КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-14-00116

НазваниеАцетилирование метаболических и регуляторных белков: (пато)физиологическое значение и низкомолекулярные регуляторы.

РуководительБуник-Фаренвальд Виктория-Лариса Ивановна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2018 - 2020  продлен на 2021 - 2022

КАРТОЧКА ПРОДЛЕНИЯ ПРОЕКТА

КонкурсКонкурс 2018 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаацетилирование, ацилтрансферазы, пост-трансляционные модификации, изоформы белков, дегидрогеназы 2-оксокислот, ацил-КоА, сиртуин, регуляция метаболизма, механизмы адаптаций, компенсаторный ответ

Код ГРНТИ31.27.39


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект посвящен исследованию недавно установленного механизма регуляции метаболизма животных клеток, основанного на изменении свойств метаболических ферментов с помощью пост-трансляционной модификации остатков лизина данных ферментов ацетилированием. Цель проекта – расшифровка молекулярных механизмов системы этой регуляции на уровне отдельных ферментов центрального метаболизма. Задачи проекта включают: характеристику структурно-функциональных соотношений при ацилировании остатков лизина в ключевых ферментах центрального метаболизма ин витро, определение особенностей таких модификаций в зависимости от специфики метаболических сетей и изучение конкурентных отношений между различными ацилированными производными коэнзима А (КоА) при модификации ферментов ин витро и ин виво. С учетом полученных нами ранее результатов о связи тиамина (витамина В1) с ацетилированием, исследования по решению задач данного проекта предполагается сфокусировать на ферментах центрального метаболизма, взаимодействующих с такими продуцентами ацил-КоА как тиаминдифосфат(ТДФ)-зависимые полиферментные комплексы дегидрогеназ 2-оксокислот. Кроме того, известна связь тиамина и дегидрогеназ 2-оксокислот с транскрипционным регулятором р53, подвергающимся ацетилированию, в связи с чем проект предполагает изучить уровень ацетилирования р53 и функциональное значение этой модификации при направленном изменении метаболизма тиамина и/или функции дегидрогеназ 2-оксокислот. Тестируемая в проекте гипотеза состоит в саморегуляции метаболизма за счет механизма трансляции стационарной концентрации ацетил-КоА, продуцируемого и утилизируемого основными метаболическими путями, в скорость метаболизма за счет ацетил-КоА-зависимого ацетилирования ферментов центрального метаболизма и транскрипционного фактора р53. Помимо стационарной концентрации основного ацетилирующего агента животных клеток (ацетил-КоА), уровень ацетилирования ферментов будет зависеть как от деацетилаз (сиртуинов), так и от ацетил-трансферазной реакции, модифицирующей остатки лизина ферментов. В последнем случае регуляция может включать конкуренцию между различными ацильными производными КоА и/или тканеспецифическую экспрессию ацилтрансфераз. Данный аспект регуляторного ацетилирования в настоящее время практически не исследован, в том числе и потому, что вопрос о катализе ацетилирования остатков лизина в метаболических ферментах остается открытым. Применяемые для достижения цели проекта подходы включают изучение функциональной роли аминокислотных остатков в белках методами энзимологии с учетом структурных данных по белкам; биоинформатический анализ белковых и транскриптомных баз данных; методы иммуноферментного анализа, биохимический анализ ферментативных активностей и метаболомных профилей в гомогенатах тканей экспериментальных животных, масс-спектрометрическую идентификацию пост-трансляционных модификаций белков, а также разработанные в нашем предыдущем исследовании подходы по направленной регуляция дегидрогеназ 2-оксокислот ин виво, которые в настоящее время уже внедрены и в мировую практику. Планируемая в проекте разработка ряда новых идей в области регуляторного ацетилирования ферментов высоко актуальна. В числе таких идей тканеспецифичность данного регуляторного механизма, (пато)физиологическая роль конкуренции ацетилирования функционально важных остатков лизина ферментов с другими типами ацилирования и связь ацетилирования р53 с регуляцией центральных путей продукции природных ацилирующих агентов - ацил-КоА. Запланированное исследование позволит значительно продвинуться в понимании молекулярных механизмов регуляции конкретных ферментов и метаболических путей за счет ацетилирования и аналогичных ему реакций – так, как это было ранее сделано для системы пост-трансляционных модификаций белков фосфорилированием. По сравнению с глобальной идентификацией пост-трансляционных модификаций в широкомасштабных протеомных исследованиях, функциональная роль ацетилирования специфических остатков в ферментах центрального метаболизма, которую предполагается исследовать в данном проекте, охарактеризована крайне мало. В целом, научная значимость данного проекта состоит в устранении существующего дисбаланса в характеристике структуры и функции белков, что определит ускорение практического применения полученных результатов.

