Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Создание лекарственных средств нового поколения, эффективных в отношении инфекций бактериальной этиологии, является одной из наиболее актуальных и социально-значимых задач и проблемой национального масштаба. Особенно актуальна во всем мире проблема лечения туберкулеза, который занимает второе место среди причин смертности от инфекционных заболеваний. Сложности лекарственной терапии туберкулеза состоят в возникновении множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) у возбудителя туберкулеза. В этой связи имеется острая потребность в новых эффективных, нетоксичных противотуберкулезных средствах. Тенденции развития современного фармацевтического рынка, связанные с переходом к применению энантиомерных (оптически активных) лекарственных препаратов, требуют разработки новых синтетических подходов к оптически активным препаратам фторхинолонового ряда, а также поиска методов синтеза других соединений азинового ряда с фармакофорными группами, ответственными за селективное взаимодействие с биологическими мишенями. В рамках данного проекта запланированы фундаментальные исследования, направленные на решение ключевой проблемы приоритетного направления по борьбе с инфекционными заболеваниями – разработку методов синтеза новых фторхинолоновых антибиотиков и других производных азинового ряда в качестве перспективных антибактериальных, в том числе противотуберкулезных средств. В результате проведенных научных исследований в отчетный период получены следующие основные результаты: Осуществлен синтез функционально замещенных кумаринов и фторхинолонов и разработаны эффективные подходы к созданию антибактериальных препаратов с двойным механизмом действия – гибридных соединений фторхинолонов, в которых фторхинолоновый и кумариновый фрагменты соединены через спейсер. Получены новые фторсодержащие 1,3-бензотиазин-4-оны на основе о-фторбензоилизотиоцианатов и 7-гидразино-замещенных фторхинолонов либо гидразидов 6-фторхинолин-4-он-3-карбоновых кислот. С целью модификации соединения –лидера СГС-1329 изучены реакции бензоилизотиоцианатов с различной степенью фторирования с 1-карбонил-замещенными пиперазинами, реакции пиперазинил-1,3-бензотиазин-4-она с бензоилхлоридами и бензойными кислотами, реализована модификация фторсодержащих 2-пиперазино-1,3-бензотиазинонов путем введения ацильной либо ароильной группы в положение 4’пиперазинильного фрагмента. Разработан метод синтеза ранее новых N-арил-4-(5-арилоксифуран-2-ил)пиримидин-5-аминов, основанный на комбинации реакции кросс-сочетания по Бухвальду-Хартвигу с различными анилинами с последующим замещением нитрогруппы на производные фенолов. Показано, что 4-[5-(3,4,5-триметоксифенокси)фуран-2-ил]замещенные пиримидины, обладают высокой антибактериальной активностью в отношении кокковых инфекций, в ряде случаев в десятки раз превышающей активность препарата сравнения спектиномицина. Синтезированы новые производные [1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразина, [1,2,4]триазоло[1,5-b][1,2,4,5]тетразина и имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразина, содержащие амидиновый фрагмент и алкоксигруппу. Показано, что антибактериальная активность 6-(3,5-диметил-1H-пиразол-1-ил)-3-пентилтио[1,2,4]триазоло[4,3-b][1,2,4,5]тетразина в отношении штамма Neisseria gonorrhoeae превышает в 2 раза активность препарата сравнения спектиномицина. Среди 6-алкоксиазолотетразинов найдены эффективные туберкулостатики с МИК 2.0-0.35 мкг/мл. Синтезированы аналоги соединения-лидера СГС-1279 - 7-замещенные триазолодигидропиримидины с различными гетарильными заместителями, и соответствующие поданды на их основе. Среди синтезированных аналогов не выявлено соединений, по туберкулостатической активности превышающих соединение-лидер. С целью снижения токсичности туберкулостатика на основе тетразоло[1,5а]пиримидина - СГС-1012 (МИК 0.75 мкг/мл), разработан метод синтеза соответствующего поданда с выходом более 40 %. С целью повышения активности в отношении DHFR микобактерии туберкулеза 6-(дифторметил)-1-фенипиридазин-4(1H)-она (СГС-1365, МИК 1.5 мкг/мл) проведена расчётная модификация его структуры с использованием базы замещённых пиридазинонов (более 200 соединений). Геометрическая оптимизация 3D структур соединений выполнена полуэмпирическим методом в программе Chem3D 