Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Одной из важнейших инициаторных каспаз, играющих центральную роль в запуске ответа на повреждения ДНК, является каспаза-2. Более того, этот белок обладает онкосупрессорными функциями в организме, поддерживает генетическую стабильность клеток тканей и обеспечивает элиминацию клеток с неправильным числом хромосом. Несмотря на важность этого фермента в индукции гибели раковых клеток механизм его активации остается до сих пор невыясненным. Ассоциация этого фермента с комплексом PIDDosome, который впервые был описан в 2004 году, по существующим данным не является единственным механизмом активации каспазы-2. Так, в нашей лаборатории впервые было показано существование альтернативной платформы активации, формирующейся в клетках карциномы яичника в ответ на обработку ДНК-повреждающим химиотерапевтическим агентом цисплатином. Для дальнейшего изучения механизма активации этого фермента был проведен ряд экспериментов по выделению комплекса активации каспазы-2. В данных экспериментах были использованы линия клеток карциномы яичника Caov-4 и цисплатин в концентрации 70 µМ. Для выделения комплекса активации каспазы-2 был применен ранее разработанный нами подход, основанный на комбинации гель-фильтрации и последующей иммунопреципитации (ИП) каспазы-2 из высокомолекулярных фракций. Для дополнительного подтверждения PIDDosome-независимого механизма в ходе экспериментов также было проанализировано, детектируется ли белок RAIDD в профилях гель-фильтрации в высокомолекулярных фракциях из обработанных цисплатином клеток. Согласно Вестерн-блот анализу каспаза-2 обнаруживалась в высокомолекулярных фракциях гель-фильтрации из лизатов клеток, обработанных цисплатином. Таким образом, данный фермент после индукции апоптоза взаимодействовал и образовывал стабильный комплекс со своими белками-партнерами при генотоксическом стрессе. При этом анализ профилей гель-фильтрации показал, что в противовес каспазе-2 белок RAIDD – молекулярный адаптор платформы PIDDosome – не обнаруживался в высокомолекулярных фракциях гель-фильтрации клеток, обработанных цисплатином. Таким образом, отсутствие RAIDD в высокомолекулярных фракциях, обработанных цисплатином клеток подтвердило тот факт, что этот белок не взаимодействует с активированной каспазой-2, следовательно, активация этого фермента происходит по PIDDosome-независимому механизму. Необходимо отметить, что после обработки клеток ДНК-повреждающим агентом в высокомолекулярных фракциях (MW>670 кДа) гель-фильтрации были обнаружены каспаза-8 и белок RIP. Данный факт свидетельствовал о том, что в клетках карциномы яичника под действием цисплатина формируется комплекс RIPoptosome. Не исключено, что после повреждений ДНК каспаза-2 может включаться в состав RIPoptosome и активироваться или регулировать активность комплекса. Также для выделения комплекса активации использовались ранее созданные генетические конструкты каспазы-2, содержащие ген каспазы-2 с присоединенным к нему сегментом ДНК, кодирующим маркерный пептид для аффинной хроматографии, так называемый tag - Strep-tag, Twin-Strep-tag, GST-tag, Flag-tag. Далее были получены образцы каспазы-2, выделенные из контрольных и обработанных 70 µМ цисплатина клеток Caov-4. При этом каспазу-2 и взаимодействующие с ней белки выделяли с помощью двух методов: 1) гель-фильтрацией лизатов клеток с последующий ИП каспазы-2 из высокомолекулярных фракций; 2) оверэкспрессией конструкта, содержащего последовательность caspase-2-Twin-Strep, в клетках KO-casp2 Caov-4 с последующим выделением с помощью сорбента Strep-Tactin Superflow high capacity. Полученные образцы были проанализированы с помощью метода масс-спектрометрии. Данный анализ подтвердил эффективность разработанного метода, поскольку в спектре было обнаружено от 3 до 6 пептидов каспазы-2. Полученные масс-спектрометрические данные анализировали по определенному ранее разработанному алгоритму, позволившему исключать неспецифически-ассоциированные белки. Полученный список белков сравнивали с ранее детектированными потенциальными белками-партнерами каспазы-2. Результаты данного