Ожидаемые результаты
В проекте будут получены приоритетные данные о молекулярных механизмах саморегуляции животных систем за счет влияния ацетилирования на каталитические и регуляторные свойства ферментов центрального метаболизма, с одной стороны, и на один из транскрипционных регуляторов энергетического метаболизма животных клеток, белок р53, с другой стороны. Мы исследуем, каковы специфические особенности регуляторного ацетилирования, связанные с физиологическими вариациями метаболизм в разных тканях или при гендерных и/или видовых различиях. Ожидаются экспериментальные результаты о действии тиамина (витамина В1) в качестве низкомолекулярного фактора сопряжения между ацетилированием метаболических ферментов и функцией р53. Такие низкомолекулярные регуляторы ацетилирования потенциально применимы для борьбы с патологиями, возникающими вследствие нарушений метаболизма, ведущих к его перепрограммированию. В частности, это наблюдается при таких социально-значимых болезнях, как злокачественная трансформация, диабет, ожирение и нейродегенерация, риск развития которых растет с увеличением продолжительности жизни и изменениями ноосферы. Результаты проекта позволят оценить степень контроля и молекулярные механизмы такого перепрограммирования метаболизма за счет ацетилирования основного транскрипционного регулятора энергетического обмена клетки, белка р53, с одной стороны, и активации т.н. факторов омоложения - деацетилаз (сиртуинов), с другой стороны. Ожидается охарактеризовать и низкомолекулярные регуляторы ацетилирования иного типа, действующие за счет сайт-специфического ингибирования продукции ацилированных производных коэнзима А (КоА) полиферментными комплексами дегидрогеназ 2-оксокислот. Предполагается проверить гипотезу о том, что данные регуляторы будут влиять на ацетилирование белков за счет изменения физиологического соотношения различных ацил-КоА, причем с учетом клеточной компартментализации можно ожидать, что метаболическая регуляция такими соединениями будет особенно выражена для супрамолекулярных структур ферментов, взаимодействующих с дегидрогеназами 2-оксокислот. Результаты проекта покажут, как сильно конкурируют различные ацил-КоА в реакции ацетилирования ферментов центрального метаболизма и каковы функциональные последствия такой конкуренции для регуляции метаболизма животных. Эти данные позволят оценить патологии регуляторного ацетилирования при наследственных заболеваниях, для которых характерно нефизиологическое накопление определенных производных ацил-КоА, таких как глутарил-КоА при мутациях глутарил-КоА дегидрогеназы. Таким образом, ожидаемые в проекте результаты позволят внести существенный вклад в развитие исследований в области регуляторного значения ацетилирования. Такие исследования активно ведутся во всем мире и призваны ответить как на научные вопросы, так и на общественно-социальные вызовы, связанные с воздействием негативных факторов внешней среды на устойчивость метаболизма животных систем.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Охарактеризованы механизмы регуляции отдельных ферментов центрального метаболизма путем пост-трансляционной модификации ацетилированием под действием ацетил-КоА in vitro. Ацетилирование глутаматдегидрогеназы мозга крыс влияло на каталитические и регуляторные параметры фермента. В результате было показано, что суммарный эффект ацетилирования глутаматдегидрогеназы in vivo является сложной функцией уровня ацетилирования конкретных остатков лизина и концентрации субстратов и регуляторов фермента. При ацетилировании под действием ацетил-КоА in vitro также показано увеличение максимальной скорости митохондриальной малатдегидрогеназы в реакции с оксалоацетатом, но не при низкой концентрации оксалоацетата и не в реакции с малатом. 2. Механизмы функциональных последствий ацетилирования глутаматдегидрогеназы in vitro и in vivo рассмотрены с учетом структурного анализа сайтов ацетилирования фермента. Определены остатки, ацетилирование которых может влиять на регуляцию (1) взаимодействия субстратов с каталитическим центром, (2) связывания лигандов с аллостерическими центрами и (3) белок-белковых взаимодействий при формировании гетерологических комплексов. 3. Исследование представленности определенных типов ацетилирования глутаматдегидрогеназы в печени, мозге и различных структурных отделах мозга, таких как кора больших полушарий, мозжечок и ствол, позволило определить тканеспецифические и гендерные различия в регуляции глутаматдегидрогеназы за счет ацетилирования. В целом, полученные нами результаты свидетельствуют о более выраженном ацетилировании глутаматдегидрогеназы мозга по сравнению с ферментом печени. При этом обнаружены значительные вариации ацетилирования в ГТФ-связывающем сайте. В частности, различный уровень его ацетилирования в мозге самцов и самок может определять гендерные различия чувствительности фермента к ингибированию ГТФ. Данный результат согласуется с известными из независимых исследований гендерными различиями в развитии болезни Паркинсона у пациентов с мутацией глутаматдегидрогеназы по сайту связывания ГТФ. 4. Биоинформатический анализ экспрессии семи изоформ сиртуинов показал наличие тканевой специфичности в их представленности, что согласуется с тканеспецифичными паттернами ацетилирования, которые были получены с использованием антител на ацетил-лизин. Так, доминирующими изоформами в мозге являются цитоплазматический сиртуин 2 и митохондриальный сиртуин 3, а в печени - сиртуины 1 - 3. Методом иммунодетекции ацетил-лизиновых остатков белков определено большее разнообразие ацетилированных белков в печени по сравнению с мозгом, где доминирует одна полоса с молекулярной массой около 57 кДа. 5. Показано, что введение животным тиамина оказывает влияние на систему ацетилирования белков центрального метаболизма и циркадную регуляцию таких изменений. Так, корреляции между активностью, ацетилированием и экспрессией глутаматдегидрогеназы в гомогенатах коры больших полушарий мозга зависят от времени суток и снижаются под действием тиамина. При этом введение животным тиамина меняет регуляторные эффекты последующего in vitro ацетилирования глутаматдегидрогеназы в гомогенатах коры головного мозга экспериментальных животных. 6. В гомогенатах коры больших полушарий мозга крыс определена корреляция между активностью продуцента ацетил-КоА, пируватдегидрогеназного комплекса, и содержанием сиртуина 3 - регулятора ацетилирования митохондриальных ферментов. Выявлены обратные корреляции экспрессии сиртуина 3 с уровнем субстрата катализируемой им деацетилазной реакции - НАД+ - и определяемыми в разных условиях активностями НАД+-зависимой мишени сиртуина 3 - глутаматдегидрогеназы. 7. При введении животным ингибитора пируватдегидрогеназы показаны биохимические изменения в системе ацетилирования мозга, сопровождающиеся физиологическими эффектами. Обнаруженные через 24 часа после введения изменения могут быть интерпретированы как компенсаторный ответ коры больших полушарий мозга на ингибирование продуцента ацетил-КоА - пируватдегидрогеназы. Хотя наблюдаемый эффект активации фермента (14%) в ответ на введение ингибитора не является статистически значимым в силу небольшой амплитуды и значительной вариабельности данного параметра между экспериментальными животными, уровни субстрата фермента НАД+ и аланина, находящегося в равновесии с еще одним субстратом пируватдегидрогеназы – пируватом – вследствие трансаминазной реакции, достоверно снижаются на 27% (p = 0,038) и 11% (р = 0,003), соответственно. Достоверно меняются и биохимические индикаторы системы ацетилирования белков: наблюдается 2-кратное увеличение общего уровня ацетилирования белков мозга (p = 0.018) при 1,6-кратном росте содержания сиртуина 3 (р = 0.009). Одновременно с биохимическими изменениями в коре больших полушарий мозга наблюдали выраженные изменения показателей ЭКГ, отражающих регуляцию сердечного ритма, на фоне некоторого снижения общего уровня тревожности обработанных ингибитором животных. Наблюдаемые физиологические эффекты согласуются с изменением метаболизма ацетилхолина - известного компонента регуляции сердечной деятельности, синтезируемого из ацетил-КоА, - вследствие пертурбацией такого продуцента ацетил-СоА, как пируватдегидрогеназа. При этом обнаруженные в данных экспериментах изменения сиртуина 3 и белкового ацетилирования в мозге показывают роль системы биологического ацетилирования в физиологических адаптациях к метаболическому стрессу.

