Аннотация результатов, полученных в 2018 году
За отчётный период проведено исследование закономерностей удерживания и разделения, а также термодинамики адсорбции стереоизомеров различных дипептидов на хиральных неподвижных фазах (ХНФ) на основе макроциклических антибиотиков эремомицин, ристоцетин и тейкопланин. Эти данные дополнены компьютерным моделированием взаимодействия дипептидов с антибиотиковыми селекторами. Совокупность полученных результатов позволила понять связь строения и физико-химических свойств (изоэлектрической точки, липофильности) молекулы дипептида с её хроматографическим поведением в подвижных фазах разного состава и при разной величине рН. На примере дипептида гли-асп изучен макроскопический механизм адсорбции. Показано, что модель поверхности, состоящей из двух типов энантиоселективных адсорбционных центров, один из которых характеризуется быстрой, а второй – медленной кинетикой адсорбции наилучшим образом описывает динамику элюирования в слое ХНФ с привитыми макроциклическими антибиотиками. Полученная информация даст возможность оптимальным образом подбирать условия хроматографического разделения стереоизомеров дипептидов при решении аналитических и препаративных задач.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За отчётный период проведено исследование закономерностей энантиоселективного удерживания и термодинамики адсорбции стереоизомеров различных ди и трипептидов на хиральных неподвижных фазах (ХНФ) на основе циклодекстринов, а также на ХНФ с привитыми макроциклическми антибиотиками эремомицин, ристоцетин А и тейкопланин. Первая группа ХНФ оказалась слабо селективной по отношению к стереоизомерам коротких пептидов, тогда как адсорбенты на основе привитых антибиотиков характеризуются высокой энантиоселективностью, поэтому основное внимание в работе было посвящено изучению этих материалов. Показано, что адсорбцию коротких пептидов на поверхности антибиотиковых ХНФ осуществляют только привитые селекторы, которые экранируют доступ аналитов к остаточным силанольным группам. Небольшая часть селекторов характеризуется сильной гидрофильностью и способна к прочному энантиоселективному удерживанию дипептидов, но проявляет эти свойства только в маловодных подвижных фазах, когда соответствующие центры связывания не экранированы молекулами воды. Совокупность полученных результатов позволила выяснить механизмы влияния состава и рН подвижной фазы на удерживание коротких пептидов и разделение их стереоизомеров. Главным фактором влияния состава растворителя является его сольватирующая способность, хотя в области малых концентраций органического модификатора важной становится его собственная адсорбционная активность и способность вытеснять с поверхности молекулы аналита. Роль рН подвижной фазы в основном сводится к контролю степени ионизации пептида и функциональных групп привитого селектора. Модель адсорбционного равновесия, в которой общее удерживание является линейной комбинацией парциальных удерживаний всех ионных форм пептида получила подтверждение на нескольких примерах в рамках линейной хроматографии и на примере глициласпарагиновой кислоты и лейциллейцина в рамках нелинейной хроматографии. Сравнение хроматорафического поведения ди и трипептидов показало, что все исследованные трипептиды удерживаются сильнее, чем их димерные аналоги, что позволяет предположить наличие размерного эффекта. Полученная информация даст возможность оптимальным образом подбирать условия хроматографического разделения стереоизомеров коротких пептидов при решении аналитических и препаративных задач.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Исследования этапа 2020 г. проводились по трём направлениям: (1) адсорбционное равновесие дипептидов на хиральных неподвижных фазах (ХНФ) с привитыми макроциклическими антибиотиками, (2) динамика адсорбции и (3) компьютерное моделирование образования комплексов антибиотик-дипептид. Сочетание полученных результатов позволило существенно улучшить понимание механизмов энантиоселективной адсорбции низкомолекулярных пептидов. Были рассмотрены различные подходы к конструированию изотерм адсорбции дипептидов на ХНФ на примере адсорбции стереоизомеров лейциллейцина на ХНФ Chirobiotic R с привитым антибиотиком ристоцетин А. Показано, что общепринятый подход, основанный на двухцентровой модели поверхности, в котором локальные изотермы адсорбции подбираются эмпирически и игнорируется влияние растворителя, хорошо описывает экспериментальные данные в тех случаях, когда системные пики (возмущения состава подвижной фазы, вызванные движением по колонке анализируемого вещества) не соприкасаются с пиком элюируемого дипептида. Учёт влияния растворителя обязателен в противном случае. Данный подход может быть легко расширен на случай сосуществования в растворе нескольких ионных форм дипептида, связанных ионными равновесиями. Было установлено, что неселективные адсорбционные центры, т.е. те, которые не проявляют энантиоселективных свойств, практически отсутствует на поверхности рассмотренных антибиотиковых ХНФ. Это указывает на то, что (i) привитые хиральные селекторы эффективно экранируют ахиральную поверхность носителя от контакта с адсорбатами и (ii) основная масса привитых молекул антибиотика существует на поверхности в энантиоселективной (по отношению к дипептидам) конфигурации. Также было установлено, что механизм удерживания дипептидов является смешанным, сочетающим ионообменную и молекулярную адсорбцию. Относительный вклад каждого из составляющих зависит от структуры антибиотика, состава и рН подвижной фазы. Исследовано хроматографическое удерживание пентапептидов группы энкефалинов на ХНФ Chirobiotic R и Nautilus-R. Оно подчиняется тем же закономерностям, что и удерживание ди- и трипептидов. Так же как и для последних важным для хирального распознавания пентапептидов является стереохимическая конфигурация С-терминальной аминокислоты. Обнаружено различие в хроматографическом поведении энкефалинов на двух указанных ХНФ, несмотря на то, что обе несут один хиральный селектор – ристоцетин А. Это явление, наблюдавшееся также и для дипептидов, было объяснено различиями в строении привитых селекторов, вызванных разными методиками иммобилизации антибиотика на поверхности носителя. Молекулярные механизмы энантиоселективного связывания были изучены методом молекулярного докинга на примере антибиотика ристоцетина А и энантиомеров глициллейцина и лейцилглицина. Эти исследования подтвердили важность конфигурации С-терминального остатка для хирального распознавания. Так, Gly-D-Leu образует с ристоцетином А более прочный комплекс, чем Gly-L-Leu, благодаря формированию дополнительной водородной связи и более плотному контакту с поверхностью молекулы антибиотика. Изучение динамики адсорбции было выполнено на примере колонки Chirobiotic R и стереоизомеров лейциллейцина с применением метода моментов и метода остановки потока. Было обнаружено необычное поведение кривых ван Деемтера – они оказались выпуклыми вверх. Кинетика адсорбции относительно медленная, но не энантиоселективная в пределах погрешности эксперимента. В то же время, кривые ван Деемтера демонстрировали явное энантиоселективное поведение, т.е. отличались для разных энантиомеров. Формальный анализ методом моментов приписывает такое поведение аксиальной диффузии, параметры которой существенно различались для стереоизомеров лейциллейцина.