют с белками FtsZ и Ef-Tu. Для количественной оценки бета-галактозидазной активности использован колориметрический метод, основанный на измерении бета-галактозидазной активности пермеабилизированных клеток на хромогенном субстрате (o-нитрофенол-галактозид) в жидкой среде. Судя по этим данным, наиболее сильно взаимодействуют между собой белки FtsZ и SepF, FtsZ и IbpA, FtsZ и Gap, FtsZ и FtsZ A. laidlawii. Получены белки FtsZ M. gallisepticum и A. laidlawii без аффинных тагов и в мономерной форме и выявлена их способность к полимеризации и ГТФазной активности. С целью оптимизации кодонов проведена перекодировка обоих генов микоплазм с учетом частот встречаемости кодонов в E. coli. Гены синтезированы de novo и клонированы в вектор рЕТ21а. Нам удалось успешно выделить следующие варианты белков FtsZ A. laidlawii (AL FtsZ) и M. gallisepticum (MG FtsZ): AL FtsZ без тага; AL FtsZ со стреп-тагом; MG FtsZ без тага; MG FtsZ со стреп-тагом. MG FtsZ с укороченным N-концом (без первых 104 аминокислот) нам не удалось выделить, так как данный вариант белка оказался нерастворим. В качестве референсного объекта использовали белок FtsZ E. coli, выделение которого осуществляли аналогично белкам FtsZ микоплазм. Для изучения полимеризации белков использован метод статического светорассеяния. Для анализа ГТФазной активности использовали колориметрическую методику, основанную на измерении концентрации свободного фосфата в растворе, высвобождающегося при гидролизе ГТФ. Все выделенные и очищенные белки оказались способны к полимеризации в большей или меньшей степени. Однако поведение этих белков довольно сильно отличается от FtsZ E. coli: если последний демонстрирует быструю разборку структур, сопряженную с гидролизом ГТФ, то белки FtsZ микоплазм в ряде случаев демонстрируют практически необратимую полимеризацию. Оценено влияние микоплазм, в том числе важных с точки зрения сельского хозяйства, на сигнальные пути эукариотической клетки (задача сверх плана). Обобщены и проанализированы данные по влиянию микоплазм на сигнальные пути эукариотической клетки при заражении. Подчёркнуто, что микоплазмы, вызывающие так называемые "скрытые инфекции", характеризующиеся хроническими воспалительными процессами, могут играть роль в формировании раковых опухолей как у человека, так и у значимых для сельского хозяйства животных (домашняя птица и M. gallisepticum). Это способствует дополнительным экономическим потерям в животноводстве. Растительный патоген A. laidlawii является контаминантом клеточных культур (в том числе клеток животных), и тоже способен оказывать влияние на сигнальные пути эукариот. Отмечена важность разработки методов элиминации микоплазменных патогенов на ранних стадиях инфекции, до её перехода в хроническую форму. На основе накопленных за проект данных рекомендовано рассматривать белки FtsZ, Gap и IbpA микоплазм в качестве ключевых мишеней для разработки антимикробных веществ нового поколения. Для поиска потенциальных препаратов, например, с помощью глубоких генеративных нейронных сетей, а также для докинг-процедур необходимо изучение трёхмерной структуры этих белков, механизмов их взаимодействия и физиологической роли таких взаимодействий в клетках микоплазм. https://polit.ru/news/2020/03/24/ps_rnf/ https://www.gazeta.ru/science/news/2020/03/24/n_14200171.shtml https://indicator.ru/agriculture/izucheny-belki-paraziticheskikh-bakterii-dlya-borby-s-boleznyami-selskokhozyaistvennykh-rastenii-29-03-2020.htm https://rscf.ru/news/presidential-program/belki-paraziticheskikh-bakteriy/ https://kpfu.ru/eng/news-eng/heat-shock-protein-stress-resistance.html https://www.eurekalert.org/pub_releases/2020-05/kfu-srm050220.php https://phys.org/wire-news/350019858/discoveries-of-stress-resistance-mechanisms-in-heat-shock-protei.html https://bioengineer.org/stress-resistance-mechanisms-in-heat-shock-proteins-to-advance-innovative-biotechno/