Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Болезнь Паркинсона (БП) – распространенное нейродегенеративное заболевание, для лечения которого в настоящее время нет ни одного терапевтического средства, препятствующего или замедляющего прогрессирование гибели нейронов мозга. Настоящий проект направлен на поиск химических соединений, фармакологических шаперонов глюкоцереброзидазы (GBA), повышающих ферментативную активность GBA, что рассматривается сегодня в качестве возможного подхода к терапии как БП, ассоциированной с наличием мутаций в гене GBA (GBA-БП), так и нейрональных форм болезни Гоше (БГ), обусловленного мутациями в гене GBA аутосомно-рецессивного заболевания, относящегося к классу лизосомных болезней накопления. В ходе выполнения первого этапа проекта методом молекулярной динамики (МД) впервые были получены полноатомные модели мутантных (аминокислотных замены N370S и L444P) форм GBA с учётом гликозилирования, а также проведен молекулярный докинг известных конкурентных ингибиторов GBA (изофагомин, N-бутил-дезоксиноджиримицин (bDNJ)) в активном сайте фермента. На поверхности фермента впервые установлены потенциальные аллостерические сайты связывания малых химических соединений. Для проведения последующего молекулярного докинга был выбран сайт, локализованный вблизи аминокислотного остатка 370, в котором расположена замена N370S, образующий глубокую впадину на поверхности фермента с параметром заглублённости 0,86. В настоящее время описано два неингибирующих аллостерических активатора GBA (NCGC00188758 (производное пиразолопиримидина) и NCGC00241607 (производное салициловой кислоты)). Молекулярный докинг вышеуказанных химических соединений в сайте связывания мутантной (N370S) формы фермента показал, что данные соединения способны встраивать химические группы (пиразолопиримидиновое (NCGC00188758) и бензольное (NCGC00241607) кольца) в образующуюся впадину, и образуют до трёх водородных связей с аминокислотными остатками. Средняя свободная энергия связывания данных соединений составила -31,16 ккал/моль и-36,74 ккал/моль (метод MMGBSA), что более чем в полтора раза меньше в сравнении с вычисленными свободными энергиями связывания изофагомина и bDNJ. МД (длина траектории 100 нс) показала, что гликозилирование не вызывает конформационных изменений GBA не только на уровне третичной, но и вторичной структур. Проведен скрининг мутаций N370S и L444P гена GBA, а также полиморфных вариантов, ассоциированных с риском развития БП, но не приводящих к развитию БГ (E326K, T369M) среди 800 пациентов с БП. Выявлено 14 носителей мутаций и 29 носителей полиморфных вариантов GBA. Сопоставлена эффективность различных способов культивирования макрофагов периферической крови (с сывороткой человека и с колониестимулирующим фактором роста макрофагов (М-КСФ)). Проведено культивирование макрофагов пациентов с БГ (N=4) и контрольной группы (N=10) с последующей оценкой ферментативной активности GBA методом тандемной масс-спектрометрии (ВЖХ-МСМС) в сухом пятне клеток. Показано, что культивируемые макрофаги отражают дисфункции GBA, выявляемые в сухом пятне крови при БГ. Впервые проведена оценка эффективности восстановлении ферментативной активности мутантной GBA на культуре первичных макрофагов пациентов с БГ при воздействии фармакологических шаперонов GBA, изофагомина и амброксола. Ферментативная активность GBA макрофагов периферической крови пациентов с БГ (N=3) при культивировании в присутствии амброксола (50мкМ) увеличивалась от 1.2 до 1.9 раз, что составило 11.6 (±2.3%) от ферментативной активности GBA в контрольной группе. В тоже время при обработке макрофагов двух пациентов с БГ изофагомином (30мкМ) наблюдали увеличение ферментативной активности GBA в 2 и 3.6 раз, что составляло 11,6% и 44% от среднего уровня ферментативной активности GBA в контрольной группе. В нашем исследовании показано более выраженное влияние изофагомина на увеличение активности GBA макрофагов периферической крови пациентов с БГ, по сравнению с амброксолом. Эффективность изофагомина в восстановлении активности GBA продемонстрирована также на первичной культуре фибробластов от пациента с БГ (N370S/L444P). В настоящее время считается, что распространение патологических агрегатов альфа-синуклеина при БП между нейронами носит прионоподобный характер. Предполагается, что распространение нейротоксичных форм белка может