Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Деление любых клеток, в том числе раковых, опосредовано микротрубочками - внутриклеточными полимерами белка тубулина, которые, попеременно укорачиваясь и удлиняясь, сначала осуществляют поиск и захват хромосом, а затем очень точно распределяют их по дочерним клеткам. Подавление динамики микротрубочек препаратами химиотерапии, такими как таксол и подобными ему веществами, на протяжении многих лет является одной из наиболее клинически успешных стратегий борьбы с пролиферацией опухолей. Однако, применение анти-митотиков типа препарата таксол, сопряжено с двумя проблемами: 1) возникновение устойчивости к ним раковых клеток и 2) возникновение побочных эффектов, связанных с воздействием этих препаратов на микротрубочки здоровых, в том числе неделящихся клеток. В рамках настоящего проекта для борьбы с обеими названными проблемами мы поставили перед собой две основные цели: 1) изучение механизмов воздействия таксола на конформацию тубулинов различных изоформ, чтобы предложить стратегию рационального дизайна ингибиторов тубулина нового поколения, в том числе более эффективно действующих на раковые клетки, устойчивые к таксолу; 2) разработка ингибиторов взаимодействия микротрубочек и важнейшего кинетохорного комплекса NDC80, которые, действуя как более специфичные анти-митотики, практически не должны иметь побочных эффектов на здоровые неделящиеся клетки. Для достижения первой цели критически необходимо исследовать молекулярные механизмы переключения тубулина из стабильной конфигурации (в присутствии молекулы ГТФ или/и таксола) к нестабильной конфигурации (в присутствии ГДФ без таксола). Понимание взаимосвязи между конформацией и свойствами тубулинов необходимо как для решения фундаментального вопроса а механизме переключений микротрубочек от сборки к разборке, так и для выяснения механизма препятствия таксола таким переключениям. А поскольку известно, что особая бета-III изоформа тубулина может являться причиной устойчивости раковых клеток к таксолу, необходимо также исследовать особенности конформационных свойств и связывания с таксолом этой конкретной изоформы тубулина. В связи с этим мы провели обширные исследования конформационных свойств различных систем тубулина изоформ бета1 или бета3, в комплексе с ГТФ/ГДФ, с таксолом или без методом полноатомной молекулярной динамики с явным растворителем. В общей сложности были созданы восемь молекулярно-динамических систем размерами от димеров до тетрамеров (от 160 до 330 тыс. атомов) общей длительностью около 10 мкс. Наш анализ выявил в целом очень схожие с экспериментальными данными конформации внутридимерного интерфейса тубулина. Результаты проведенных расчетов указали на несущественность различий всех основных конформационных углов и жесткостей интерфейсов между ГТФ- и ГДФ-связанными тубулинами вне зависимости от исследуемой изоформы. Это дает важную информацию о возможном молекулярном механизме динамической нестабильности микротрубочки и роли в нем гидролиза ГТФ, свидетельствуя против гипотезы об аллостерических эффектах гидролиза ГТФ на конформацию тубулина. Согласно нашим расчетам, присутствие таксола в кармане тубулина в целом существенно не меняет внутридимерный интерфейс тубулина. Мы обнаружили однако, что таксол имеет некоторый аллостерический эффект на конформацию междимерного интерфейса, что выражается в уменьшении амплитуды междимерного угла изгиба, а также в изменении ориентации этого изгиба. Кроме того, на междимерном интерфейсе несколько увеличивается жесткость на изгиб и скручивание, и уменьшается жесткость на вращение на конформационный угол прецессии. Более детальный теоретический анализ обнаруженных эффектов таксола на следующем этапе позволит определить их возможную роль. Но мы полагаем, что описанные конформационные изменения скорее всего свидетельствуют в пользу решетчатой модели влияния таксола, то есть предсказывают его эффект на латеральные/лонгитудальные связи между тубулинами, а не на конформацию и жесткость тубулинов. Для выяснения возможных причин устойчивости бета-III изоформы тубулина к таксолу, мы оценили аффинности таксола к альфа-бета-I и альфа-бета-III тубулинам методом молекулярного докинга, с учетом возможной гибкости лиганда и белка-рецептора. Полученная оценка свободной энергии связывания оказалась существенно ниже по модулю для бета-III по сравнению с бета-I изоформой тубулина (-7 ккал/моль против -11.2 ккал/моль, соответственно), подтверждая предположение о том, что устойчивость бета-III изоформ тубулина к таксолу связана с низкой эффективностью их связывания. Для достижения второй цели, было проведено молекулярно-динамическое моделирование взаимодействия NDC80 и тубулина, которое позволило определить оптимальный сайт на поверхности кинетохорного комплекса, образующий стабильные водородные связи с тубулином. Далее с помощью созданного в нашей группе алгоритма виртуальной эволюции, в течение 20 циклов были найдены 2 вещества-лидера, обладающие высокими предсказанными аффинностями к сайту на поверхности NDC80. Рациональная доработка этих веществ позволила исключить из дальнейшего анализа нестабильное соединение и сформировать серию модифицированных лигандов второго поколения, доступных синтезу и обладающих улучшенными предсказанными свойствами. На следующем этапе проекта планируется синтез и апробация этих веществ в тест системе-in vitro.