КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 17-75-10220

НазваниеХарактеристика клонального состава функционально различных субпопуляций Т-лимфоцитов вовлеченных в развитие воспаления при спондилоартропатиях

РуководительЗвягин Иван Владимирович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2017 - 06.2019 

КонкурсКонкурс 2017 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словаТ-клеточный репертуар, псориатический артрит, синовиальная жидкость, Т-лимфоциты, спонлилоартропатии, HLA-B*27, иммунофенотипирование

Код ГРНТИ34.15.33, 34.43.55


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Псориатический артрит (ПсА) – второе по распространенности заболевание из группы спондилоартропатий, характеризующееся воспалительными процессами в кожных покровах и периферических суставах и/или суставах осевого скелета. Спондилоартропатии (СпА) – группа заболеваний, объединяемых на основе сходства клинических проявлений и генетических факторов риска развития заболевания, также включает реактивный артрит, артриты ассоциированные с язвенным колитом и болезнью Крона, недифференцированные спондилоартропатии, а также анкилозирующий спондилоартрит – наиболее распространенное заболевание из группы СпА (1). Клинические признаки АС и ПсА в значительной степени перекрываются и, согласно некоторым исследователям, различия между этими двумя заболеваниями носят скорее количественный характер (2). По данным ВОЗ до 0,5 - 1% населения европейского происхождения страдают от ПсА, а общая частота СпА достигает 2,5% (в зависимости от региона). По результатам интенсивных исследований генетических локусов определяющих риск развития СпА показана связь с определенными аллельными вариантами генов, продукты которых принимают участие в развитии и регуляции иммунного ответа. Наиболее сильная, из известных в настоящее время, ассоциация риска развития заболевания с определенным аллелем гена МНС обнаружена для анкилозирующего спондилита и аллеля HLA-B*27 гена МНС I класса, продукт которого принимает непосредственное участие в презентации антигена цитотоксическим Т-лимфоцитам. Риск развития ПсА также ассоциирован с HLA-B*27. Ряд других аллелей МНС I и II класса вносят вклад в риск СпА. Вовлеченность генов системы антиген-презентации (MHC, ERAP1,2), рецепторов натуральных киллеров (KIR3D, KIR2D), обогащение сайтов воспаления цитотоксическими Т-лимфоцитами, вклад внешних факторов среды в риск развития заболевания – все эти данные свидетельствуют в пользу гипотезы аутоиммунной природы СпА: развития заболевания в результате ошибочного распознавания антигенов собственного организма Т-лимфоцитами. При этом инициирующим событием может служить распознавание антигена, имеющего структурное сходство с антигенами бактериальной микрофлоры (см. обзор (3)). О наличии специфического антигена, вызывающего экспансию Т-лимфоцитов при СпА также может свидетельствовать обнаружение в суставной жидкости нескольких пациентов с реактивным артритом специфических клонов Т-клеток с очень сходной структурой вариабельной части Т-клеточного рецептора (4), также обнаруженных недавно в периферической крови больных АС (5). Однако, несмотря на существенные возможности предоставляемые массированным параллельным секвенированием (NGS) для подробного исследования клональных репертуаров лимфоцитов и выявления клонов, вовлеченных в патогенез, в настоящее время не опубликовано результатов исследований репертуаров Т-лимфоцитов больных ПсА. Также отсутствуют данные о клональном составе Т-клеток специфических для сайтов воспаления при СпА, за исключением нескольких работ, где глубина анализа была ограничена всего несколькими десятками клонов Т-клеток определенной группы по вариабельной части Т-клеточного рецептора (ТкР) по причине отсутствия на тот момент технологии NGS. Остаются открытыми вопросы о наличии идентичных клональных экспансий у больных ПсА, степени сходства таких клонотипов при различных СпА, структуре ТкР Т-клеток, специфически представленных в сайтах воспаления, количестве клонотипов представляющих Т-клетки с различной тканевой специализацией (хоумингом). На решение данных вопросов направлен предлагаемый проект. В ходе выполнения проекта предполагается реконструировать клональный репертуар Т-лимфоцитов синовиальной жидкости в состоянии острого синовита у нескольких групп больных с диагнозом ПсА, с вовлечением осевого скелета (наиболее схожая форма с анкилозирующим спондилитом) и без, а также позитивных и негативных по HLA-B*27. Также предполагается включение в исследование