 

Публикации

1. Бойко А.И., Цепкова П.М., Артюхов А.В., Алешин В.А., Казанцев А.В., Ксенофонтов А.Л., Рябов С.И., Лукашев Н.В., Граф А.В., Буник В.И. Долговременные эффекты регуляторов дегидрогеназ 2-оксокислот на метаболизм коры головного мозга крыс в норме и после спинномозговой травмы сборник трудов "Студенческого биохимического форума", - (год публикации - 2018).

2. Буник В.И. Redox-Driven Signaling: 2-Oxo Acid Dehydrogenase Complexes as Sensors and Transmitters of Metabolic Imbalance Antioxidants & Redox Signaling, - (год публикации - 2018).

3. Буник В.И., Граф А.В, Артюхов А.В.,Ксенофонтов А.Л., Баратова Л.А., Казанцев А.В., Лукашев Н.В. Selective inhibitors of mitochondrial 2-oxoacid dehydrogenases specifically affect behavioural and electrocardiographic parameters in rats 19th Tetrahedron Symposium, - (год публикации - 2018).

4. Данилова Е.Ю., Артюхов А.В., Граф А.В., Ксенофонтов А.Л., Казанцев А.В., Цепкова П.М., Зарубина С.А., Пометун А.А., Лукашев Н.В., Буник В.И. В мозге взрослых крыс, подвергшихся пренатальной гипоксии, повышен уровень триптофана и ослаблены гомеостатические механизмы сборник трудов "Студенческого биохимического форума", - (год публикации - 2018).

5. Мкртчян Г.В.,Юкал М., Мюллебнер А., Думитреску С., Камес М., Молдсио Р., Молкани М., Шефер С., Йохаур А., Шефер У., Хешелер Дж, Дувигне ДжС. Редл Х., Буник В.Л, Козлов А.В. . Thiamine preserves mitochondrial function in a rat model of traumatic brain injury, preventing inactivation of the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, Volume 1859, Issue 9, Pages 925-931 (год публикации - 2018).