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Деление любых клеток, в том числе раковых, опосредовано микротрубочками - внутриклеточными полимерами белка тубулина, которые, попеременно укорачиваясь и удлиняясь, сначала осуществляют поиск и захват хромосом, а затем очень точно распределяют их по дочерним клеткам. Подавление динамики микротрубочек препаратами химиотерапии, такими как таксол и подобными ему веществами, на протяжении многих лет является одной из наиболее клинически успешных стратегий борьбы с пролиферацией опухолей. Однако, применение анти-митотиков типа препарата таксол, сопряжено с двумя проблемами: 1) возникновение устойчивости к ним раковых клеток и 2) возникновение побочных эффектов, связанных с воздействием этих препаратов на микротрубочки здоровых, в том числе неделящихся клеток. В рамках настоящего проекта для борьбы с обеими названными проблемами мы поставили перед собой две основные цели: 1) изучение механизмов воздействия таксола на конформацию тубулинов различных изоформ, чтобы предложить стратегию рационального дизайна ингибиторов тубулина нового поколения, в том числе более эффективно действующих на раковые клетки, устойчивые к таксолу; 2) разработка ингибиторов взаимодействия микротрубочек и важнейшего кинетохорного комплекса NDC80, которые, действуя как более специфичные анти-митотики, практически не должны иметь побочных эффектов на здоровые неделящиеся клетки. Для достижения первой цели критически необходимо исследовать молекулярные механизмы переключения тубулина из стабильной конфигурации (в присутствии молекулы ГТФ или/и таксола) к нестабильной конфигурации (в присутствии ГДФ без таксола). Понимание взаимосвязи между конформацией и свойствами тубулинов необходимо как для решения фундаментального вопроса о механизме переключений микротрубочек от сборки к разборке, так и для выяснения механизма препятствия таксола таким переключениям. В связи с этим мы провели обширные исследования конформационных свойств различных систем тубулина в комплексе с ГТФ/ГДФ, с таксолом или без методом полноатомной молекулярной динамики с явным растворителем. В общей сложности были созданы 11 молекулярно-динамических систем размерами от димеров до октодекамеров, то есть фрагментов решетки микротрубочки размером 3 х 6 мономеров тубулина, размером более 1 млн атомов. Общая длительность расчетов за два этапа выполнения Проекта составила 21 мкс. Основными результатами наших молекулярно-динамических расчетов конформационной подвижности тубулинов в присутствии ГТФ и ГДФ, а также таксола, на наш взгляд являются следующие. Во-первых мы показали, что существенное снижение гибкости меж-димерного интерфейса в результате гидролиза ГТФ делает протофиламенты ГДФ-тубулина более жесткими, а следовательно, склонными к разрыву латеральных связей и разборке. Это может лежать в основе самой сути динамической нестабильности микротрубочек, объясняя ее принцип. Во-вторых, мы обнаружили, что механизм стабилизации микротрубочек таксолом может заключаться в аллостерическом снижении изгибной жесткости тубулиновых протофиламентов путем уменьшения компактности интерфейсов. При этом, уменьшение изгибной жесткости доминирует над небольшим снижением латеральных связей, в целом приводя к возможности выхода протофиламентов из радиальных плоскостей изгиба и сохранению взаимодействия в промежуточной плоскости с образованием кластера с небольшой кривизной на конце микротрубочки. Для достижения второй цели, методом молекулярного докинга мы провели виртуальный скрининг около 80 тыс. конфигураций молекул, полученных на базе библиотеки соединений Национального Инстититута Рака (NCI) с подтвержденной на культурах клеток анти-раковой активнойсть. Из них было отобрано и заказано 40 веществ с наибольшей предсказанной аффинностью к наиболее оптимальному с нашей точки зрения карману белка Hec1. Для проведения экспериментальных тестов отобранных веществ мы клонировали, экспрессировали и очистили кинетохорный белковый комплекс bonsai NDC80-EGFP, состоящих из двух белков: Hec1-Spc25-EGFP-6His и Nuf2-Spc24. Создали и отработали протокол для проведения TIRF-скрининга ингибирования взаимодействия микротрубочек и NDC80 in vitro, разработали программное обеспечение для автоматизации обработки данных, полученных этим методом. Кроме того, методом микротермофореза мы проверены все 40 заказанных веществ, отобранных виртуальным скринингом из базы NCI. Дополнительно было проверено вещество VTT-006 (предполагаемый положительный контроль) и INH1 (предполагаемый отрицательный контроль). Для веществ 16 веществ обнаружен положительный сигнал связывания. Для двух веществ подтвержден ложноположительный сигнал связывания в канале EGFP. Измерена аффинность связывания двух веществ с NDC80-EGFP. После постановки дополнительных контролей, в том числе с привлечением альтернативных методов измерения взаимодействия белок-лиганд, мы планируем продолжить улучшать вещества-лидеры путем отбора и тестирования близких к ним соединений.