образцов синовиальной жидкости и периферической крови больных анкилозирующим спондилитом. Количественная характеристика представленности каждого выявленного клонотипа в периферической крови и воспаленном суставе позволит определить клонотипы, специфически присутствующие в сайте воспаления. На основе сопоставления полученных данных с уже имеющимися в лаборатории авторов проекта данных массированного секвенирования клональных репертуаров больных АС и здоровых доноров, позитивных и негативных по HLA-B*27, предполагается характеристика выявленных в синовиальной жидкости клонотипов с точки зрения специфичности для ПсА и определение наличия сходных клонотипов специфических для АС и ПсА. Реконструкция клональных репертуаров Т-лимфоцитов синовиальной жидкости и периферической крови пациентов будет выполнена для различных фракций Т-лимфоцитов выделенных с помощью иммуномагнитной сепарации и проточной цитофлуорометрии. Такой подход позволит охарактеризовать функциональную принадлежность клонов синовиальной жидкости к цитотоксической или хелперной субпопуляциям, активированным эффекторным Т-лимфоцитам, а также Т-лимфоцитам экспрессирующим молекулы, определяющие хоуминг в кожные покровы, кишечный эпителий. Для решения задачи реконструкции клональных репертуаров Т-лимфоцитов из образцов клеток предполагается использование разработанной при участии автора проекта оригинальной технологии получения библиотек кДНК альфа и бета цепей Т-клеточного рецептора (ТкР) с последующим секвенированием на платформе Illumina (6). Одним из основных преимуществ выбранной технологии пробоподготовки является возможность количественной оценки представленности клонотипов за счет применения молекулярного баркодирования, используемого также для коррекции ошибок, возникающих в ходе ПЦР и секвенирования, и отсутствие искажений в представленности клонотипов вносимых в ходе ПЦР. Первичная обработка данных секвенирования и дальнейший биоинформатический и статистический анализ клональных репертуаров, поиск идентичных последовательностей между донорами и образцами, определение различных характеристик репертуара и т.д. будет осуществляться с помощью специализированного программного обеспечения MiGEC, MiTCR, VDJtools, R-пакета «tcR», разработанных при участии автора проекта. Применимость и эффективность в целом всей технологии для реконструкции и анализа клональных репертуаров Т-лимфоцитов человека показана в ряде успешных исследований (7,8). Список источников: 1. Olivieri I, D’Angelo S, Gilio M, Palazzi C, Lubrano E, Padula A. Relationship of psoriatic arthritis to other spondyloarthritides. J Rheumatol 2015;93:33–35. 2. Helliwell PS, Hickling P, Wright V. Do the radiological changes of classic ankylosing spondylitis differ from the changes found in the spondylitis associated with inflammatory bowel disease, psoriasis, and reactive arthritis? Ann Rheum Dis 1998;57:135–40. 3. Jacques P, Elewaut D. Joint expedition: linking gut inflammation to arthritis. Mucosal Immunol 2008;1:364–371. 4. May E, Dulphy N, Frauendorf E, Duchmann R, Bowness P, Lopez de Castro J a, et al. Conserved TCR beta chain usage in reactive arthritis; evidence for selection by a putative HLA-B27-associated autoantigen. Tissue Antigens 2002;60:299–308. 5. Faham M, Carlton V, Moorhead M, Zheng J, Klinger M, Pepin F, et al. Discovery of T-Cell Receptor Beta Motifs Specific to HLA-B27(+) Ankylosing Spondylitis by Deep Repertoire Sequence Analysis. Arthritis Rheumatol (Hoboken, NJ) 2016;11:300–308. 6. Mamedov IZ, Britanova O V, Zvyagin I V, Turchaninova M a, Bolotin D a, Putintseva E V, et al. Preparing unbiased T-cell receptor and antibody cDNA libraries for the deep next generation sequencing profiling. Front Immunol 2013;4:456. 7. Britanova O V., Shugay M, Merzlyak EM, Staroverov DB, Putintseva E V., Turchaninova M a., et al. Dynamics of Individual T Cell Repertoires: From Cord Blood to Centenarians. J Immunol 2016. 8. Zvyagin I V, Mamedov IZ, Tatarinova O V, Komech EA, Kurnikova EE, Boyakova E V, et al. Tracking T-cell immune reconstitution after TCRαβ/CD19-depleted hematopoietic cells transplantation in children. Leukemia 2016.