Аннотация результатов, полученных в 2017 году
На первом этапе проекта был налажен процесс забора и транспортировки биоматериала от пациентов с раком легкого из нескольких онкологических учреждений Санкт-Петербурга. В исследование были включены 19 больных, не получавших цитостатической или лучевой терапии и поступивших для прохождения хирургического лечения. В двух случаях дальнейшее гистологическое исследование не подтвердило диагноз немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), и эти образцы были исключены. Материал от 17 пациентов был использован для создания первичных клеточных культур, 5 линий впоследствии утратили пролиферативную активность, и в настоящий момент поддерживаются 12 культур. Фрагменты опухоли четырех больных были трансплантированы подкожно иммунодефицитным мышам NOD-SCID Gamma (NSG). Перевивка опухоли от каждого пациента проводилась шести NSG-мышам. К моменту оформления отчета известны результаты получения ксенографтов для первых двух больных: у 2 мышей из 6 (пациент ID7) и у 1 мыши из 6 (пациент ID11) наблюдаются признаки роста опухоли. Наилучшие результаты были достигнуты при совместном подкожном введении опухоли и субстрата Матригеля. Выполнены запланированные работы по созданию линий мышей с гетерозиготными мутациями в генах, для которых предполагается ассоциация с генетическим риском РЛ: завершены генноинженерные процедуры (выбор участков внесения разрывов в гены BLM, GPRC5A, XRCC2, CHEK2, ATM, BARD1, XPA,NBS1 и синтез гидовых РНК) и начат процесс создания трансгенных животных. Осуществлены 10 процедур микроинъекций компонентов системы CRISPR/Cas9 непосредственно в цитоплазму яйцеклеток мышей и подсаживание выживших после этой манипуляции клеток самкам-реципиентам инбредной линии F1 C57Bl/6 CBA. Начат молекулярно-генетический анализ первичных опухолей: все случаи НМРЛ, включенные в исследование, были протестированы на наличие частых мутаций в гене EGFR (ex19del, T790M, L858R, L861Q, G719X, S768I, ex20ins). В 4/17 (23.5%) образцов обнаружена микроделеция в 19-ом экзоне гена. Организован сбор плазмы крови с целью осуществления персонифицированного скрининга опухоль-специфических маркеров. Помимо операционного материала, от пациентов с НМРЛ получены до- и послеоперационные образцы плазмы. В дальнейшем забор крови для выделения внеклеточных нуклеиновых кислот будет производиться при контрольных обследованиях пациентов. Один из вошедших в работу случаев был проанализирован с помощью цифровой капельной ПЦР: в парных образцах плазмы крови от больной с делецией в 19 экзоне гена EGFR данная мутация не была идентифицирована. Обнаружен новый кандидатный вариант в гене системы репарации ДНК (NEIL p.T278I), который, как предполагается, может быть ассоциирован с повышенным риском рака легкого. Данная мутация в гомозиготном состоянии выявлена у молодой пациентки с РЛ. Её роль верифицируется в молекулярно-эпидемиологическом исследовании по типу «случай-контроль».

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В 2018 году были продолжены работы по сбору образцов первичных опухолей пациентов с диагнозом немелкоклеточного рака легкого. Образцы карцином использовались для получения первичных клеточных культур и ксенографтов, небольшой фрагмент ткани замораживался для дальнейшего высокопроизводительного генетического анализа нуклеиновых кислот. Процент успешной перевивки опухоли в культуру составил 16% (17/105). С целью увеличения скорости и эффективности набора материала для получения первичных культур были также использованы образцы плевральной жидкости пациентов с плевритом при НМРЛ. За 2018 год было получено 10 образцов плевральной жидкости, из них удалось перевить 4 первичные культуры. Все растущие культуры верифицировали цитологически и, в случае подтверждения опухолевой природы растущих клеток, тестировали чувствительность к химиопрепаратам. Всем включённым в исследование пациентам был выполнен молекулярно-генетический анализ клинически значимых мутаций: EGFR, BRAF, KRAS, транслокаций ALK, ROS1, делеции MET. В данный момент все пациенты, из образцов первичных опухолей (n = 17) или плевритов (n = 4) которых удалось получить клеточные культуры, получают стандартную адъювантную терапию или находятся под динамическим наблюдением. Оценка химиочувствительности была выполнена для 10 культур. Были использованы препараты карбоплатин, цисплатин, алимта (пеметрексед), паклитаксел, гемцитабин, митомицин, доксорубицин, этопозид и 5-фторурацил и их комбинации. Был определен оптимальный пассаж для тестирования химиочувствительности клеток. Все изучаемые культуры клеток показали высокую чувствительность к карбоплатину, при этом 100%-ая гибель клеток не наблюдалась ни в одном случае (максимальный эффект составил 98% погибших клеток). Паклитаксел оказался наиболее эффективным препаратом in vitro, так как только он один из всех протестированных веществ приводил к гибели 100% клеток в большинстве культур. Также была обнаружена высокая чувствительность клеточных культур к митомицину (в среднем выживаемость клеток составляла 1%). Кроме того были протестированы комбинации препаратов. Не наблюдалось суммации эффектов