исследования показали, что в образцах каспазы-2 из высокомолекулярных фракций обнаруживался убиквитин, полиубиквитин, а также белки р62 и ТРИМ21. р62 участвует в процессе аутофагии и является убиквитин-связывающим белком, ТРИМ21 является убиквитин-лигазой. Таким образом, каспаза-2, вероятно, подвергается убиквитинилированию в процессе индукции клеточной гибели. Для анализа возможного убиквитинилирования каспазы-2 была проведена ИП с использованием антител против этого белка в денатурирующих условиях из лизатов контрольных и обработанных цисплатином клеток линии Caov-4. Вестерн-блот анализ полученных образцов показал, что после воздействия ДНК-повреждающего агента количество убиквитинилированной каспазы-2 возрастает. При этом в образцах ИП каспазы-2 из обработанных цисплатином клеток возрастает количество полиубиквитина К48, присоединение которого усиливает протеосомную деградацию белков. Таким образом, каспаза-2 подвергается убиквитинилированию, при этом оно усиливается при повреждениях ДНК. Вероятно, изменение степени и/или характера убиквитинилирования влияет на работу этого фермента при индукции апоптотической гибели раковых клеток химиотерапевтическими агентами. Эксперименты по изучению возможного взаимодействия каспазы-2 и р62 проводили с помощью метода ИП этих белков из лизатов контрольных и обработанных цисплатином клеток и с помощью трансфекции клеток конструктом, содержащим последовательность caspase-2-Twin-Strep. Анализ результатов этих экспериментальных подходов показал, что в образцах ИП через антитела к каспазе-2 происходит существенное обогащение каспазой-2, но при этом р62 и ТРИМ21 детектируются на слабом уровне как в контрольных, так и в обработанных цисплатином клетках. Анализ образцов выделенной экзогенной каспазы-2 после трансфекции клеток соответствующим конструктом показал, что белки р62 и ТРИМ21 не декретируются в этих образцах. Также была проведена ИП с использованием антител к р62 и ТРИМ21 из контрольных и обработанных цисплатином клеток линии Caov-4. Вестерн-блот анализ образцов ИП показал, что каспаза-2 также не детектируется в этих образцах. Таким образом, возможное взаимодействие каспазы-2 и белков р62 и ТРИМ21 является очень слабым. Несмотря на довольно большое количество описанных сайтов фосфорилирования для инициаторных каспаз-8 и -9, для каспазы-2 охарактеризовано только 3 таких сайта. Вероятно, регуляция активности и активация каспаза-2 происходит за счет большего количества сайтов фосфорилирования, поскольку этот фермент регулирует клеточную гибель в ответ на широкий ряд стимулов, включая повреждения ДНК, нагревание, стресс эндоплазматического ретикулума и метаболический стресс. Для поиска новых сайтов фосфорилирования каспазы-2 проведен биоинформатический анализ с использованием следующих баз данных: NetPhos, PhosphoSite, Disphos, NetPhorest, ScanSite, 3Dpdb, PhosphoNet. При поиске возможных сайтов фосфорилирования каспазы-2 учитывали, насколько используемый алгоритм надежно предсказывает уже известные сайты фосфорилирования каспазы-2: Ser-157, фосфорилируемый киназой CK2; Ser-164, фосфорилируемый CaMKII; Ser-340, фосфорилируемый CDK1. Далее сравнивали все сайты, найденные всеми алгоритмами. Из них выбирали те, которые были определены как минимум тремя различными алгоритмами. В качестве возможных сайтов фосфорилирования были отобраны: S196, S220, S384, T39, T380, Y151, Y420, Y444. Для более точного предсказания сайтов фосфорилирования был проведен сравнительный анализ консервативных остатков серина, треонина и тирозина в последовательности каспазы-2 среди позвоночных и беспозвоночных организмов. При рассмотрении этих сайтов, оказалось, что остатки S220, S384 и T380 показывают высокую консервативность. Помимо этого, было выполнено аналогичное множественное выравнивание среди других каспаз. Также положения всех остатков были рассмотрены на третичной структуре соответствующих каспаз и соотнесены с уже известными сайтами фосфорилирования. Анализ множественного выравнивания показал, что экспериментально доказанные сайты фосфорилирования достаточно консервативны. Таким образом, было сделано