6. Чашникова А.А., Артюхов А.В., Алешин В. А., Кэне Т., Буник В.И. Исследование регуляции глутаматдегидрогеназы животных путем ацилирования сборник трудов "Студенческого биохимического форума", - (год публикации - 2018).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Показано изменение уровня ацетилирования глутаматдегидрогеназы (ГДГ) в зависимости от времени суток, связанное с регуляцией функции фермента. Утром ацетилирование остатков лизина К84 (вблизи АДФ-сайта), К187 (рядом с активным центром) и К503 (связывание ГТФ) повышено по сравнению с вечером. При этом наблюдается высокая корреляция как между ацетилированием данных остатков ГДГ, так и между уровнями активности фермента без и в присутствии регуляторов. Вечером уровни ацетилирования остатков ГДГ снижаются, а корреляции пропадают. Эти суточные колебания ацетилирования ГДГ связаны с изменением реактивности фермента к его регуляторам АДФ, ГТФ и 2-оксоглутарату. Изменения таковы, что могут стабилизировать активность ГДГ при известных суточных вариациях уровней АДФ и ГТФ. Регуляция ГДГ этими метаболитами меняется при изменении суточной регуляции ацетилирования, наблюдающемся при введении крысам высокой дозы тиамина. Предложены молекулярные механизмы регуляции ГДГ при ацетилировании определенных остатков лизин фермента (Aleshin et al., 2020). Впервые показаны изменения аллостерической регуляции ГДГ мозга посредством ацетилирования, зависимые от времени суток и тиамина. Показан универсальный характер тиаминовой регуляции малат- и глутаматдегидрогеназ мозга животных (быка и крысы) (Меженская и др., 2020). Проведение ацилирования ГДГ мозга и печени ацетил КоА и различными ангидридами позволило показать: (1) влияние модификации на каталитические и регуляторные свойства фермента в зависимости от типа модификации, (2) конкуренцию ацетилирования и глутарилирования при воздействии на ГДГ различных ангидридов и (3) частичную защиту функции ГДГ 2-оксоглутаратом при модификации уксусным, но не глутаровым ангидридом. C использованием инкубации коммерческого препарата ГДГ с гомогенатами или митохондриями мозга в присутствии ингибиторов деацетилаз бутирата и/или никотинамида показано, что присущая митохондриям мозга деацетилазная активность соответствует не только сиртуинам, но и другим деацетилазам гистонового типа (HDAC). С учетом биоинформатического анализа экспрессии деацетилаз гистонового типа и уровней наблюдаемых деацетилазных активностей в митохондриях и гомогенате сделано предположение, что деацетилазы митохондрий мозга включают, помимо сиртуина 3, изоформу HDAC2. Данная серия опытов также предоставила свидетельства большей специфичности в отношении белковых субстратов реакций деацетилирования, чем ацетилирования. Проведен поиск моделей, в которых можно было бы наблюдать повышение экспрессии р53 и/или его ацетилированной формы. В клеточных моделях (N2a, A549) рост уровня р53 происходил при тиаминовом дефиците и/или ингибировании тиаминдифосфат-зависимых ферментов. В мозге крыс экспрессия р53 росла в модели эмоционального стресса. Однако рост уровня ацетилированного р53 не совпадал с ростом экспрессии р53, указывая на специфические условия, индуцирующие данную модификацию. Например, увеличение уровня ацетилирования р53 зависело от того, каким образом создавали тиаминовый дефицит в клетках и/или от его комбинирования с ингибированием тиаминдифосфат-зависимых ферментов. В исследованных нами животных моделях нейропатологий мы не наблюдали роста ацетилирования р53. В качестве регуляторов систем клеточного ацилирования в проекте используются ингибиторы комплексов дегидрогеназ 2-оксокислот, продуцирущих ацетил-, сукцинил и глутарил-КоА. В 2019 г. охарактеризована специфичность действия фосфоновых аналогов 2-оксоглутарата и 2-оксоадипата на комплексы ОГДГ (ОГДК) и ОАДГ (ОАДК). Определена высокая специфичность действия фосфоновых аналогов 2-оксоглутарата (сукцинилфосфонат) и 2-оксоадипата (адипоилфосфонат) на гомологичные ОГДК и ОАДК при физиологических концентрациях субстратов in vitro и на клеточные метаболомы in vivo. Структурная характеристика взаимодействия модельной ОГДГ с сукцинилфосфонатом и его моноэтиловым эфиром (Wagner et al., 2019) показала, что существенный вклад в специфичность ингибирования вносят значительные конформационные перестройки фермента при связывании фосфоновых аналогов субстратов. Даже небольшие вариации структуры ингибитора меняют его взаимодействие с активным центром фермента, приводя к нарушению индуцированного связыванием перехода к прочному комплексу с ингибитором. Этот механизм хорошо соответствует значительной разнице в эффективности ингибирования ОГДК и ОАДК сукцинилфосфонатом и адипоилфосфонатом, наблюдаемой в эксперименте. Добавление сукцинил-, глутарил- или адипоилфосфоната к клеткам позволило показать ожидаемую согласно данным in vitro специфичность действия аналогов на клеточные метаболомы, а также зависимость такого действия от экспрессии ОАДГ. По результатам этих исследований фосфоновые аналоги 2-оксоадипата (глутарилфосфонат) и 2-оксопимелата (адипоилфосфонат) предоставляют удобный инструмент для исследования роли ОАДГ-зависимой продукции глутарил-КоА в системе клеточного глутарилирования. Для исследования системы глутарилирования нами были получены антитела на глутариллизиновые остатки белков. При иммуноферментном анализе белков гомогената мозга крысы показано, что расположение в геле основных полос, соответствующих глутарилируемым белкам, и изменение степени их глутарилирования совпадает с положением белковых полос и изменением экспрессии ОАДГ. По результатам этих экспериментов ОАДГ является одним из основных глутарилируемых белков мозга. Следует отметить, что существенно менее интенсивное окрашивание наблюдалось в области, соответствующей ГДГ мозга, несмотря на то, что антитела вырабатывались на глутариллизиновые остатки модифицированной глутаровым ангидридом ГДГ. Введение крысам этерифицированной формы глутарилфосфоната, TEGP, привело к росту как экспрессии полосы ОАДГ 130 кДа, так и степени глутарилирования белковой полосы 130 кДа. Несмотря на рост экспрессии ОАДГ, не изменились ни внемитохондриальная активность ОАДК, ни уровень сиртуина 5. Это позволяет предположить инактивацию избытка экспрессированной ОАДГ при автоглутарилировании - реакции, аналогичной известному для других дегидрогеназ 2-оксокислот побочному процессу взаимодействия с субстратом. Введение этерифицированного адипоилфосфоната, ТМАР, не привело ни к росту экспрессии полосы ОАДГ массы 130 кДа, ни к росту глутарилирования белковой полосы 130 кДа. Однако при росте активности внемитохондриального ОАДК наблюдали падение уровня сиртуина 5. Можно предположить, что наблюдаемая разница в действии ингибиторов ОАДК на кору мозга крыс зависит от относительной эффективности их действия на ОАДК in vivo, в соответствии с которой клетка генерирует обнаруженные компенсаторные ответы. В модели патологий беременности выявлена гендерная зависимость изменений внемитохондриальной активности ОАДК и экспрессии сиртуина 5 в коре головного мозга взрослого потомства, испытавшего пренатальную гипоксию, по сравнению с контрольными животными. У перенесших такой стресс самок активность внемитохондриального ОАДК падала параллельно с падением экспрессии сиртуина 5, тогда как у самцов пренатальная гипоксия приводила к росту экспрессии сиртуина 5 без достоверного изменения активности ОАДК. При этом гипоксия повышала уровень свободного триптофана, в катаболизме которого участвует ОАДК, в мозге и самцов, и самок. Действие ингибирующего ОАДК фосфонового аналога 2-оксоадипата – глутарилфосфоната – на контрольных животных ограничивалось повышением экспрессии сиртуина 5 у самцов и понижением того же параметра у самок, не влияя на контрольные уровни триптофана и активности внемитохондриального ОАДК. Введение же ингибитора ОАДГ крысам, перенесшим пренатальную гипоксию, имело более выраженный эффект у самок, чем у самцов. Так, у самок этой группы глутарилфосфонат восстановил пониженный уровень активности внемитохондриального ОАДК и понизил экспрессию сиртуина 5. тогда как существенных изменений данных параметров у самцов не наблюдали. При этом глутарилфосфонат нормализовал уровень триптофана в мозге у всех животных, перенесших пренатальный стресс. Полученные в данной модели результаты показывают, что система глутарилирования мозга характеризуется гендерными различиями и вовлечена в метаболизм триптофана - предшественника нейромедиатора серотонина. В модели долгосрочных (спустя 8 недель) изменений коры головного мозга после спинномозговой травмы показаны изменения системы глутарилирования, связанные со степенью реабилитации животных (Boyko et al., 2019). При неизменной экспрессии ОАДГ в коре мозга травмированных крыс происходит увеличение внемитохондриальной активности ОАДК и повышение экспрессии сиртуина 5, для которых наблюдается положительная корреляция. Кроме того, уровень полноразмерной ОАДГ в коре мозга положительно коррелирует с восстановлением двигательных функций травмированных животных. Тиамин, введенный после травмы спинного мозга, повышает содержание сиртуина 5 и понижает до нормального уровня внемитохондриальную активность ОАДК. Введение ТМАР повышает белковую экспрессию ОАДГ и общее глутарилирование белков в коре головного мозга и у травмированных, и у ложнооперированных крыс. Однако у травмированных животных это сопровождается падением уровня сиртуина 5. Таким образом, представленные в двух патофизиологических моделях – спинномозговой травмы и пренатальной гипоксии – данные свидетельствуют о том, что ОАДК участвует в долгосрочных изменениях системы глутарилирования белков в коре головного мозга крыс.