происходить посредством внеклеточных микровезикул (ВМВ). В рамках настоящего этапа проекта охарактеризованы ВМВ, полученные из спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с БП с использованием метода последовательного ультрацентрифугирования (анализ траекторий наночастиц (NTA); распределение ВМВ по размеру методом динамического светорассеяния; цитометрический анализ маркера экзосом CD9 на поверхности ВМВ; электронная микроскопия), а также исследовано их воздействие на выживаемость глиальной культуры (А172) методом проточной цитометрии (окрашивание на анексин V и пропидий йодид (PI)) и оценке кинетики пролиферативной активности xCELLigence RTCA DP Analyzer (Biosciences, Inc., США). Влияния ВМВ СМЖ на пролиферативную активность, а также на индукцию апоптоза глиальных клеток выявлено не было. Полученная методом МД модель гликозилированных мутантных форм GBA будет в дальнейшем использована для поиска потенциальных аллостерических активаторов данного фермента. Проведенное исследование позволило впервые предположить возможный механизм взаимодействия двух описанных ранее аллостерических активаторов c GBА. Показано, что культивирование макрофагов периферической крови пациентов с дисфункцией GBA с последующей оценкой активности GBA методом ВЭЖХ-МС/МС может существенно упростить задачу скрининга новых соединений для лечения как нейрональных форм БГ, так и GBA-БП  

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Настоящий проект посвящен разработке новых аллостерических активаторов (фармакологических шаперонов) лизосомного фермента глюкоцереброзидазы (GBA), их синтезу и оценке эффективности их действия (с оценкой ферментативной активности GBA, концентрации лизосфинголипидов, эффективности транслокации GBA в лизосомы) на клеточных линиях (первичные культуры фибробластов и макрофагов периферической крови пациентов с болезнью Гоше (БГ) и болезнью Паркинсона с мутациями в гене GBA (GBA-БП)), так и на модельных животных (Drosophila melanogaster с дисфункцией ортолога GBA человека). Предполагается, что данные соединения могут быть использованы в терапии заболеваний человека, связанных с дисфункцией GBA, таких как БГ и GBA-БП. На настоящем этапе нами проведен докинг двух описанных в литературе фармакологических шаперонов (ФШ) NCGC00188758 (далее N58) и NCGC00241607 (далее N07), в аллостерическом сайте связывания, находящемся вблизи аминокислоты S370 мутантной формы GBA (N370S). Проверили стабильность комплексов GBA-соединение методом молекулярной динамики (МД) и рассчитали свободные энергии связывания соединений с GBA N370S. Наименьшая средняя свободная энергия связывания по результатам двух запусков МД, рассчитанная по методу MMGBSA для N58 составила -31,16 ккал/моль, для N07 – -36,74 ккал/моль, что более чем в полтора раза меньше в сравнении с вычисленными свободными энергиями связывания конкурентных ингибиторов изофагомин (ifm) и (N-бутил-дезоксиноджиримицином). Каждое из анализируемых соединений частично размещается в углублении, образовавшемся на поверхности в результате замены N370S (N58 – пиразолопиримидиновый гетероцикл, N07 – бензольное кольцо), и может образовывать до трёх водородных связей с белком. Полученные данные впервые позволили объяснить молекулярный механизм действия данных фармакологических шаперонов GBA. С использованием метода молекулярного моделирования нами предложены химические модификации соединения N58, направленные на повышение его растворимости в воде, за счёт уменьшения количества гидрофобных химических групп (уменьшения суммарной гидрофобной площади поверхности, доступной растворителю), либо их замены на полярные группы. Введение полярных групп также должно способствовать образованию дополнительных водородных связей с белком, стабилизирующих положение соединения в сайте связывания. Нами предложено пять соединений, являющихся производными N58, методом молекулярного докинга установлена их способность связываться с описанным нами аллостерическим сайтом связывания, методом МД проверена стабильность комплексов. Показано, что соединение VI обладает наименьшей свободной энергией связывания – -33,92±3,65 ккал/моль. Проведен химический синтез соединения N58, являющегося производной пиразолопиримидина, а также четырех соединений с предложенными модификациями. Все соединения охарактеризованы с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии. Методом