16.0. Докинг в молекулу mt-DHFR (ID 1df7) был проведён в программе LeadIT. Показано, что на аффинность лиганда к рецептору положительное влияние оказывает наличие заряженных групп –COOH или/и –NO2. Липофильные фторированные группы вносят положительный вклад в аффинность за счёт взаимодействия с алифатическими группами аминокислот. Предложено модифицировать исходную молекулу СГС-1365 путем введения по положению С-2 карбоксильной или фенильной группы, либо введением нитро- или карбокси-группы в фенильный заместитель при атоме азота. Для определения возможного механизма действия (предположительно ингибирования дигидрофолатредуктазы) для соединения-лидера СГС-1279 и его аналогов с известной туберкулостатической активностью, выполнен их докинг в молекулу mt-DHFR (ID 1df7). Исходя из полученных результатов был сделан вывод о том, что механизм ингибирования микобактерий производными 4,7-дигидро-[1,2,4]триазоло[1,5-a]пиримидина возможно не связан с ингибированием дигидрофолатредуктазы. Данный вывод планируется верифицировать с использованием других программ и других исходных РСА комплексов ввиду возможной погрешности расчётов, связанной с особенностями используемой функцией оценки энергии связывания лиганда с рецептором и выполнением докинга в жёсткую структуру белка. С использованием расчетных 3D-QSAR методов сделан прогноз биологической активности в ряду замещенных (азоло)дигидропиримидинов, среди которых выявлены соединения с потенциальной анальгезирующей, анестезирующей, противоопухолевой (ингибиторы CDK4 или топоизомеразыI), антиВИЧ, психотропной и прогестогенной активностью. С целью изучения механизма возникновения лекарственной устойчивости к соединению-лидеру СГС-1481 и выявления его терапевтических мишеней получена библиотека мутантных штаммов M. smegmatis mc2, устойчивых к СГС-1481. Для 9 мутантных штаммов M. smegmatis mc2 определена минимальная ингибирующая концентрация в жидкой 30 мкмоль/мл (0,516 мг/мл) и на агаризованной среде 20 мкмоль/мл. МИК СГС-1481 в отношении мутантных штаммов варьирует от 60 мкмоль/мл (1,032 мг/мл) до 120 мкмоль/мл (2,064 мг/мл). Для определения возможной перекрестной лекарственной устойчивости и анализа лекарственной чувствительности отобранных мутантов, устойчивых к соединению СГС-1481, к антибиотикам различных химических классов был использован метод бумажных дисков. Обнаружены небольшие изменения в уровне чувствительности к антибиотикам офлоксацину, стрептомицину, эритромицину и стрептомицину. Вероятно, мутации, приводящие к устойчивости к соединению СГС-1481 не вызывают перекрестной устойчивости к другим препаратам. Выделена тотальная ДНК девяти мутантных штаммов, устойчивых к СГС-1481, с чистотой 1,8-1,9 A260/280 в количестве 30-40 мкг для каждого штамма. В результате полногеномного секвенирования геномов этих штаммов выявленные гены, мутации в которых предположительно приводят к формированию устойчивости к соединению СГС-1481. Биоинформатический анализ геномов дикого и устойчивых с СГС-1481 штаммов, выявил в геномах штаммов M. smegmatis (MIT-R) единичные нуклеотидные замены в генах: acyl-CoA synthetase MSMEG_4731, redox-sensitive transcriptional activator SoxR MSMEG_5450, hypothetical protein MSMEG_2585. Разработан эффективный одностадийный способ получения соединения-лидера СГС- 1279 с выходом 75 %, выполнена часть исследований, необходимых для оформления лабораторного регламента. Проведено исследование туберкулостатической активности в отношении штамма H73Rv 25 новых соединений, выявлена группа замещенных алкоксиазолотетразинов (МИК 2.0-0.35 мкг/мл). Для соединений-лидеров: СГС-1481 (МИК 0.35 мкг/мл) и СГС-1272 (МИК 0.75 мкг/мл) изучена острая токсичность на лабораторных мышах, которая составила 600 и 1200 мг/кг соответственно. Соединения СГС-1481 и СГС-1272 рекомендованы для изучения терапевтического эффекта на лабораторных животных в 2019 г. Осуществлена наработка соединений-лидеров СГС- 1279, СГС-1313 и СГС-1329 в количестве 30-40 г каждого для отработки схемы лечения зараженных животных (доза и продолжительность лечения). Наиболее выраженный терапевтический эффект выявлен для препарата СГС-1279 в концентрации 10 мкг/мл и препарата СГС-1329 в концентрации 60 мкг/мл. Наибольший токсический эффект выявлен при применении препарата СГС-1313. С учетом результатов 2017 г. для соединения-лидера СГС-1313 запланирован повторный эксперимент по изучению терапевтического действия. Соединения-лидеры СГС-1279 и СГС-1329 рекомендованы для дальнейших доклинических исследований.