Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Запланированные в отчётном периоде работы были выполнены в полном объёме. В частности, были закуплены необходимые реактивы, расходные материалы и оборудование для успешного проведения 2-х экспериментов с функциональной разгрузкой задних конечностей (антиортостатическое вывешивание) крыс Вистар. Полученный биоматериал (камбаловидная мышца) был проанализирован с использованием современных биохимических и молекулярно-биологических методов. Полученные результаты были доложены и обсуждены на международном симпозиуме "21st IAA Humans in Space Symposium" (27-30 ноября 2017 г., Шеньжень, КНР). Кроме того, в июне 2018 г. планируется доложить полученные в рамках проекта результаты на международной конференции "39th Annual International Gravitational Physiology Meeting" (18-22 июня 2018 г., Нордвейк, Нидерланды). За отчётный период был проанализирован большой объём современных литературных данных по тематике проекта, что нашло своё отражение в двух обзорных статьях, которые были приняты к печати в рецензируемых научных журналах, индексируемых Scopus. В первый год реализации проекта планировалось получить новые данные роли энергетического статуса клетки (посредством изменения активности АМФ-активируемой протеинкиназы -AMPK) в запуске внутриклеточных атрофических процессов, связанных с изменением активности ряда анаболических и катаболических сигнальных каскадов. Предполагалось, что предобработка животных стимуляторм AMPK (AICAR – аналог АМФ) в первые сутки функциональной разгрузки (антиортостатическое вывешивание) может предотвратить снижение фосфорилирования AMPK и подавить активность протеинкиназы mTORC1. В то же время, стимулированная AMPK может активировать катаболические сигнальные пути через фосфорилирование транскрипционного фактора FOXO3, что в свою очередь приведёт к увеличению экспрессии Е3 убиквитин-лигаз MuRF-1 и MAFbx. Для выявления эффектов повышенного уровня фосфорилирования p70s6k после 24 часов разгрузки (было показано ранее Mirzoev et al., 2016) планировалось провести эксперимент с использованием рапамицина – специфического ингибитора mTORC1. Это позволило проверить гипотезу о том, что увеличенное фосфорилирование p70s6k по механизму негативной обратной связи (негативное фосфорилирование IRS1 по Ser636/639, Hsieh et al., 2014) может привести к инактивации сигнального каскада IRS-1/AKT/mTORC1 и одновременной активацией протеолиза. Результаты эксперимента с активацией AMPK показали, что дефоcфоpилиpование AMPK в первые 24 ч гpавитационной pазгpузки оказывает cущеcтвенное влияние на фосфорирование p70S6K - ключевого маpкеpа mTORC1-зависимого анаболического сигнального пути. При этом влияние фосфорилирования AMPK на работу убиквитин-протеасомной системы мы не обнаружили. Интересно, в группе вывешенных животных мы наблюдали даже гиперфосфорилирование mTORC1-зависимого маркёра p70S6k. В эксперименте с введением рапамицина (ингибитора mTORC1) на фоне 1-суточного антиортостатического вывешивания было показано, что в m.soleus крысы ингибирование mTORC1 предотвратило повышенное фосфорилирование p70S6K (Thr389). Содержание IRS-1 (субстрата инсулинового рецептора) в нашем эксперименте было снижено в обеих вывешенных группах. Ранее было показано, что в распаде IRS-1 может участвовать E3-лигаза Cbl-b (Nakao et al., 2009). Содержание IRS-1, фосфорилированного по негативному сайту S639, достоверно увеличивалось только в группе HS. Введение рапамицина предотвратило этот эффект и вернуло значение этого параметра к контрольному уровню. Полученные данные указывают на то, что при вывешивании сначала происходит функциональное блокирование IRS-1, а затем его распад под действием E3-лигазы Cbl-b. Важно отметить, что применение рапамицина на фоне разгрузки привело к тому, что в m.soleus крыс достоверного повышения уровня мРНК Е3-лигаз MuRF-1 и MAFbx не наблюдалось, а уровень белка MuRF-1 был существенно ниже, чем у крыс, вывешенных без препарата. При этом, содержание гистондеацетилазы 5 (HDAC5) в ядре у крыс группы с введением рапамицина при вывешивании был достоверно выше, чем у крыс, вывешенных без препарата. Известно, что HDAC5 в неактивной форме находится в ядре и препятствует экспрессии MuRF-1 (Du