 

Публикации

1. - Травмы мозга и механизмы нейропротекторного действия тиамина Научный гумбольдтовский журнал "Россия и Германия". ООО "Институт энергии знаний", № 1-2 (13-14), страницы 109-118 (год публикации - ).

2. - "Лекарства, которые спасли мир" Телевизионный канал "Тонус-ТВ", компания "Первый ТВЧ", Телевизионная программа вышла в эфир 24.11.2019 в 10:45 на канале "Тонус-ТВ" (год публикации - ).

3. Алешин В.А., Кэне Т., Мкртчян Г.В., Артюхов А.В., Граф А.В., Маслова М.В., Буник В.И. Regulation of glutamate dehydrogenase in the brain by acetylation and thiamine European Neuropsychopharmacology, 32nd ECNP Congress, Denmark, Volume 29, Supplement 6, December 2019, Pages S191-S192 (год публикации - 2020).

4. Бойко А.И. Травмы мозга и механизмы нейропротекторного действия тиамина Россия и Германия. Научный гумбольдтовский журнал, 1-2(13-14): 109-118 (год публикации - 2019).

5. Бойко А.И., Цепкова П.М,, Рябов С.И., Буник В.И. Thiamine induces sirtuin 5 in cerebral cortex of rats after spinal cord injury and improves rehabilitation FENS Regional Meeting, Serbian Neuroscience Society, Belgrade, - (год публикации - 2019).

6. Вагнер Т., Бойко А.И., Алзари П.М., Буник В.И., Беллинзони М. Conformational transitions in the active site of mycobacterial 2-oxoglutarate dehydrogenase upon binding phosphonate analogues of 2-oxoglutarate: From a Michaelis-like complex to ThDP adducts Journal of Structural Biology, Volume 208, Issue 2, Pages 182-190 (год публикации - 2019).

7. Меженская О.А., Алешин В.А., Т. Кэне Т., Артюхов А.В. , Буник В.И. Регуляция малатдегидрогеназ и глутаматдегидрогеназы мозга животных тиамином in vitro и in vivo Биохимия (Москва), Том 85, выпуск 1, страницы 34-48 (год публикации - 2020).