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Деление любых клеток, в том числе раковых, опосредовано микротрубочками - внутриклеточными полимерами белка тубулина, которые, попеременно укорачиваясь и удлиняясь, сначала осуществляют поиск и захват хромосом, а затем очень точно распределяют их по дочерним клеткам. Подавление динамики микротрубочек препаратами химиотерапии, такими как таксол и подобными ему веществами, на протяжении многих лет является одной из наиболее клинически успешных стратегий борьбы с пролиферацией опухолей. Однако, применение анти-митотиков типа препарата таксол, сопряжено с двумя проблемами: 1) возникновение устойчивости к ним раковых клеток и 2) возникновение побочных эффектов, связанных с воздействием этих препаратов на микротрубочки здоровых, в том числе неделящихся клеток. В рамках настоящего проекта для борьбы с обеими названными проблемами мы поставили перед собой две основные цели: 1) изучение механизмов воздействия таксола на конформацию тубулинов различных изоформ, чтобы предложить стратегию рационального дизайна ингибиторов тубулина нового поколения, в том числе более эффективно действующих на раковые клетки, устойчивые к таксолу; 2) разработка ингибиторов взаимодействия микротрубочек и важнейшего кинетохорного комплекса NDC80, которые, действуя как более специфичные анти-митотики, практически не должны иметь побочных эффектов на здоровые неделящиеся клетки. Для достижения первой цели мы применили методы молекулярной и броуновской динамики для прояснения механизмов динамической нестабильности микротрубочек и воздействия на нее препарата. Наши теоретические результаты указывают на то, что наиболее существенные различия между изоформами тубулинов скорее всего проявляются в свойствах латеральных связей, а не гибких C-концевых элементов этих тубулинов. При этом, моделирование позволяет оценить сверху разницу в свободных энергиях связей между разными изоформами тубулинов величиной около 2-3 kT. Это небольшое различие подтверждается нашим анализом криоэлектронных томограмм концов микротрубочек в различных изоформах, выполненным совместно с лабораториями Дж.Р. МакИнтоша и А. Ролл-Мекак (США), который выявил большую схожесть длин и кривизн изогнутых протофиламентов на концах полимеризующихся микротрубочек. На основе результатов моделирования мы пришли к выводу, что таксол воздействует на тубулины путем аллостерического увеличения гибкости и, возможно, частично кривизны тубулиновых протофиламентов в районе их междимерных интерфейсов. Для достижения второй цели ранее методом молекулярного докинга мы провели виртуальный скрининг около 80 тыс. конфигураций молекул, полученных на базе библиотеки соединений Национального Инстититута Рака (NCI) с подтвержденной на культурах клеток анти-раковой активнойсть. Из них было отобрано и заказано 40 веществ с наибольшей предсказанной аффинностью к наиболее оптимальному с нашей точки зрения карману белка Hec1. На этапе 2019-2020 года мы провели экспериментальных тесты отобранных веществ методами TIRF микроскопии и микротермофореза. Для этого мы экспрессировали и очистили кинетохорный белковый комплекс bonsai NDC80-EGFP, состоящих из двух белков: Hec1-Spc25-EGFP-6His и Nuf2-Spc24. Создали и отработали протоколы для проведения двух-канального скрининга лигандов методом микротермофореза и TIRF-скрининга ингибирования взаимодействия микротрубочек и NDC80 in vitro, разработали программное обеспечение для автоматизации обработки данных, полученных этим методом. В результате работы в рамках нам удалось идентифицировать четыре соединения, нарушающих взаимодействие микротрубочек и кинетохорного комплекса NDC80 – связывающего звена между хромосомами и веретеном деления клеток. Три из четырех обнаруженных соединений уже имеют охарактеризованную противораковую активность, что в сильной степени повышает шансы создания на их основе лекарств для химиотерапии рака. Четвертое вещество еще предстоит тестировать на панелях раковых клеток. В качестве резервного пула соединений, мы также отобрали с помощью молекулярного докинга еще новых 100 веществ из базы более 2 млн соединений различной природы, пока не имеющих подтвержденной противораковой активности.