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Создание лекарственных средств нового поколения, эффективных в отношении инфекций бактериальной этиологии, является одной из наиболее актуальных и социально-значимых задач и проблемой национального масштаба. Особенно актуальна во всем мире проблема лечения туберкулеза, который занимает второе место среди причин смертности от инфекционных заболеваний. Сложности лекарственной терапии туберкулеза состоят в возникновении множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) у возбудителя туберкулеза. В этой связи имеется острая потребность в новых эффективных, нетоксичных противотуберкулезных средствах. Тенденции развития современного фармацевтического рынка, связанные с переходом к применению энантиомерных (оптически активных) лекарственных препаратов, требуют разработки новых синтетических подходов к оптически активным препаратам фторхинолонового ряда, а также поиска методов синтеза других соединений азинового ряда с фармакофорными группами, ответственными за селективное взаимодействие с биологическими мишенями. В рамках данного проекта запланированы фундаментальные исследования, направленные на решение ключевой проблемы приоритетного направления по борьбе с инфекционными заболеваниями – разработку методов синтеза новых фторхинолоновых антибиотиков и других производных азинового ряда в качестве перспективных антибактериальных, в том числе противотуберкулезных средств. В результате проведенных научных исследований в отчетный период получены следующие основные результаты: Осуществлен синтез функционально замещенных кумаринов и фторхинолонов – аналогов известных антибактериальных препаратов пефлоксацина, ципрофлоксацина и левофлоксацина. Разработаны эффективные подходы к созданию антибактериальных препаратов с двойным механизмом действия – гибридных соединений фторхинолонов, в которых фторхинолоновый и кумариновый фрагменты соединены через нерасщепляемый алифатический спейсер. Изучена туберкулостатическую активность синтезированных соединений (МИК в отношении M. tuberculosis H37Rv составляет >7.8 мкг/мл). Получены близкие структурные аналоги препарата Макозинон, в частности, 8-нитро-2-циклоалкилимино-1,3-бензотиазин-4-оны. Показано, что взаимодействие 3-нитро-2,6-дифторбензоилизотиоцианата с циклоалкилиминами приводит к образованию 2,5-бис(циклоалкилимино)-8-нитро-1,3-бензотиазин-4-онов, представлены доказательства существования продуктов реакции в виде 8-нитро-, а не 6-нитро-изомеров. Диэтил-4,4’-(8-нитро-4-оксо-4H-1,3-бензотиазин-2,5-диил)дипиперазин-1-карбоксилат проявил наиболее высокую туберкулостатическую активность (МИК в отношении M. tuberculosis H37Rv составляет 8 мкг/мл). Реализованы модификации пиперазинового фрагмента в 5-фтор-2-пиперазинил-1,3-бензотиазин-4-онах, в частности замена этоксикарбонильной группы на другую алкокси-группу, введение ароильного и бензильного фрагмента, конъюгация с пиразинамидом через спейсер CH2CH2C(O). Наиболее перспективным из рассмотренных модификаций представляется замена этоксигруппы на т-бутоксильную. 2-(4-трет-Бутоксикарбонилпиперазин-1-ил)-5-фтор-1,3-бензотиазин-4-он превосходит по активности СГС-1329 при тестировании в растворе (МИК в отношении M. tuberculosis H37Rv, M abscessus ATCC 19977 составляет 4 мкг/мл) и на плотной питательной среде (диаметр зоны < 9 мм при добавлении 100 мкг тестируемого соединения). Разработаны методы синтеза ковалентно-связанных конъюгатов азолотетразинов с изониазидаоми глутатионом. В результате исследования туберкулостатической активности полученных гуанидиниевых азолоазиниевых систем впервые был выявлен селективный ингибитор QcrA микобактерии туберкулеза (МБТ). Ранее среди производных[1,2-b]имидазо][1,2,4,5]тетразинов были найдены эффективные ингибиторы серин-треониновых протеинкиназ микобактерии туберкулеза. Полученные данные позволяют рассматривать этот класс соединений как мультитаргетные ингибиторы ферментов МБТ. В ряду 3,6-дизамещенных симм-тетразинов, содержащих фрагменты аллил- и пропаргиламинов, а также фармакофорные имидазолильные, бензимидазолильные, индазолильные и 1,2,3-триазолильные заместители, выявлены соединения, антибактериальная