виртуального скрининга провели поиск соединений, входящих в состав базы данных ZINC Drug Database (ZDD), способных связываться с выявленным аллостерическим сайтом. В состав базы ZDD входит 2924 соединения, являющиеся лекарственными препаратами и биологически активными добавками, одобренными к применению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) и свободно доступными в продаже в виде чистых соединений. Среди соединений выбрали два, демонстрирующих способность встраиваться в сайт связывания и образовывать комплекс с белком, характеризующийся высокой абсолютной величиной оценочной функции: ZINC01530605 кромолин (Cromolyn) и ZINC53682927 NADH. Тип связывания NADH c белком схож с соединением N58, а кромолина – с соединением N07. Методом МД установили, что комплекс кромолина с мутантной формой N370S нестабилен, соединение частично покидает сайт связывания. В то же время комплекс NADH с белком хотя и подвижен, но, достаточно, стабилен, и характеризуется низкой энергией связывания -41,31±8,31 ккал/моль. Из двух выявленных соединений NADH выбрали для экспериментальной проверки способности восстановления активности мутантной формы GBA. Нами проведено тестирование эффективности NADH, ранее описанного аллостерического активатора N58, а также предложенных нами модификаций данного соединения (соединение 3, соединение 8) на первичной культуре фибробластов от пациента с БГ (N370S/L444P), а также на первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с БГ. Токсичность данных соединений проверена в отношении первичной культуры макрофагов человека с использованием MTS теста. Для сопоставления эффективности анализируемых соединений в восстановлении активности GBA, снижении концентрации лизосфинголипидов и транслокации GBA в лизосомы макрофаги периферической крови пациентов с БГ (N=8) также культивировали с известными ФШ GBA, амброксолом и изофагомином. Впервые проведено сопоставление эффективности действия известных ФШ GBA (амброксол, изофагомин), являющихся конкурентными ингибиторами фермента, и аллостерических ФШ GBA (N58 и его предложенных модификаций). Впервые показано, что на первичной культуре макрофагов от пациентов с БГ соединение N58 восстанавливает активность GBA также эффективно как изофагомин (до 50% активности фермента в контроле), в то время как амброксол менее эффективен. Также как и в случае изофагомина соединение N58 восстанавливало ферментативную активность GBA более эффективно у носителей более мягких мутаций гена GBA (N370S/L444P), по сравнению с носителем в одном из аллелей мутации, приводящей к отсутствию полноразмерного белка (84dupG). Оценка колокализации маркера лизосом LAMP2 и GBA иммуногистохимическим методом при культивировании макрофагов от пациентов с БГ в присутствии ФШ GBA конкурентных ингибиторов (амброксол, изофагомин), а также синтезированных аллостерических шаперонов GBA (N58, соединение 3, соединение 8) показало, что оба известных ФШ GBA эффективно восстанавливают транcлокацию GBA в лизосомы, в то время как синтезированные соединения также усиливают данный процесс, но в меньшей степени. Завершены исследования по характеристике экстраклеточных везикул спинномозговой жидкости пациентов с БП. Охарактеризована выживаемость и уровень локомоторной активности мух Drosophila melanogaster с дисфункцией ортолога GBA человека. Показано, что данная линия мух имеет снижение выживаемости и уровня локомоторной подвижности по сравнению с wt. Изофагомин в концентрации 50мкМ не влиял на измеряемые показатели. Таким образом, за отчетный период используя полноатомную модель GBA, созданную нами на первом этапе работы, методами молекулярного докинга и МД нами проанализирована возможность связывания с аллостерическими сайтами фермента химических производных пиразолопиримидина и ряда соединений из доступных некоммерческих базы данных. Отобраны соединения, показавшие наибольшую эффективность связывания, проведен их химических синтез. На первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с БГ впервые показано, что эффективность соединения N58 (аллостерический активатор) в восстановлении ферментативной активности GBA сопоставима с действием известного ФШ GBA (конкурентный ингибитор фермента) изофагомина. В дальнейшем нейропротекторный эффект соединения N58, а также его производных, показавших максимальную эффективность связывания при проведении МД будет проверен на Drosophila melanogasterс с дисфункцией ортолога GBA.