цитотоксических веществ в комбинации: незначительное увеличение их эффективности, скорее всего, обусловлено наличием клеток, чувствительных к одному и устойчивых ко второму препарату. За 2018 год увеличено количество мышей-реципиентов ксенографтов опухолей от больных НМКРЛ. В данный момент получено 4 информативных триплета «первичная опухоль - клеточная линия - ксенографт». Для этих образцов будет выполнен экзомный и транскриптомный анализ. Получены клеточные линии, содержащие ряд значимых мутаций в гене EGFR: замена L858R, ассоциированная с чувствительностью опухолей к ингибиторам данного рецептора; мутация T790M, ассоциированная с резистентностью к EGFR-специфическим препаратам первого поколения; двойная мутация T790M/L858R (double-mutant, DM), отражающая процесс приобретения опухолью резистентности в ходе лечения. В настоящее время проводятся эксперименты, направленные на изучения влияния мутаций в гене EGFR на чувствительность клеток к цитостатическим препаратам. Результаты этих экспериментов могут оказаться важными для планирования последовательности между таргетной и цитостатической терапией при лечении рака лёгкого. За 2018 год с использованием системы генетического редактирования CRISPR/Cas9 были получены мыши с гетерозиготными мутациями в генах BLM, GPRC5A, XRCC2, CHEK2, ATM, BARD1 и NBS1. Полученные первичные мыши-трансгены были скрещены с мышами противоположного пола линии C57BL/6. Для мышей с мутациями CHEK2 (3 аллельных варианта) и GPRC5A (2 аллельных варианта) получено потомство возможных носителей мутаций (37 и 53 потомка соответственно). В возрасте 2 месяцев для этих мышей будет проведено генотипирование, по результатам которого будут сформированы опытная и контрольная группы для каждого из генов. В 2018 году был выполнен анализ данных полноэкзомного секвенирования 19 образцов геномной ДНК пациентов с ранним началом заболевания, билатеральным раком легкого или с наличием транслокации ALK в опухоли, направленный на идентификацию генетических причин предрасположенности к раку легкого. Было обнаружено несколько кандидатных вариантов: BARD1 c. 2300_2301del, ATM p. Q1478X, CHEK2 exon 10 c.1046dupA, XPA c. 268_269insA, XRCC2 c.96delT. Их возможная причастность к повышению риска рака легкого была протестирована с помощью эпидемиологического исследования. Выявить случаи носительства данных вариантов среди образцов пациентов крайних групп (ДНК молодых пациентов и пациентов с ALK-позитивными опухолями) не удалось, что, вероятно, свидетельствует о чрезвычайной редкости данных мутаций.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
К концу 2019 года в рамках исследования по проекту было привлечено более 200 пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Данный проект в первую очередь направлен на создание индивидуальных моделей для персонализированного подхода к подбору терапии пациентам с немелкоклеточным раком легкого. Изначально предполагалось, что за несколько лет нам удастся создать алгоритм процессинга образца первичной опухоли от извлечения во время операции до подбора химиотерапии на основе invitro тестов к моменту прогрессии заболевания. Однако мы столкнулись с множеством как технических, так и биологических трудностей. В частности, при получении первичных клеточных культур по стандартному протоколу было выявлено, что клетки, содержащие классические «драйверные» мутации элиминируются на ранних пассажах и, по-видимому, замещаются нормальными и стромальными клетками. Для высокопроизводительного экзомного секвенирования было доступно два триплета образцов «норма – первичная опухоль – ксенографт». Результаты этой части исследования показали, что первичная опухоль и ксенографт значительно различаются по спектру соматических мутаций. Полученные нами данные о значительных расхождениях профиля мутаций между исходными опухолями и ксенографтами представляют очень большой интерес для биомедицинской науки. В целом, наблюдаемые нами процессы, такие как утрата мутантных («драйверных») клонов на ранних пассажах при стандартных режимах культивирования, а также несоответствие паттерна соматических мутаций ксенографтов говорят о чрезвычайной сложности стабильной генерации адекватных персонализированных моделей опухолей. В качестве перспективной альтернативы мы предложили создание персонализированных моделей, основанных на использовании тканевых эксплантов. Экспланты представляют собой тонкие срезы опухолевой ткани, полученные из первичной опухоли и помещенные в питательную среду, к которой добавлены исследуемые противоопухолевые препараты. Мы установили, что экспланты, полученные из разных опухолей, могут различаться по спектру лекарственной чувствительности. Нами достигнуты значительные успехи в «полуавтоматизации» анализа тканевых эксплантов: применение экспрессионных ПЦР-тестов позволяет значительно увеличить число маркеров лекарственной чувствительности, а также заменить крайне трудоёмкую и субъективную процедуру морфологического подсчёта определённых категорий клеток более эффективным РНК-анализом. В задачи проекта также входило исследование чувствительности стандартных клеточных линий к различным препаратам. На