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта предполагается впервые на глубоком уровне проанализировать клональный состав репертуаров Т-лимфоцитов периферической крови и суставной жидкости при остром синовите у больных ПсА и АС. Охарактеризовать выявленные клонотипы по специфичности присутствия в сайте воспаления, принадлежности к функционально различным субпопуляциям Т-лимфоцитов, экспрессии молекул, определяющих их тканевую специфичность. Впервые будет проведен сравнительный анализ репертуаров синовиальной жидкости и периферической крови больных АС и ПсА с различными формами, поиск Т-лимфоцитов со сходной структурой ТкР, предположительно распознающих сходные антигены и принимающих участие в развитии заболевания. Полученные в ходе выполнения проекта результаты внесут существенный вклад в понимание механизмов инициации и прогрессии спондилоартропатий и могут быть использованы для разработки способов узконаправленной иммунотерапии СпА.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В ходе реализации первого этапа проекта сформирована выборка пациентов с диагнозом «анкилозирующий спондилит» (АС) и «псориатический артрит» (ПсА) (n=16), от которых получены параллельные образцы синовиальной жидкости (СЖ) и периферической крови (ПК) на стадии острого воспаления. С целью характеристики клонального репертуара Т-лимфоцитов СЖ из полученных образцов выделены 167 образцов клеток, представляющих собой тотальные фракции PBMC или SFMC, а также фракции клеток СЖ, цитотоксической (CD8+) и хелперной (CD4+) субпопуляций Т-клеток, активированных Т-лимфоцитов (на основе маркеров PD-1 и CD137), Т-лимфоцитов, экпрессирующих маркеры различной тканевой локализации (CLA, интегрин b7). На данном этапе реализации проекта, с использованием оригинальной технологии, подготовлены 39 кДНК библиотек бета цепей TCR фракций активированных Т-клеток СЖ, для которых получены данные секвенирования, проведена первичная обработка и реконструирован клональный состав. Основной набор библиотек (128) подготовлены до стадии ПЦР-1 и предполагаются к отправке в сиквенсовый центр в течение ближайшего времени. С помощью различных способов селекции получены фракции Т-клеток синовиальной жидкости пациентов, обогащенные ранее идентифицированными в крови пациентов с АС специфическими клонотипами. Для данных образцов клеток подготовлены 19 библиотек кДНК с использованием модифицированной для старта с малых количеств клеток технологии пробоподготовки. После обработки результатов секвенирования исследована частота встречаемости АС-ассоциированных клонотипов бета цепей TCR среди пациентов с АС и ПсА. Ранее ассоциированные с АС клонотипы были обнаружены в образцах СЖ 86,7% HLA-B*27+ пациентов (n=15) независимо от диагноза. Полученный результат позволяет предполагать существенную близость механизмов патогенеза АС и ПсА. В образцах СЖ HLA-B*27- доноров АС-ассоциированные клонотипы не обнаружены (n=6, объединенные данные секвенирования, полученные в ходе реализации проекта и ранее полученные в лаборатории), что позволяет предполагать ассоциацию данных клонотипов с аллелем HLA-B*27. В ходе реализации проекта выполнено исследование параллельных клональных репертуаров альфа и бета цепей TCR для образцов клеток, содержащих высокую долю АС-ассоциированных клонотипов (TRBV9+). Анализ результатов секвенирования 39 библиотек кДНК альфа и бета цепей TCR фракции TRBV9+ клеток СЖ позволил определить клональную последовательность партнерской альфа цепи TCR для наиболее распространенного АС-ассоциированного клонотипа. Исследование встречаемости данной клональной последовательности в образцах TRBV9+ клеток СЖ других пациентов (n=5), а также периферической крови здоровых доноров (n=6) продемонстрировал уникальность выявленной последовательности. Полученный результат позволяет предполагать сравнительно невысокую частоту реализации данной последовательности в ходе VDJ-рекомбинации, и, предварительно, высокое разнообразие партнерских альфа цепей TCR для группы АС-ассоциированных клонотипов. Сравнительный анализ репертуаров бета цепей TCR фракций активированных клеток СЖ (PD-1+ и CD137+) показал крайне низкую (на уровне случайного) степень совпадения клонотипов указанных фракций между донорами, независимо от статуса по HLA-B*27. Полученный результат может быть связан с низким клональным разнообразием указанных фракций (для каждого образца идентифицировано несколько десятков клонотипов), что требует более специализированных методов оценки степени совпадения репертуаров между донорами, нежели применены на данный момент. Вместе с тем, полученные данные позволяют заключить, что наиболее высокопредставленные клонотипы Т-клеток синовиальной жидкости при АС и СпА, экспрессирующие маркеры активации PD-1 и CD137, в основном уникальны для пациентов. По сведениям авторов проекта, анализ клональных репертуаров TCR активированных Т-клеток СЖ при СпА проведен впервые.