предположение, что данные сайты могут принимать участие в модификации указанных каспаз и регуляции протеолитической активности этих ферментов. Поскольку из всех выявленных возможных сайтов фосфорилирования остатки S220, S384 и T380 обладают высокой консервативностью, а два последних располагаются близко к активному центру, то остатки S384 и T380 были выбраны для экспериментальной проверки. На основе уже имеющихся конструкта, содержащего последовательность caspase-2-Twin-Strep, были созданы мутантные варианты каспазы-2 с заменами S384А и T380А. Эксперименты по оверэкспресии показали, что конструкты, содержащие мутантные варианты каспазы-2 с заменами S384А и T380А, удалось успешно экспрессировать в клетках линий KO-casp2 Caov-4 и HEK 394T. Далее полученные конструкты будут использоваться для исследования роли остатков S384 и T380 в процессе активации каспазы-2 при генотоксическом стрессе и их влияние на апоптотическую гибель раковых клеток после обработки химиотерапевтическими препаратами.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На первом году исследований применение ряда биоинформатических методов показало, что, возможно, остатки S384 и T380 в последовательности каспазы-2 могут фосфорилироваться и участвовать в регуляции функционирования этого белка. Для анализа влияния этих остатков были созданы мутантные последовательности с заменами S384А и T380А на основе конструкции, содержащей ген каспазы-2 дикого типа. Для дальнейшего анализа влияния мутации S384A и T380А на активацию каспазы-2 были использованы клетки эмбриональной почечной линии HEK293Т, карциномы яичника Caov-4 и ее генетическими модифицированного варианта без каспазы-2 Caov-4 KO-Casp-2, полученного с помощью технологии Crispr/Cas9. Клетки были трансфицированы генетическими конструктами, содержащими последовательность каспазы-2 дикого типа и с мутацией S384A или T380А. Вестерн-блот анализ показал, что в клетках, оверэкспрессирующих ген каспазы-2 дикого типа или с заменой T380А, наблюдался автокаталитический процессинг каспазы-2 и происходило накопление каталитически активных фрагментов р32 и р19. Введение мутации S384A препятствовало этому процессу. Образование каталитически активных фрагментов каспазы-2 дикого типа, но не с мутацией S384A, усиливалось при индукции апоптоза ДНК-повреждающим агентом цисплатином. Количество фрагмента p19, который свидетельствует об образовании максимально активного гетеротетрамера фермента, было заметно меньше в клетках, трансфицированных конструкцией с заменой S384A, по сравнению с теми, где была оверэкспрессирована каспаза-2 дикого типа или с заменой T380А. Более того, выделение каспазы-2 с помощью аффинной хроматографии показало, что в образцах мутантного варианта каспазы-2 с заменой S384A фрагмент р19 практически не детектировали. Соответственно, данный эксперимент подтверждал, что замена потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 на аланин приводила к практически полной блокировке автокаталического расщепления каспазы-2 и формирования ее ферментативно активных субъединиц. Для подтверждения влияния замены S384A на функционирование каспазы-2 было проведено измерение активности этого фермента в клетках, трансфицированных конструктами с последовательностью каспазы-2 дикого типа либо с заменой S384A. После индукции апоптоза цисплатином клетки собирали и измеряли ферментативную активность каспазы-2 по ее способности расщеплять флуоресцентный пептид Ac-VDVAD-AMC. Измерение активности каспазы-2 подтвердило, что мутированная каспаза-2 не обладала каталитической активностью. Полученные данные свидетельствовали о том, что замена S384A в последовательности каспазы-2 приводила не только к блокировке автокаталитического процессинга профермента, но и к практически полному подавлению ферментативной активности каспазы-2 при индукции апоптоза повреждением ДНК. Для оценки влияния замены S384A на интенсивность клеточной гибели был проведен Вестерн-блот анализ маркеров апоптоза - расщепленной активированной каспазы-3 (clCasp3) и расщеплённой формы белка PARP (clPARP), который является субстратом эффекторных каспаз. Данный