Bois et al., 2017). Когда HDAC5 выходит из ядра, она освобождает фактор TFEB, который, не будучи связанным, активирует экспрессию MuRF-1. Вероятно, фосфорилирование HDAC5, способствующее выходу HDAC5 из ядра, может зависеть от активности p70S6k. Таким образом, сигнальный путь mTORC1/p70S6K повышает свою активность в первые сутки разгрузки, что, по-видимому, связано с дефосфорилированием AMPK. Это приводит к увеличению экспрессии Е3-лигаз. Но механизм этого увеличения Е3-лигаз на ранних этапах разгрузки отличается от традиционного регулирования с помощью сигнального каскада Akt/FOXO3. Полученные фундаментальные данные о молекулярных механизмах развития мышечной атрофии помогут в дальнейшем разработать эффективные меры, направленные на снижение/предотвращение вызванных функциональной разгрузкой атрофических изменений в скелетных мышцах животных и человека.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Все запланированные в отчётном периоде работы были выполнены в полном объёме. В частности, были закуплены необходимые реактивы, расходные материалы и оборудование для успешного проведения 3-х экспериментов с функциональной разгрузкой задних конечностей (антиортостатическое вывешивание) крыс Вистар. Полученный биоматериал (камбаловидная мышца) был проанализирован с использованием современных биохимических и молекулярно-биологических методов. Организованы и проведены следующие эксперименты: 1. Эксперимент с введением бета-гуанидинопропионовой кислоты (β-GPA) на фоне 1-суточной функциональной разгрузки. β-GPA способна изменять соотношение макроэргических фосфатов в мышечных волокнах, а именно, увеличивать количество АМФ и снижать количество АТФ, что может приводить к активации AMPK. Полученные в рамках данного эксперимента данные позволили сделать вывод о том, что на раннем этапе моделируемой микрогравитации (1 сутки) активность фермента AMPK, связанная с изменением соотношения макроэргов, может играть роль в модуляции mTORC1-сигналинга в камбаловидной мышце крысы. 2. Эксперимент с введением ингибиторов AMPK креатина (с целью увеличения уровня КФ и АТФ, что может приводить к снижению активности AMPK) и дорсоморфина (Compound C). Креатин или Compound C животные получали c 7 по 14 день функциональной разгрузки задних конечностей. Главный вывод по данному эксперименту состоял в том, что введение креатина с 7-е по 14-е сутки функциональной разгрузки задних конечностей крыс частично предотвратило потерю сухого веса m. soleus, что сопровождалось предотвращением повышенного фосфорилирования AMPK (Thr172), ULK1 (Ser555) и сниженного фосфорилирования AKT (Ser473). 3. Эксперимент с введением ингибитора протеинкиназы D1 (PKD1) на фоне 1-суточной функциональной разгрузки. PKD1 может фосфорилировать альфа-субъединицу AMPK по S485/491, ингибируя её активность. Гравитационная разгрузка в течение 24 часов привела к достоверному увеличению фосфорилирования протеинкиназы D1 (PKD1) на 98% (p<0,05) относительно контрольной группы. Введение ингибитора PKD полностью предотвратило данное увеличение фосфорилирования PKD1. При этом фосфорилирование AMPK ожидаемо снизилось в результате 1-суточного антиортостатического вывешивания на 46% (p<0,05) по сравнению с контролем. Применение ингибитора PKD1 на фоне вывешивания привело к восстановлению уровня фосфорилирования AMPK (Thr172) до контрольных значений. Таким образом, можно заключить, что фосфорилирование AMPK (Thr172) в m. soleus крысы на раннем этапе гравитационной разгрузки может зависеть от активности протеинкиназы D1 (PKD1). Полученные в рамках данного проекта результаты были представлены и обсуждены на международной конференции "39th Annual International Gravitational Physiology Meeting" (18-22 июня 2018 г., Нордвейк, Нидерланды). По результатам, представленным в докладе, была опубликована небольшая статья в журнале Frontiers in Physiology (импакт-фактор: 3.394, Q1 по JCR). Кроме того, была подготовлена и направлена в редакцию международного журнала, индексируемого в Web of Science, объёмная статья под названием "Elevated p70S6K phosphorylation in rat soleus muscle during the early stage of unloading: causes and consequences". Кроме того, полученные в рамаках данного проекта результаты будут обсуждены и доложены на международной конференции "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" (20 - 24 мая 2019 г., Пущино, Московская область) и международной конференции "40th Annual Meeting of the International Society for Gravitational Physiology" (26-31 мая 2019 г., Нагоя, Япония). Таким образом, план работы, запланированный на второй год выполнения проекта, был успешно выполнен.