 

Публикации

1. Комеч Е.А., Колтакова А.Д., Микелов А.И., Шмидт Е.И., Коротаева Т.В., Лебедев Ю.Б. Поиск характеристических клонов Т-лимфоцитов в синовиальной жидкости пациентов со спондилоатртропатиями Научно-практическая ревматология, том 55, №5, приложение 2, стр. 15 (год публикации - 2017).


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В течение второго этапа реализации проекта выполнен весь запланированный объем работ. Реконструированы клональные репертуары Т-лимфоцитов для 125 клеточных образцов синовиальной жидкости и периферической крови в момент острого синовита 18 пациентов с диагнозами анкилозирующий спондилит (АС) и псориатический артрит (ПсА). Дополнительно реконструированы репертуары биоптатов пораженных участков кожи для двух пациентов из выборки с псориатическим артритом и пораженных участков кишечника для двух дополнительных пациентов с диагнозом «болезнь Крона» и суставными воспалительными проявлениями в истории болезни. Кроме того, дополнительно, реконструированы репертуары фракции цитотоксических Т-лимфоцитов синовиальной жидкости двух пациентов с повторным синовитом. В течение второго этапа реализации проекта был проведен основной анализ Т-клеточных репертуаров различных образцов клеток синовиальной жидкости и периферической крови 18 пациентов с АС и ПсА. Кроме того, при анализе использовались ранее полученные клональные репертуары периферической крови 35 пациентов с АС и репертуары Т-лимфоцитов синовиальной жидкости 4 пациентов с АС. Таким образом, в ходе выполнения проекта проведено исследование клонального репертуара синовиальной жидкости и парных образцов периферической крови 22 больных различными СпА (АС и ПсА), генотип которых различается по присутствию аллеля HLA-B*27, ассоциированного с риском развития АС и, с меньшей частотой, также встречающегося у пациентов с ПсА. Сравнительный анализ разнообразия и степени неравномерности распределения численности Т-клеток, представляющих различные клонотипы, свидетельствует о существенно сниженном клональном разнообразии и значительно более выраженной неравномерности репертуара Т-лимфоцитов синовиальной жидкости при остром воспалении по сравнению с периферической кровью. Доля идентичных на уровне аминокислотной последовательности клонотипов бета-цепей TCR существенно выше среди Т-лимфоцитов синовиальной жидкости. Показана зависимость доли клонотипов с идентичной структурой вариабельного домена бета-цепи TCR цитотоксических Т-лимфоцитов сайта воспаления от числа совпадающих аллельных вариантов МНС I класса. Обобщая полученные результаты, можно заключить, что репертуар синовиальной жидкости коленного сустава при остром воспалении у пациентов с АС и ПсА обогащен клонами Т-лимфоцитов, распознающих сходные антигены в контексте идентичных молекул МНС. Это характерно как для цитотоксических Т-лимфоцитов, узнающих пептиды собственного организма в МНС I класса на всех ядерных клетках организма, так и для хелперной субпопуляции, преимущественно узнающих антигены в МНС II класса, презентируемые специализированными клетками иммунной системы. Никаких значимых различий между пациентами с АС и с ПсА нами не обнаружено, в том числе и по числу совпадающих клонотипов между пациентами с разными заболеваниями. Вместе с тем, показано, что подавляющее большинство высокочисленных на уровне клеток клонов Т-лимфоцитов синовиальной жидкости уникальны для пациента. Среди менее высокопредставленных идентифицированы клонотипы цитотоксической и хелперной субполпуляций, встречающиеся более чем у половины исследованных доноров. Часть клонотипов ассоциирована с присутствием определенного аллеля МНС в генотипе донора. В ходе второго этапа исследования получен один из основных результатов: показано, что наиболее часто встречающимся в репертуарах синовиальной жидкости пациентов является клонотип, входящий в группу ассоциированных с АС клонотипов, обнаруженных ранее в результате анализа периферической крови больных. В результате проведенного анализа показана аккумуляция клонов данной группы в синовиальной жидкости и жесткая ассоциация их присутствия в сайте воспаления с HLA-B*27. Среди Т-лимфоцитов синовиальной жидкости данная группа клонотипов с высокогомологичной структурой гипервариабельного участка CDR3 у большинства больных представлена несколькими вариантами. У ряда пациентов с наибольшей представленностью данных клонотипов в сайте воспаления обнаруживаются идентичные по аминокислотной, но различающиеся по нуклеотидной последовательности CDR3 клонотипы, что демонстрирует несколько независимых событий миграции клонотипов этой группы в сайт воспаления. Также, клонотипы данной группы обнаружены среди Т-клеток, экспрессирующих маркеры активации CD137 и PD-1, а также показана воспроизводимость присутствия клеток с такой структурой бета-цепи TCR в синовиальной жидкости при повторном синовите у того же донора. В сумме полученные данные предполагают, что клетки идентифицированной ранее в периферической крови больных АС группа высокогомологичных клонотипов принимают участие в суставном воспалительном процессе у HLA-B*27+ пациентов c разными СпА и представляют собой потенциальную мишень для разработки специфической иммунотерапии. Полученные результаты также свидетельствуют о возможных различиях в молекулярно-клеточных механизмах развития ПсА в зависимости от генотипа по HLA и сходстве HLA-B*27+ ПсА с АС. Полученные в ходе реализации проекта результаты опубликованы в различных изданиях и представлены на международных и российских конференциях.