анализ клеток после трансфекции соответствующими конструктами и обработки цисплатином показал, что накопление clCasp-3 и clPARP было заметно снижено в клетках, экспрессирующих мутантный вариант каспазы-2 c заменой S384A, по сравнению с клетками, синтезирующими каспазу-2 дикого типа. Такое снижение уровня накопления маркеров апоптоза хорошо коррелировало с подавлением процессинга мутированной каспазы-2. Дальнейший количественный анализ уровня клеточной гибели с помощью метода проточной цитофлуориметрии подтвердил полученные результаты. Для того, чтобы оценить влияние замены S384A на клеточную гибель, клетки Caov-4 KO-Casp-2 и НЕК293Т трансфицировали соответствующими конструктами. После обработки клеток цисплатином 70 мкМ в течение 24 часов клетки были собраны и окрашены аннексином V-FITC и пропидия иодидом, после чего была проведена проточная цитофлуориметрия. Данный эксперимент продемонстрировал, что обработка цисплатином приводила к индукции апоптоза как в нетрансфицированных клетках, так и после трансфекции конструктами с геном каспазы-2 дикого типа или с мутацией. Однако после индукции гибели ДНК-повреждающим препаратом размер апоптотической популяции был заметно больше в клетках, продуцирующих каспазу-2 дикого типа, по сравнению с клетками, синтезирующих каспазу-2 с заменой S384A. Полученные данные подтвердили, что мутация S384A в последовательности каспазы-2 снижала уровень апоптоза, вызванного химиотерапевтическим препаратом. Суммарно, полученные данные показали, что замена потенциально фосфорилируемого остатка серина 384 на аланин в последовательности каспазы-2 приводила к блокировке автокаталитического процессинга этого фермента и ингибированию его ферментативной активности, что вызывало подавление процесса цисплатин-индуцируемого апоптоза. Нами также было показано, что каспаза-2 подвергается убиквитинилированию. Было отмечено, что в образцах каспазы-2 увеличивается количество именно полиубиквитина К48, присоединение которого к белкам обычно свидетельствует об усилении их протеосомной деградации. Исходя из этого стало необходимым изучение протеасомной деградации каспазы-2. Для этого клетки линий Caov-4 обрабатывали протеасомным ингибитором MG-132 в концентрации 1 мкМ в течение 24 часов или комбинацией MG-132 с ДНК-повреждающими химиотерапевтическими препаратами цисплатином, доксорубицином или этопозидом. Исследование протеасомой деградации каспазы-2 продемонстрировало, что блокировка этого процесса MG-132 приводила к накоплению расщепленной активированной каспазы-2 - фрагмента р19 - даже через 4-8 часов инкубации. Аккумуляция р19 существенно усиливалась при комбинировании MG-132 с ДНК-повреждающими препаратами. Комбинация MG-132 с ДНК-повреждающими препаратами приводила также к усилению апоптотической гибели, о чем свидетельствовало усиление аккумуляции фрагмента р89 белка PARP. Соответственно, блокирование протеасомой деградации при помощи MG-132 приводило к накоплению в клетках активных форм каспазы-2 и усиливало их гибель при сочетании ингибитора с химиотерапевтическими препаратами. Поскольку не было отмечено какого-либо падения уровня проформы каспазы-2 в этих условиях, то было выдвинуто предположение, что накопление фрагмента р19 является результатом блокировки его протеосомной деградации, а не усиления расщепления проформы. Таким образом, вероятно, при индукции генотоксического стресса происходит усиление убиквитинилирования каспазы-2, в особенности ее активных расщепленных форм, что ведет к деградации фермента и замедляет апоптоз в опухолевых клетках. При блокировке этого процесса ингибитором протеасом происходит накопление активной каспазы-2, что способствует ускорению клеточной гибели наравне с другими путями, стимулирующими апоптоз при подавлении механизмов деградации белков. Нами обнаружено, что в процессе апоптоза каспаза-2 транслоцируется в ядро в активной форме наряду с другими инициаторными каспазами. Было показано, что данный процесс не зависел от того, каким образом был индуцирован апоптоз – повреждением ДНК, ингибированием киназ или стимуляцией рецепторов смерти. Таким образом, транслокация каспазы-2 