8. Чашникова А.А., Алешин В.А. Сравнительный анализ ацетилирования, сукцинилирования и глутарилирования глутаматдегидрогеназы животных в печени и мозге Материалы Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2019», - (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 г была исследована компартментализация изоформ продуцента глутарил-КоА 2-оксоадипатдегидрогеназы (ОАДГ) в клетках мозга животных и ее роль во взаимодействии компонентов клеточного ацилирования. Сопоставление измеренных уровней активности ОАДГ комплекса и экспрессии комплексообразующей изоформы фермента в субклеточных фракциях гомогената мозга показало отсутствие такой активности и изоформы в цитозольной фракции и их наличие в митохондриях и ядре. Таким образом, измеряемая нами внемитохондриальная активность ОАДГ комплекса локализована в обогащенной клеточными ядрами фракции. Сравнительный анализ изменений системы глутарилирования при регуляции ингибиторами дегидрогеназ 2-оксокислот: триэтиловым эфиром глутарилфосфоната (ТЭГФ) и триметиловым эфиром адипоилфосфоната (ТМАФ) - в физиологическом состоянии и в моделях нейропатологий обнаружил взаимозависимые изменения экспрессии высокомолекулярной формы ОАДГ и активности ее изофермента - 2-оксоглутаратдегидрогеназы (ОГДГ), которые согласуются с конкуренцией изоферментов за общий транссукцинилазный компонент комплекса (https://www.nature.com/articles/s41598-020-58701-4). При отложенной регистрации эффектов краткосрочного ингибирования действие специфического ингибитора ОАДГ (ТМАФ) сравнивали с изменениями, вызываемыми долгосрочной гиперактивацией ОГДГ в ответ на ингибирование ТЭГФ. По большинству параметров, характеризующих систему глутарилирования, различия между состояниями животных после введения ТЭГФ и ТМАФ были более достоверны, чем таковые для каждого из состояний по сравнению с контролем. У контрольных животных показан одновременный рост ассоциированной с ядерной фракцией активности ОАДГ комплекса и уровня сиртуина 5 без роста общего глутарилирования белков мозга. Однако в мозге животных со спинномозговой травмой можно видеть сопряженный рост экспрессии ОАДГ и уровня глутарилирования без значимых изменений сиртуина 5. Поскольку после спинномозговой травмы не наблюдается и компенсаторное повышение активности ОГДГ в ответ на действие ТЭГФ, можно заключить, что именно ослабление компенсаторного ответа мозга травмированных животных по сравнению с контрольными позволяет увидеть рост глутарилирования, который в нормальных условиях компенсируется ростом экспрессии сиртуина 5. Для решения задач проекта в 2020 г. были разработаны подходы к определению дополнительных маркеров системы клеточного ацилирования: иммуноферментная детекция белкового ацетилирования в реакции с ацетил-КоА и количественное определение 2-оксокислот в качестве маркеров функции продуцентов ацил-КоА. С помощью последнего подхода получены данные, подтверждающие физиологическое значение неокислительной карболигазной активности низкомолекулярной формы ОАДГ, участвующей в детоксикации глиоксилата. Так, после введения ингибитора ОАДГ уровень глиоксилата в мозге животных повышался. В модели спинномозговой травмы показано, что обеспечивающее улучшение реабилитации введение тиамина приводит к росту ацетилирования остатка глутаматдегидрогеназы (ГДГ) К503, но не К415. В отношении р53 такое действие тиамина приводит к одновременному снижению уровней как общего р53, так и его ацетилированной формы, без изменения уровня ацетилирования р53 (Boyko et al., 2021, на стадии ревизии, Frontiers in Molecular Neuroscience). Рост уровня ацетилирования p53 мозга обнаружен при долгосрочном компенсаторном росте активности ОГДГ комплекса мозга в ответ на краткосрочное ингибирование вследствие однократного введения ТЭГФ в отсутствии нейропатологий. При этом активность ОГДГ комплекса мозга, но не внемитохондриального ОАДГ комплекса, показывала высокую положительную корреляцию с уровнем ацетилирования р53. В отличие от нетравмированных животных, у крыс с тяжелой спинномозговой травмой оба индуцируемых ТЭГФ эффекта, т.е. рост активности ОГДГ комплекса и рост ацетилирования р53, отсутствовали. В то же время в мозге травмированных животных можно было наблюдать умеренные положительные корреляции между активностью ОГДГ комплекса и общей экспрессией p53. При этом наблюдали и достоверную корреляцию активности внемитохондриального ОАДГ комплекса с ацетилированной формой р53, отсутствующую для общей экспрессии р53. Таким образом, мы показали, что корреляция между функцией ОГДГ комплекса и уровнем ацетилирования р53 или уровнем его общей экспрессии определяется метаболическим состоянием мозга. В условиях нормальной физиологии ответ на пертурбацию функции ОГДГ комплекса коррелирует с уровнем ацетилирования р53, тогда как в патологическом состоянии такой ответ отсутствует, а функция ОГДГ комплекса коррелирует с общей экспрессией р53. Изучение взаимодействия между функцией ОГДГ комплекса и экспрессией р53 в других патологических условиях (линии клеток легочной аденокарциномы) показало усиление экспрессии р53 и функционального ОГДГ комплекса в условиях тиаминового дефицита клеток. Насыщение дефицитных по тиамину раковых клеток, гиперэкспрессирующих ОГДГ комплекс, ТДФ (тиаминдифосфатом, кокарбоксилазой) снижало клеточную жизнеспособность. Зависимость данных эффектов от транскрипционной активности р53 была подтверждена их усилением при искусственном снижении экспрессии мишени р53 – белка р21 – и их отсутствии в условиях нормальной клеточной физиологии (https://www.mdpi.com/1422-0067/21/11/3759). Показано, что индуцированный цисплатином рост экспрессии р53 связан со значительным изменением активностей ацилируемых белков клетки, в наибольшей степени затрагивая специфический для приматов изофермент ГДГ, ОГДГ комплекс и изоцитратдегидрогеназу 3. Сходный, хоть и менее выраженный эффект на исследованные ферменты оказывает ингибитор ОГДГ сукцинилфосфонат (https://link.springer.com/article/10.1134%2FS0006297920070081) Изменение экспрессии р53 при дефиците необходимого для продуцентов ацил-КоА тиамина могут вызывать изменения ацетилирования р53, показанные нами на предыдущем этапе выполнения проекта. В связи с этим в 2020 г. проведена разработка новой животной модели гиповитаминоза тиамина, потенциально вызываемого применением широко используемых фармакологических средств: метформина (для лечения диабета) и ампролиума (антипаразитарный препарат в ветеринарии). Полученные в этой модели предварительные результаты по изменению ряда физиологических и биохимических (в частности, 20% рост степени активации ОГДГ мозга коферментом ТДФ, р=0.18) показателей можно расценивать как свидетельства в пользу раннего этапа развития недостатка тиамина, усиления которого можно ожидать при увеличении времени эксперимента. Дальнейшее развитие этой важной для медицины модели при возможности более долгосрочных, чем в 2020 г., животных экспериментов может быть продуктивным для дальнейших исследований связи между ацетилированием р53 и тиамином, опосредованной клеточными системами, продуцирующими ацил-КоА. Суточные и тиамин-зависимые изменения ацилирования белков исследовали в связи с клеточной компартментализацией. Показано, что белки митохондриального матрикса глутаматдегидрогеназа и изоцитратдегидрогеназа 3 ацетилируются синхронно, тогда как цитоплазматическая лактатдегидрогеназа А показывает другой паттерн ацетилирования. Роль клеточной компартментализации в ацетилировании белков подтверждает отсутствие существенных изменений в уровне ацетилирования, как в течение суток, так и под действием тиамина, цитоплазматического белка 14-3-3z и анионного канала внешней мембраны митохондрий VDAC1. В отличие от ацетилирования, глутарилирование митохондриальной изоцитратдегидрогеназы 2 и цитоплазматической глутаминсинтетазы изменяется в течение суток сходным образом, тогда как изменения глутарилирования других цитоплазматических (лактатдегидрогеназа В) или митохондриальных (изоцитратдегидрогеназа 3) ферментов в течение суток не наблюдается. Третий тип ацилирования – сукцинилирование – был проанализирован для митохондриальной изоцитратдегидрогеназы 3, продуцирующей субстрат ОГДГ комплекса в цикле трикарбоновых кислот. Суточные или под действием тиамина изменения не достигли статистической значимости. Не изменялось и сукцинилирование белковой полосы с соответствующим изоцитратдегидрогеназе молекулярным весом при ингибировании ОГДГ комплекса. С учетом малой выраженности сукцинилирования белков в мозге по сравнению с печенью можно предположить, что данный тип ацилирования ассоциирован лишь со специфическим типом клеток ЦНС, что осложняет количественную характеристику реактивности сукцинилирования к эндогенным или экзогенным факторам. В целом, эти результаты показали, что синхронизация регуляторных процессов ацилирования определяется не столько клеточным компартментом, сколько участием белков в специфических узлах метаболизма или в определенных типах метаболических путей. Возможно, что глутарилирование в большей степени регулирует биосинтетические процессы, тогда как ацетилирование - катаболические. В 2020 г. полученный при выполнении проекта массив данных был проанализирован методами корреляционного (https://www.mdpi.com/2073-4409/9/1/139) и дискриминантного анализа на основе частичных наименьших квадратов (PLS-DA) для определения взаимосвязей между компонентами системы клеточного ацилирования белков мозга и физиологическими функциями. Установлены связи ацетилирования белков мозга с компонентами системы ацетилирования и их зависимость от времени суток. Утром ацетилирование белков мозга в большей степени связано с функцией полиферментного комплекса пируватдегидрогеназы, тогда как вечером – с экспрессией деацетилазы сиртуина 3. Корреляции уровня НАД с активностями НАД(Ф)-зависимых ферментов метаболизма, которые продуцируют ацил-КоА или подвергаются модификации этими соединениями, меняются в зависимости как от времени суток, так и от действия тиамина. При этом параметры ЭКГ коррелируют не с общими параметрами ацетилирования в мозге, а с функцией ферментов мозга, среди которых – продуцент сукцинил-КоА (ОГДГ комплекс) и ферменты, для которых определены суточные изменения глутарилирования (изоцитратдегидрогеназа 2 и глутаминсинтетаза). Определены статистические достоверные корреляции активности внемитохондриального ОАДГ комплекса с компонентами системы глутарилирования мозга, их суточные изменения и регуляция высокими дозами тиамина. Так, утром активность внемитохондриального ОАДГ комплекса обнаруживает высокие отрицательные корреляции с уровнем НАД и экспрессией сиртуина 5. Утреннее введение высокой дозы тиамина устраняет эти корреляции. Вечером, напротив, активность внемитохондриального ОАДГ комплекса не коррелирует с уровнями НАД и сиртуина 5, и только после введения высокой дозы тиамина активность снова обнаруживает высокую отрицательную корреляцию с уровнем НАД. Сходство обнаруженных закономерностей действия тиамина на ОАДГ и глутаматдегидрогеназу (Https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1111/jnc.14951) показывает тесную связь систем глутарилирования и ацетилирования метаболических белков. Установленная в данном проекте роль ОАДГ комплекса в биосинтезе НАД (https://www.nature.com/articles/s41598-020-58701-4), используемого сиртуинами для различных реакций деацилирования (в частности, деацетилирования и деглутарилирования) может вносить значительный вклад во взаимозависимость клеточного ацилирования разных типов. Изменение сукцинилирования белков мозга при ингибировании ОГДГ комплекса сопровождается изменением как физиологических, так и биохимических параметров мозга. Анализ методом PLS-DA показал, что в первую очередь данные ингибиторы действуют на кластер метаболитов, связанных с редокс-состоянием мозга, и это сопровождается увеличением тревожности, определяемой по увеличению количества актов груминга, их длительности и учащению дефекаций. Таким образом, полученные при исследовании систем ацилирования белков мозга результаты показывают, что фармакологическая регуляция продуцентов ацил-КоА в мозге может быть использована для регуляции не только процессов выработки энергии, но и поведения.