активность которых превышает в несколько раз активность препарата сравнения спектиномицина. Показано, что дигидропиримидиновые поданды на основе 3-аминотриазола, наряду с 1,5а-изомерами образуются 4,3а-изомеры, а также разнозамещенные поданды, имеющие гидроксильную группу наряду с дигидропиримидиновым фармакофором, и являются перспективными для синтеза димерных структур (twin drugs). В ряду N-арил-4-(5-нитрофуран-2-ил)пиримидин-5-аминов, ранее проявивших широкий спектр антибактериальной активности, найдены соединения с высоким уровнем антимикобактериальной активности (МИК<1 мкг/мл), но относительно высокий уровень цитотоксичности. Выполнено компьютерное исследование противотуберкулёзной активности группы соединений 4-(5-нитрофуран-2-ил)пиримидинового ряда, проявивших самую высокую активность в отношении МБТ в опытах in vitro, проведенных в этом году. Для этого с помощью докинга в программе LeDock была оценена аффинность указанных соединений к пяти ферментам, являющихся перспективными мишенями для разработки противотуберкулёзных лекарственных средств, а именно к дигидрофолатредуктазе (PDB 1DF7), оксидазе декапренилфосфорил-D-рибозы DprE1 (PDB 6HFV), редуктазе белка-переносчика еноил-ацил групп InhA (PDB 5JFO), транспортеру миколовой кислоты MmpL3 (PDB 6AJG), а также тирозинфосфатазе B MptpB (PDB 2OZ5). Наиболее перпективным соединением с точки зрения показателей аффинности является 4-(5-нитрофуран-2-ил)-N-(4-нитрофенил)пиримидин-5-амин, который показал наиболее высокое сродство к трём изучаемым ферментам из пяти. С целью повышения туберкулостатической активности и снижения токсичности замещенных дигигидроазолопиримидинов, азолотетразинов и бензотиазинонов разработаны подходы к получению липосом соединений СГС-1279, СГС-982 и СГС-1586. Получены граммовые количества липосом с высокой эффективностью включения соединений с размером частиц около 200 нм и длительным сроком хранения. Полученные липосомальные лекарственные формы будут использованы для исследования туберкулостатической активности в опытах in vitro и изучения цитотоксичности, а также острой токсичности на животных. Выполнена оптимизация методов синтеза соединений-лидеров 2018 года. Показано, что выход продукта СГС-1481 можно увеличить до 65-70% при использовании в качестве стартового соединения 3,6-(4-метилимидазол-1-ил)-1,2,4,5-тетразина и гидрокарбоната натрия в качестве основания. В синтезе СГС-1272 заменой катализатора ПФК на нанoразмерный оксид TiO2-SiO2 удалось повысить выход с 48 до 60 %. Разработаны лабораторные технологии получения соединений-лидеров 2017 г. Осуществлена наработка СГС- 1279 в количестве 30 г, разработаны липосомальные лекарственные формы. С целью поиска потенциальных противотуберкулезных препаратов двунаправленного действия, использующих в качестве дополнительной биомишени микобактериальные серин/треониновых протеинкиназы осуществлен скрининг в тест-системе M. smegmatis_APHVIII+ 10 соединений различных классов. Показано, что исследованные вещества не проявили активности как ингибиторы серин/треониновых протеинкиназ и не являются веществами с двунаправленным действием. С целью установления механизмов действия и устойчивости Mycobacterium smegmatis к соединениям класса замещенных азинов и азолазинов определены минимальные ингибирующие концентрации 10 исследуемых веществ в отношении Mycobacterium smegmatis mc2 в жидкой среде. Для соединения СГС-1563 (МИК16,6 мкг/мл) получены штаммы M. smegmatis mc2, устойчивые к нему. Проведен биоинформатический анализ, в результате сравнения геномов штаммов дикого типа и устойчивого к СГС-1563, мутаций в геноме устойчивого штамма найдено не было, устойчивость определена как фенотипическая, возникающая вследствие эпигенетической регуляции. При сравнении геномов штамма дикого типа и мутантного штамма, устойчивого к веществу СГС-982, найдена инсерция, согласно литературным данным, приводящая к устойчивости штамма к веществу СГС-982. Определены минимальные ингибирующие концентрации (МИК) в отношении штамма M.tuberculosis H37Rv для 46 новых соединений. Выявлены одно соединение с МИК 0.47 мгк/мл, два соединения с МИК 0.94 мкг/мл, и 5 соединений с МИК 1.88 мкг/мл. В качестве соединений-лидеров 2019 года, перспективных для дальнейших исследований, могут быть рекомендованы СГС-1540 и СГС-1582, обладающие самыми высокими индексами селективности.