в ядро является неизбежным событием в процессе апоптоза, вызванного различными стрессовыми стимулами. Возможно, каспаза-2 участвует в деградации компонентов ядра наряду с другими каспазами. При анализе распределения каспазы-2 между ядром и цитоплазмой было отмечено появление в ядерной фракции новой полосы, детектируемой антителами против каспазы-2, но находящейся выше, чем проформа каспазы-2. Эта полоса характеризовалась небольшим сдвигом электрофоретической мобильности по сравнению с полосой, соответствующей прокаспазе-2. Регистрируемый сдвиг составлял приблизительно 8-9 кДа по массе и мог соответствовать моноубиквитинилированию каспазы-2. При этом ингибирование протеасомной деградации с помощью MG-132 приводило к накоплению данной формы каспазы-2 в ядерной фракции, но не в цитоплазме, что подтверждало предположение о существовании ядерной моноубиквитинилированной формы каспазы-2. Проведение иммунопреципитации каспазы-2 из цитоплазматической и ядерной фракций также показало наличие полосы каспазы-2 массой 57 кДа специфично в ядерной, но не в цитоплазматической фракции. Данная полоса детектировалась в лизатах необработанных клеток, и соответствующий сигнал усиливался при добавлении протеасомного ингибитора и/или проведении ИП. При обработке клеток ДНК-повреждающим агентом данная форма каспазы-2 исчезала. Таким образом, в то время как до настоящего момента в литературе отсутствовали какие-либо данные об убиквитинилировании каспазы-2, серия полученных нами результатов впервые предполагает важность убиквитинилирования каспазы-2 в регуляции ее активности и функций. Возможно, моноубиквитинилирование данной каспазы влияет на ее локализацию в клетке и неапоптотические функции. При этом полиубиквитинилирование регулирует уровень активных форм данного фермента в клетке, что влияет на интенсивность апоптоза. Таким образом, не исключено, что убиквитинилирование важно для переключения функции каспазы-2 с неапоптотических на апоптотические в ответ на определенный уровень повреждения ДНК в клетке. Дополнительно были проанализированы структура, функции и важнейшие белок-белковые взаимодействия антиапототического белка семейства Bcl-2 – Mcl-1. При запуске апоптоза повреждением ДНК активированная каспаза-2 расщепляет проапоптотический белок Bid, что запускает пермеабилизации внешней мембраны митохондрии (ПВММ), после чего происходит выход в цитоплазму цитохрома С, формирование апоптосомы и активация каспазы-9. Процесс ПВММ напрямую зависит от Mcl-1, который связывает проапоптотические белки Bak и Bax и не дает сформироваться порам в мембранах митохондрий. Поскольку уровень Mcl-1 зачастую повышен в опухолевых тканях, то этот белок представляет собой важную терапевтическую мишень. С помощью биоинформатических и структурных методов исследования нам удалось выявить молекулярные аспекты взаимодействия Mcl-1 с его природными антагонистами — белками Noxa и Bim, а также с одним из синтезированных низкомолекулярных ингибиторов. Полученные данные позволили сформулировать теорию о направленном создании соединений, вызывающих специфическую деградацию Mcl-1 в протеасомах.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На предыдущих этапах работы было показано, что замена потенциально фосфорилируемого серина 384 на аланин полностью блокирует процессинг каспазы-2 и формирование каталитически активного фермента. Более того было показано, что каспазы-2 с заменой S384A не обладает каталитической активностью, а клетки оверэкспрессирующие такую мутантную форму каспазы-2 более устойчивы к гибели. Это свидетельствовало о том, что данная замена является решающей для регуляции работы каспазы-2 через фосфорилирование по остатку Ser384. Для дальнейшего подтверждения данной модификации было решено провести анализ каспазы-2 дикого типа и с заменой Ser384Ala с помощью технологии Phos-tag™. Данный метод подразумевает добавление в полиакриламидный гель специального химического соединения, координирующего два иона магния, за счёт которых происходит взаимодействие этой добавки с фосфатной группой модифицированного белка. Благодаря образованию ионных связей между