 

Публикации

1. - Российские ученые разработали тест на биологический возраст РИА Новости, Artiukhov AV, Pometun AA, Zubanova SA, Tishkov VI, Bunik VI. Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD+ quantification in biological samples. Anal Biochem. 2020 Aug 15;603:113797. doi: 10.1016/j.ab.2020.113797. (год публикации - ).

2. - Биологи научились точно измерять один из клеточных маркеров старения ТАСС, Artiukhov AV, Pometun AA, Zubanova SA, Tishkov VI, Bunik VI. Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD+ quantification in biological samples. Anal Biochem. 2020 Aug 15;603:113797. doi: 10.1016/j.ab.2020.113797. (год публикации - ).

3. - Предложен новый способ анализа вещества-индикатора старения и нарушений метаболизма Газета.Ru, Artiukhov AV, Pometun AA, Zubanova SA, Tishkov VI, Bunik VI. Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD+ quantification in biological samples. Anal Biochem. 2020 Aug 15;603:113797. doi: 10.1016/j.ab.2020.113797. (год публикации - ).

4. - Предложен новый способ анализа вещества — индикатора старения и нарушений метаболизма Indicator.Ru, Artiukhov AV, Pometun AA, Zubanova SA, Tishkov VI, Bunik VI. Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD+ quantification in biological samples. Anal Biochem. 2020 Aug 15;603:113797. doi: 10.1016/j.ab.2020.113797. (год публикации - ).

5. - В МГУ придумали простой способ определения биологического возраста человека Поиск, Artiukhov AV, Pometun AA, Zubanova SA, Tishkov VI, Bunik VI. Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD+ quantification in biological samples. Anal Biochem. 2020 Aug 15;603:113797. doi: 10.1016/j.ab.2020.113797. (год публикации - ).

6. - В МГУ предложили недорогой способ выяснения биологического возраста ИА Красная весна, Artiukhov AV, Pometun AA, Zubanova SA, Tishkov VI, Bunik VI. Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD+ quantification in biological samples. Anal Biochem. 2020 Aug 15;603:113797. doi: 10.1016/j.ab.2020.113797. (год публикации - ).

7. - Нехватка кислорода нарушила круговорот аминокислот в мозге беременных ТАСС, Graf A, Trofimova L, Ksenofontov A, Baratova L, Bunik V. Hypoxic Adaptation of Mitochondrial Metabolism in Rat Cerebellum Decreases in Pregnancy. Cells. 2020 Jan 7;9(1):139. doi: 10.3390/cells9010139. (год публикации - ).

8. - Российские ученые объяснили, почему мозг беременных плохо адаптируется РИА Новости, Graf A, Trofimova L, Ksenofontov A, Baratova L, Bunik V. Hypoxic Adaptation of Mitochondrial Metabolism in Rat Cerebellum Decreases in Pregnancy. Cells. 2020 Jan 7;9(1):139. doi: 10.3390/cells9010139. (год публикации - ).

9. - Ученые выяснили, что происходит в мозге беременных при нехватке кислорода Газета.Ру, Graf A, Trofimova L, Ksenofontov A, Baratova L, Bunik V. Hypoxic Adaptation of Mitochondrial Metabolism in Rat Cerebellum Decreases in Pregnancy. Cells. 2020 Jan 7;9(1):139. doi: 10.3390/cells9010139. (год публикации - ).