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Настоящий проект посвящен разработке новых аллостерических активаторов (фармакологических шаперонов) лизосомного фермента глюкоцереброзидазы (GBA), их синтезу и оценке эффективности их действия (с оценкой ферментативной активности GBA, концентрации лизосфинголипидов, эффективности транслокации GBA в лизосомы) на клеточных линиях (первичные культуры фибробластов и макрофагов периферической крови пациентов с болезнью Гоше (БГ) и болезнью Паркинсона с мутациями в гене GBA (GBA-БП)), так и на модельных животных (Drosophila melanogaster с дисфункцией ортолога GBA человека). Предполагается, что данные соединения могут быть использованы в терапии заболеваний человека, связанных с дисфункцией GBA, таких как БГ и GBA-БП. Нами предложено два соединения, являющихся производными NCGC00241607 (N07). Методами молекулярного моделирования, используя принцип индуцированного соответствия, установили возможные варианты связывания этих соединений в сайте, расположенном вблизи петли L1; исходное соединение N07 и модифицированное соединение N3 обладают схожими величинами свободной энергии связывания, соединение N2 связывается с меньшей афинностью. В отличие от N07, в соединениях N2 и N3 йоданилиданая группа взаимодействует не со спиралью H7 (а.к. остатки 357-372), а с остатками 316-319 петли L1. Для выявления механизма работы исследуемых молекулярных шаперонов построили атомарную модель фермент-субстраратного комплекса GBA—глюкоцереброзид в активном центре (АЦ) и тройного комплекса GBA—глюкоцереброзид—химическое соединение (N58, N07). Остаток глюкозы стабилизируется в АЦ пятью водородными связями с а.к. остатками фермента, атома кислорода OE2 каталитического остатка E340 с углеродом C1 глюкозы находится на расстоянии атаки 3,22±0,12Å. Проанализировали все рассчитанные на протяжении выполнения работы траектории МД и установили, что связывание исследованных в работе малых молекул уменьшает подвижность аминокислотных остатков петли L1 (а.к. остатки 311-319) и приводит к появлению в ней структурированных участков, представленных спиралью типа 310. Согласно данным литературы такие изменения в структуре петли L1 наблюдают в активной форме GBA. Следовательно, связывание малых молекул вблизи петли L1 может способствовать лучшему взаимодействию фермента с субстратом глюкоцереброзидом или с белком-кофактором сапозином С. Проведен химический синтез соединения N07, являющегося производной салициловой кислоты, а также двух соединений с предложенными модификациями. Введенные модификации были направлены на повышение растворимости соединений. Все соединения охарактеризованы с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии. Нами проведено тестирование эффективности ранее описанного аллостерического активатора N07, а также предложенных нами модификаций данного соединения (соединение N2, соединение N3) на первичной культуре фибробластов от пациента с БГ (N370S/L444P), а также на первичной культуре макрофагов периферической крови пациентов с БГ и пациентов с GBA-БП. Токсичность данных соединений проверена в отношении первичной культуры макрофагов человека с использованием MTS теста. Впервые проведено сопоставление эффективности действия известных ФШ GBA (амброксол, изофагомин), являющихся конкурентными ингибиторами фермента, и аллостерических ФШ GBA (N07 и его предложенных модификаций). В экспериментах на первичной культуре макрофагов пациентов c GBA-БП с генотипом (N370S/wt) данные соединения оказались существенно более эффективны в восстановлении активности GBA, чем исходное соединение N07. Влияние данных соединений на активность GBA была также продемонстрирована на линии фибробластов от пациента с БГ (генотип N370S/L444P). Нейропротекторные свойства соединений была также протестирована в отношении их на модельных животных (Drosophila melanogaster с дисфункцией ортолога GBA человека, линия CG31414Mi). Соединение N2 двукратно повышало активность ортолога gba и оказывало наиболее выраженный нейропротекторный эффект (иммуногистохимическое окрашивание дофаминергических нейронов). Таким образом, в ходе выполнения проекта нами предложены два новых соединения являющимися перспективными в качестве возможных нейропротекторных препаратов в первую очередь для лечения GBA-БП ассоциированной с мутацией N370S.