 

Публикации

1. - У пациентов с болезнью Бехтерева и псориатическим артритом обнаружен индивидуальный набор иммунных клеток Информационно-сервисный портал "Индикатор", 17 декабря 2018 (год публикации - ).

2. Е. Комеч, А. Колтакова, А. Новикова, Е. Логинова, Т. Коротаева, И. Звягин TCR repertoire profiling of synovial fluid of HLA-B*27+ and HLA-B*27- patients with psoriatic arthritis Annals of the Rheumatic Diseases, - (год публикации - 2019).

3. Комеч Е.А., Колтакова А.Д., Коротаева Т.В., Логинова Е.Ю., Шмидт Е.И., Лебедев Ю.Б., Звягин И.В. TCR repertoire of PD-1+ and CD137+ T-cells from synovial fluid of patients with spondyloarthropathies Abstract book of 5th European Congress of Immunology, p.169 (год публикации - 2018).

4. Комеч Е.А., Колтакова А.Д., Мясоутова А.А., Коротаева Т.В., Шмидт Н.И., Шостак Н.А., Лебедев Ю.Б., Звягин И.В. Клональная характеристика Т-лимфоцитов очага воспаления у больных со спондилоартропатиями Научно-практическая ревматология, 56(3, прил.2), стр.91 (год публикации - 2018).

5. Комеч Е.А., Мясоутова А.А., Колтакова А Д., Коротаева Т.В., Логинова Е.Ю., Шмидт Е.И., Сальникова М.А., Минервина А.А., Лебедев Ю.Б., Звягин И.В. Клональные репертуары Т-лимфоцитов очагов воспаления у пациентов со спондилоартропатиями Научно-практическая ревматология, 56(3, прил.3), стр.20 (год публикации - 2018).

6. Комеч Е.А., Мясоутова А.А., Колтакова А.Д., Коротаева Т.В., Логинова Е., Шмидт Е.И., Лебедев Ю.Б., Звягин И.В. CDR3 motif is detected in synovial fluid of patients with different spondyloarthropathies FEBS OPEN Bio, 8(S1),p.489 (год публикации - 2018).

7. Микелов А.И., Комеч Е.А., Погорелый М.В., Лебедев Ю.Б., Звягин И.В. Новый подход для оценки степени сходства репертуаров Т-клеточных рецепторов Сборник тезисов XXX Зимней молодежной научной школы “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии”, - (год публикации - 2018).