10. - Ученые выяснили, что происходит в мозге беременных при нехватке кислорода Индикатор.Ру, Graf A, Trofimova L, Ksenofontov A, Baratova L, Bunik V. Hypoxic Adaptation of Mitochondrial Metabolism in Rat Cerebellum Decreases in Pregnancy. Cells. 2020 Jan 7;9(1):139. doi: 10.3390/cells9010139. (год публикации - ).

11. - Витамин B1 поможет при лечении расстройств сна и бодрствования Индикатор.Ру, Aleshin VA, Mkrtchyan GV, Kaehne T, Graf AV, Maslova MV, Bunik VI. J Neurochem. 2020 Apr;153(1):80-102. doi: 10.1111/jnc.14951. (год публикации - ).

12. - «В качестве дополнительной терапии»: российские учёные обнаружили антираковые свойства витамина B1 RT на русском, Bunik VI, Aleshin VA, Zhou X, Tabakov VY, Karlsson A. Int J Mol Sci. 2020 May 26;21(11):3759. doi: 10.3390/ijms21113759. (год публикации - ).

13. - Лекарственная форма витамина B1 подавила рак легкого Поиск, Bunik VI, Aleshin VA, Zhou X, Tabakov VY, Karlsson A. Int J Mol Sci. 2020 May 26;21(11):3759. doi: 10.3390/ijms21113759. (год публикации - ).

14. - Ученые МГУ выяснили, что кокарбоксилаза может подавить опухоль легких Научная Россия, Bunik VI, Aleshin VA, Zhou X, Tabakov VY, Karlsson A. Int J Mol Sci. 2020 May 26;21(11):3759. doi: 10.3390/ijms21113759. (год публикации - ).

15. - Витамин B1 помог справиться с раком легкого Индикатор.Ру, Bunik VI, Aleshin VA, Zhou X, Tabakov VY, Karlsson A. Int J Mol Sci. 2020 May 26;21(11):3759. doi: 10.3390/ijms21113759. (год публикации - ).

16. - Лекарственная форма витамина B1 подавила рак легкого Русская планета, Bunik VI, Aleshin VA, Zhou X, Tabakov VY, Karlsson A. Int J Mol Sci. 2020 May 26;21(11):3759. doi: 10.3390/ijms21113759. (год публикации - ).

17. - Ученые назвали витамин, способствующий подавлению клеток рака легких РИА Новости, Bunik VI, Aleshin VA, Zhou X, Tabakov VY, Karlsson A. Int J Mol Sci. 2020 May 26;21(11):3759. doi: 10.3390/ijms21113759. (год публикации - ).

18. Алешин В.А., Мкртчян Г.В., Кэне Т., Граф А.В., Маслова М.В., Буник В.И. Diurnal regulation of the function of the rat brain glutamate dehydrogenase by acetylation and its dependence on thiamine administration Journal of Neurochemistry, V.153, I. 1., P. 80-102 (год публикации - 2020).

19. Артюхов А., Граф А., Казанцев А., Лукашев Н., Буник В. Chemical models of dysfunctions of the brain 2-oxo acid dehydrogenases in vivo European Neuropsychopharmacology, V. 40, S. 1, P. S84-S85 (год публикации - 2020).

20. Артюхов А.В., Бойко А.И., Алешин В.А., Граф А.В. Роль 2-оксоглутаратдегидрогеназы в редокс-статусе мозга крыс в норме и патологии Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2020», - (год публикации - 2020).

21. Артюхов А.В., Пометун А.А., Зубанова С.А., Тишков В.И., Буник В.И. Advantages of formate dehydrogenase reaction for efficient NAD(+) quantification in biological samples Analytical Biochemistry, V. 603 (год публикации - 2020).

22. Артюхов А.В.; Грабарска А., Гумбаревич Е.,Алешин В.А.; Кане T;Обата T; Казанцев А.В.; Лукашев Н.В.; Степулак А; Ферне А.Р., Буник В.И. Synthetic analogues of 2-oxo acids discriminate metabolic contribution of the 2-oxoglutarate and 2-oxoadipate dehydrogenases in mammalian cells and tissues SCIENTIFIC REPORTS, - (год публикации - 2020).

23. Бойко А., Цепкова П., Алешин В., Артюхов А., Мкртчян Г., Ксенофонтов А., Баратова Л., Рябов С,, Граф А., Буник В. Severe spinal cord injury induces chronic metabolic changes in spinal cord and cerebral cortex of rats, counteracted by thiamine which improves rehabilitation Frontiers in Molecular Neuroscience, - (год публикации - 2021).

24. Буник В.И., Алешин В.А., Жоу Ш., Кришнан Ш., Карлссон А. Regulation of Thiamine (Vitamin B1)-Dependent Metabolism in Mammals by p53 BIOCHEMISTRY-MOSCOW, V. 8, N 7, P. 801-807 (год публикации - 2020).

25. Буник В.И., Алешин В.А., Жоу Ш., Табаков В.Ю., Карлссон А. Activation of Mitochondrial 2-Oxoglutarate Dehydrogenase by Cocarboxylase in Human Lung Adenocarcinoma Cells A549 Is p53/p21-Dependent and Impairs Cellular Redox State, Mimicking the Cisplatin Action Molecular Diversity Preservation International, V. 21, N 11., P. 1-23 (год публикации - 2020).

26. Буник В.И., Вагнер Т., Беллинцони М 2-Oxoglutarate Dehydrogenase Complex Encyclopedia of Biochemistry 3rd Edition, - (год публикации - 2021).

27. Граф А, Трофимова Л, Ксенофонтов А, Баратова Л, Буник В. Hypoxic Adaptation of Mitochondrial Metabolism in Rat Cerebellum Decreases in Pregnancy Cells, V. 9, N1 (год публикации - 2020).

28. Завилейский Л.Г. Анализ изоформ и посттрансляционных модификаций р53 Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2020», - (год публикации - 2020).