ионами металла и фосфатной группой у фосфорилированного белка снижается скорость миграции в геле, что позволяет разделить фосфорилированные и нефосфорилированную формы белков. Однако данный анализ не выявил различий в подвижности каспазы-2 дикого типа и мутанта с заменой S384A. Таким образом, мутация S384A не влияла на подвижность каспазы-2 в Phos-tag геле в норме или при индукции клеточной гибели индуцируемой повреждением ДНК. Чтобы подтвердить или опровергнуть результаты анализа методом Phos-tag, мы сконструировали фосфомиметик, заменив остаток серина в положении 384 на аспартат (S384D). Карбоксильная группа аспартата мимикрирует фосфатную группу, то есть фосфомиметик воспроизводит эффект фосфорилирования. Однако, замена S384D каспазы-2, как и S384A, приводила к ингибированию процессинга по сравнению с диким типом каспазы-2 как без обработки, так и после индукции клеточной гибели цисплатином. Можно заключить, что независимо от индукции клеточной гибели цисплатином замена серина в позиции 384 на отрицательно заряженную аминокислоту не восстановила активацию каспазы-2. Таким образом, необходимо дальнейшее исследование механизма влияния серина 384 на активность каспазы-2. На первом этапе исследований при проведении биоинформатического анализа кроме сайтов S384 и Т380, также были выявлены еще два потенциальных сайта фосфорилирования – остатки S220 и S307. Для проверки данных сайтов были созданы конструкции, содержащие замены S307А и S220А. Анализ данных мутантов показал, что после трансфекции и оверэкспрессии гена каспазы-2 наблюдался автокаталитический процессинг и накопление каталитически активных фрагментов р32 и р19 для каспазы-2 дикого типа и с заменами S220A, S307A, T380А, но не с мутацией S384A. Более того, поскольку остаток S220 согласно биоинформатическому анализу является очень консервативным, поэтому для этого остатка был сконструирован фосфомиметик – замена Ser220 на Asp (S220D). Анализ автокаталитической активации каспазы-2 показал, что замены S220А или S220D не приводили к изменению процессинга и активации каспазы-2, и накопление активных фрагментов мутированной каспазы-2 было сравнимо с белком дикого типа. Таким образом, можно сделать вывод, что остаток S384, но не S220, важен для активации каспазы-2. Однако механизм влияния серина 384 на активацию каспазы-2 остается неясным, поскольку ни замена на фосфомиметик, ни анализ с помощью Phos-tag технологии не подтвердили наличие фосфорилирования каспазы-2 по этой позиции. Другим направлением исследования пост-трансляционных модификаций каспазы-2 являлось убиквитинилирование данного белка. Поскольку масс-спектрометрический анализ выявил убиквитин и полиубиквитин среди потенциальных партнеров по взаимодействию с каспазой-2, нами была поставлена задача проанализировать убиквитинилирование каспазы-2 в опухолевых клетках в контроле и после индукции повреждений ДНК. Анализ убиквитинилирования продемонстрировал, что с каспазой-2 соосаждается убиквитин в нормальных условиях. Полученные данные свидетельствовали о том, что каспаза-2 подвергается убиквитинилированию в норме. При обработке клеток доксорубицином наблюдалось увеличение уровня убиквитина, что говорило об усилении убиквитинилирования каспазы-2 в условиях генотоксического стресса. Поскольку масс-спектрометрический анализ выявил убиквитин-связывающий белок р62 среди потенциальных партнеров по взаимодействию с каспазой-2, нами была поставлена задача изучить взаимодействие каспазы-2 и р62. Анализ препаратов каспазы-2 показали, что в них детектируется белок р62 при оверэкспрессии каспазы-2 как в нормальных условиях, так и в условиях генотоксического стресса при обработке ДНК-повреждающими препаратами цисплатином или доксорубицином. При этом обработка клеток цисплатином или доксорубицином приводила к увеличению уровня р62 в пробах, содержащих каспазу-2. Более того, по косвенным данным можно предположить, что каспаза-2 взаимодействует с р62 именно через убиквитин. Таким образом, нами было детектировано взаимодействие каспазы-2 и р62, убиквитинилирование каспазы-2, а также её протеасомная деградация. В связи с этим возник