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На третьем этапе выполнения проекта планировалось проверить гипотезу о возможности предотвращения атрофии постуральной камбаловидной мышце (m.soleus) крысы с помощью предобработки животных лекарственным препаратом класса бигуанидов метформином. В связи с этим был проведён эксперимент, в котором лабораторные крысы Вистар подвергались антиортостатическому вывешиванию (для развития атрофических изменений в m. soleus) и одновременному введению метформина (300 мг/кг) с питьевой водой. Животные были разделены на 4 группы: 1) «С» - виварный контроль; 2) С+Met – виварный контроль + получение метформина; 3) HS – 7-суточное антиортостатическое вывешивание без получения метформина; 4) группа HS+Met - 7-суточное антиортостатическое вывешивание + метформин (крысы получали метформин (300 мг/кг) с питьевой водой ежедневно в течение 7 дней до вывешивания, а затем в первые 3 дня 7-суточного вывешивания). Получение животными метформина до вывешивания и в течение 3-х дней после вывешивания было связано с тем, чтобы не допустить снижения активности АМФ-активируемой протеинкиназы (AMPK), которое наблюдается в первые дни антиортостатического вывешивания (Mirzoev et al., 2016; Vilchinskaya et al., 2017). Для выявления возможных антиатрофических эффектов метформина были проанализированы как морфо-функциональные параметры камбаловидной мышцы, так и внутриклеточные биохимические/молекулярно-биологические маркеры, вовлечённые в процессы синтеза и распада белка. Измерение силовых показателей изолированной камбаловидной мышцы проводились с помощью Aurora Scientific Dual Mode Lever System 305C-LR (Канада); диаметр мышечных волокон и соотношение быстрых и медленных волокон были установлены с помощью иммуногистохимического анализа. С помощью вестерн-блот анализа образцов мышечной ткани было получено содержание пуромицин-связанных белков (по которому можно судить об интенсивности белкового синтеза), убиквитин-конъюгированных белков, а также определено содержание ряда тотальных и фосфорилированных целевых белков, которые принимают участие в регуляции анаболических и катаболических процессов в клетке. С помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (RT-qPCR) была проанализирована экспрессия генов таких регуляторов протеолиза, как MuRF1, atrogin-1(MAFbx), calpain-1, Ub (убиквитин). Основные выводы по результатам работы следующие: 1) потребление крысами метформина в течение 7-и дней до и 3-х дней во время 7-суточного антиортостатического вывешивания частично предотвратило снижение веса камбаловидной мышцы, её абсолютной силы, а также уменьшение диаметра мышечных волокон медленного типа; 2) введение метформина предотвратило трансформацию миозинового фенотипа в камбаловидной мышце крысы, вызванную 7-суточным антиортостатическим вывешиванием; 3) в камбаловидной мышце животных, которые получали метформин и подвергались антиортостатическому вывешиванию было обнаружено увеличение фосфорилирования активности AMPK (Thr172), GSK3-beta (Ser9) и FOXO3(Ser253) по сравнению с группой вывешивания без получения метформина. Введение метформина вывешенным животным не оказало влияние на фосфорилирование p70S6K (Thr389) и интенсивность белкового синтеза; 4) экспрессия мРНК кальпаина-1 и убиквитина в группе вывешенных животных, получавших метформин была достоверно ниже, чем в группе вывешенных животных, которые получали плацебо. За отчётный период результаты по Проекту были представлены на 4-х международных конференциях, а также были опубликованы 2 статьи в журналах, входящих в базу данных Web of Science Core Collection, при этом одна из статей в журнале, входящем в первый квартиль (Q1) по импакт-фактору SCImago Journal & Country Rank (http://www.scimagojr.com). Таким образом, план работы, запланированный на третий год выполнения проекта, был успешно выполнен.