клеточной линии NCI-H1975 (содержащей две мутации в гене EGFR: L858R и T790M) был проведен скрининг библиотеки химических соединений (1400 веществ), одобренных американским агентством по контролю за продовольствием и медикаментами (FDA). Был обнаружен эффект синергии при совместном использовании гефитиниба и тиогуанина. Данные результаты будут проверены на первичных клеточных культурах с перспективой трансляции в клиническое исследование. Работы по исследованию наследственной предрасположенности к раку легкого, а также по созданию линий трансгенных мышей, запланированные в данном проекте, выполняются в соответствии с графиком проекта. В течение 2019 года был запущен эксперимент по индуцированному канцерогенезу у мышей-носителей мутаций в генах CHEK2 и GPRC5A. Получено потомство трансгенных мышей с мутацией NBS1. Получены особи-фаундеры с наследственными мутациями в генах XRCC2 и BLM. Жизнеспособных и стабильных линий мышей с инактивирующими мутациями в генах ATM, XPA, BARD1 получить за время выполнения проекта не удалось.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На завершающем этапе проекта по созданию индивидуальных моделей для определения чувствительности опухолей к лекарственной терапии проспективный набор новых образцов был несколько снижен, однако за весь период выполнения проекта в исследование было включено 248 пациентов. Основные усилия в 2020 году были направлены на разработку техники тканевых эксплантов как потенциальной модели для определения индивидуальной чувствительности к лекарственным препаратам. Данная модель обладает как определенными преимуществами (короткое время эксперимента, сохранение тканевой структуры образца), так и недостатками (невозможностью высокопроизводительного скрининга, отсутствием в настоящее время методов оценки ответа опухоли). Апробация методики тканевых эксплантов потребовала в 2020 году значительного количества модификаций протокола: была определена необходимость парных (“зеркальных”) контролей для каждого из условий инкубирования, уменьшено количество исследуемых препаратов. К сожалению, снижение динамики поступления операционного материала в связи эпидемической обстановкой (временным закрытием операционных отделений) позволило выполнить полноценное исследование тканевых эксплантов только для 21 пациента. Основываясь на результатах оценки экспрессии маркеров пролиферации в тканевых пластинках, полученных в 2019 году, были выбраны образцы условно “чувствительные” и “резистентные” к использованным лекарственным препаратам (гефитиниб и цисплатин). 24 образца от 8 пациентов были подвергнуты транскриптомному секвенированию. После биоинформатической обработки результатов секвенирования удалось выявить гены, экспрессия которых увеличивается при воздействии на тканевой эксплант цисплатина. Изменение экспрессии этих генов было исследовано на всех имеющихся в распоряжении коллектива образцах РНК, полученных из тканевых пластинок. Было продемонстрировано статистически значимое увеличение экспрессии генов HSPA2 (Hsp70), HEXIM1, TSYPL2, TOB1 в ответ на воздействие цисплатином, но не гефитинибом. Данные результаты демонстрируют, что клетки, находящиеся в тканевой пластинке, реагируют на воздействие химиопрепарата в клеточной среде в соответствии с его механизмом действия (активируется система репарации ДНК). Нам не удалось обнаружить генов, дифференциально экспрессирующихся в ответ на воздействие гефитиниба в EGFR-мутантных и немутантных образцах. В 2020 году были продолжены работы по получению клеточных культур из первичных опухолей легкого. Принципиальным критерием успеха при попытках поддержания опухолевых клеток в культуре было сохранение маркерных мутаций первичной опухоли в процессе пассирования. С использованием комбинации фидерного слоя и ROCK-ингибитора не удалось сохранить клетки, несущие, драйверное генетическое событие дольше 3-4 пассажа. Для четырех образцов было апробировано использование кондиционированной среды клеточной культуры H1299. В результате этой модификации удалось получить клеточную культуру NSCLC 249, сохраняющую пролиферативную активность до настоящего времени (33 пассаж). Таргетное секвенирование образцов ДНК первичной опухоли и различных пассажей полученной культуры выявило присутствие в первичной опухоли и сохранение в процессе пассирования мутации BRAF p. N581S. Более детальная характеризация культуры NSCLC 249 (экзомное секвенирование, оценка изменения экспрессионных маркеров, кариотипирование) будет выполнена в 2021 году. В 2020 году был завершен эксперимент по индуцированному канцерогенезу уретаном у мышей с наследственными мутациями в генах CHEK2 и GPRC5A. Обнаружено, что опухоли легкого чаще развивались в группе мышей с мутацией GPRC5A (20/27, 74%), чем в контрольной группе животных (28/55, 51%) (p=0.045). В отчётному году было завершено исследование факторов наследственной предрасположенности к развитию опухолей легкого. Была выполнена оценка частот гомозиготных кандидатных мутаций в группе больных раком легкого и среди здоровых доноров. Значимых различий в встречаемости кандидатных вариантов (PCDHGB7 p.Val405Leu; ALDH18A1 p.Thr299Ile) обнаружено не было.