вопрос: опосредует ли р62 деградацию каспазы-2 или у их взаимодействия другая функция. Была проведена оверэкспрессия плазмиды, содержащей ген р62, для повышенного синтеза этого белка. Затем обрабатывали клетки химиотерапевтическими агентами цисплатином в концентрации 25 мкМ и доксорубицином в концентрации 2 мкМ. Результаты эксперимента показали, что при оверэкспрессии р62 наблюдалось падение уровня проформы каспазы-2 при обработке ДНК-повреждающими агентами и отсутствие накопления расщепленных форм. Однако падение уровня проформы каспазы-2 при оверэкспрессии р62 детектировалось и без обработки ДНК-повреждающими агентами, из чего следует предположение, что, возможно, р62 опосредует деградацию каспазы-2. Однако необходимо дальнейшее исследование, чтобы понять происходит ли р62-зависимая деградация каспаза-2 в протеосомах или по аутофагическому пути. На предыдущих этапах работы было установлено, что каспаза-2 транслоцируется в ядро в ходе генотоксического стресса в убиквитинилированной форме. Дальнейшее исследование ядерной функции каспазы-2 показало, что снижение уровня данного белка в клетках приводят к заметному уменьшению накопления маркера повреждений ДНК – фосфорилированной формы гистона Н2АХ. Полученные данные свидетельствовали о том, что каспаза-2 может участвовать в детекции повреждений ДНК, осуществляя тем самым свою ядерную функцию. Однако возник вопрос о потенциальной возможности влияния каспазы-2 на проникновение ДНК-повреждающих индукторов через мембраны клеток. Для проверки данного влияния был проведен анализ уровня повреждений ДНК в клетках с нормальным уровнем каспазы-2 и в нокаутных по каспазе-2. С помощью метода ДНК комет было показано, что уровень повреждений ДНК в дефицитных по каспазе-2 клетках сравнимы с клетками с нормальным уровнем этого белка. Таким образом, несмотря на разницу в уровне фосфорилирования H2AX повреждения ДНК остаются одинаковыми в клетках дикого типа и нокаутных по каспазе-2. Другой важной функцией каспазы-2 на ядерном уровне является ее участие во взаимодействии р53-MDM2. Ингибирование белок-белкового взаимодействия р53-MDM2 является перспективным направлением в терапии онкологических заболеваний для элиминации опухолевых клеток, сохраняющих р53 дикого типа. Белок р53 выполняет функцию онкосупрессора, активируясь под действием различных стрессовых стимулов, которые разрушают взаимодействие р53 с убиквитин-лигазой MDM2, направляющей р53 на деградацию. Примером соединений, обеспечивающих эффективное блокирование взаимодействия MDM2 с р53 и ведущих к повышению концентрации р53 в клетках, являются нутлины. Совместно с кафедрой медицинской химии и тонкого органического синтеза Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, был проведен анализ новых аналогов нутлинов, которые блокируют взаимодействие MDM2 с р53 и ведут к стабилизации последнего. Известно, что каспаза-2 расщепляет MDM2, снижая его уровень, и также способствует стабилизации р53, поэтому каспаза-2 зависимое расщепление MDM2 может вносить свой вклад в эффективность нутлин-подобных соединений. В своей работе мы исследовали биологическую активность алкоксиарилпроизводных имидазолина. Было обнаружено, что наиболее эффективно на клетки линии А549 действовало 2,4-diMeO производное, увеличивая уровень р53 в 3.4 раза по сравнению с контролем, при этом остальные соединения также показали максимальную эффективность при концентрации 20 мкМ. Результаты на линии RKO подтвердили эффективность действия 2,4-diMeO. В результате анализа клеточной гибели в линии А549 было выявлено, что 4-МеО и 2,4-diMeO практически не стимулировали индукцию апоптоза или некроза в концентрациях вплоть до 80 мкМ, что аналогично действию нутлина-3а, который вызывает апоптоз в линии А549 только в сочетании с ДНК-повреждающими агентами. Напротив, использование 4-EtO вело к значительной некротической гибели клеток в концентрациях свыше 20 мкМ, что свидетельствовало об его неспецифической токсичности. Таким образом, результаты исследования продемонстрировали наличие способности алкокси-арил производных имидазолина увеличивать уровень р53 в опухолевых клетках.