Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Общей целью проекта является выяснение ранних пусковых механизмов остеогенной дифференцировки в клетках мезенхимного происхождения в норме и при патологической кальцификации тканей сердечно-сосудистой системы. В качестве экспериментальных моделей мы использовали мезенхимные стволовые клетки жировой ткани человека, интерстициальные клетки аортального клапана человека, эндотелиальные клетки пуповинной вены человека и эндотелиальные клетки аортального клапана человека. Показано, что сокультивирование интерстициальных клеток аортального клапана с эндотелиальными усиливает степень остеогенной дифференцировки по мере увеличения дозы эндотелия. Активация сигнального пути Notch приводит к усилению остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток. Сокультивирование приводит к активации Notch, а также к индукции генов остеодифференцировки. Полученные результаты подтверждают участие интерстициальных и эндотелиальных клеток в кальцификации клапана аорты, а также позволяют сделать вывод о том, что уровень активации Notch играет важную роль в кальцификации клеток аортального клапана. Показано, что активация Notch способствует остеогенной дифференцировке тканеспецифичным дозозависимым образом; активация Notch усиливает остеогенный потенциал, но только при умеренных дозах; высокая доза активации Notch подавляет остеогенную дифференцировку. Этот результат впервые получен и может быть особенно важным при рассмотрении возможностей использования активации Notch для стимулирования остеогенеза в клинических применениях для восстановления костей. Проведено полногеномное секвенирование когорты пациентов с кальцификацией аортального клапана. Выявлены новые экзомные варианты в Notch-ассоциированных генах, ведущие к замене аминокислоты, ранее не встречающиеся в популяционных данных и публикациях. Показано, что периферические МСК жирового происхождения не являются источником кальцификации аортального клапана. Показано, что эндотелиальные клетки реагируют на механическое напряжение за счет усиления регуляции про-остеогенного фактора BMP2 и модулируют экспрессию других остеогенных факторов в интерстициальных клетках сосудов. Таким образом, эндотелиальные клетки могут способствовать кальцификации сосудов при чрезмерном механическом воздействии. Показано, что воспаление и механический стресс запускают экспрессию остеогенных генов в ИК специфическим образом для аортальной и вентрикулярной сторон створки клапана, при этом происходит подавление миофибробластного пути дифференцировки и стимуляция остеогенного пути. Механическое воздействие и воспаление синергически усиливают кальцификацию. Результаты данного этапа демонстрируют значительное участие межклеточных взаимодействий между интерстициальными и эндотелиальными клетками клапана аорты в патологических процессах кальцификации тканей клапана. Опосредует и регулирует эти коммуникации в большой степени сигнальный путь Notch, обладающий широким спектром влияния на определение клеточной судьбы и спецификацию клеток в тканях организма

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Общей целью проекта является выяснение ранних пусковых механизмов остеогенной дифференцировки в клетках мезенхимного происхождения в норме и при патологической кальцификации тканей сердечно-сосудистой системы. В качестве экспериментальных моделей использованы мезенхимные стволовые клетки жировой ткани человека, интерстициальные и эндотелиальные клетки аортального клапана человека, эндотелиальные клетки пуповинной вены человека. Показана ведущая роль взаимодействия эндотелиальных клеток с интерстициальными (мезенхимными) клетками в индукции патологической остеогенной дифференцировки. Получены данные о том, что подавление активности сигнального пути Notch приводит к подавлению остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана. Показано, что интерстициальные клетки клапанов от пациентов с кальцификацией имеют сниженный стволовой потенциал по сравнению с клетками, полученными из клапанов здоровых людей. На нескольких типах стволовых клеток мезенхимного происхождения показано, что дозированнная активация сигнального пути Notch приводит к дозо-зависимому усилению остеогенной дифференцировки. При этом промоторы ключевых проостеогенов RUNX2 и OPN находятся под контролем сигнального пути Notch. Тонкая настройка Notch и проостеоенных стимулов требует дальнейшего изучения. Оценка экспрессии генов пуринэргического сигналинга в эндотелиальных и интерстициальных клетках клапанов от пациентов с кальцификацией и от здоровых людей, показала, что пуринэргический сигналинг нарушен/изменен в клетках пациентов по сравнению с клетками здоровых людей. Изучение транскриптомного и протеомного профилей дифференцированных и недифференцированных интерстициальных клеток аортального клапана от пациентов с кальцификацией и от здоровых людей привело к идентификации групп генов и отдельных генов и белков, дифференциально экспрессирующихся у больных и здоровых людей, а также при индукции остеогенной дифференцировки. Роль отдельных генов и белков будет изучена на следующих этапах работы.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основным полученным результатом проекта на данном этапе является доказательство ведущей роли взаимодействия эндотелиальных клеток с интерстициальными клетками в индукции патологической остеогенной дифференцировки. Получены данные о том, что подавление активности сигнального пути Notch приводит к подавлению остеогенной дифференцировки интерстициальных клеток аортального клапана. Полученные данные в целом указывают на то, что при со-культивировании эндотелиальных и интерстициальных клеток аортального клапана активирован сигнальный путь Notch, причем преимущественно на эндотелиальных клетках. Сокультивирование эндотелиальных и интерстициальных клеток от пациентов и здоровых людей приводит к активации проостеогенных путей и сигнального пути Notch в ко-культурах с эндотелиальными клетками от пациентов. Паттерн экспрессии генов нескольких сигнальных путей, включая Notch, изменен в эндотелиальных клетках пациентов с кальцификацией аортального клапана по сравнению с клетками из нормальных клапанов. Оценка экспрессии генов пуринэргического сигналинга в эндотелиальных и интерстициальных клетках клапанов от пациентов с кальцификацией и от здоровых людей, показала, что регуляция пуринэргического сигналинга нарушена в клетках пациентов по сравнению с клетками здоровых людей. Изучение транскриптомного и протеомного профилей дифференцированных и недифференцированных интерстициальных клеток аортального клапана от пациентов с кальцификацией и от здоровых людей привело к идентификации групп генов и отдельных генов и белков, дифференциально экспрессирующихся у больных и здоровых людей, а также при индукции остеогенной дифференцировки. Произведена проверка данных, полученных методом машинного обучения о соединениях-кандидатах для коррекции нежелательной остеогенной дифференцировки клеток клапана аорты человека, которая имеет место при кальцификации аортального клапана. При помощи анализа транскриптомов эндотелиальных клеток пациентов с кальцификацией аортального клапана проведена оценка того, насколько соединения-кандидаты могут восстановить нормальной паттерн активности генома в этих клетках. При этом показано, что воздействие соединения XCT790, на клетки, полученные от пациентов, возвращало их генную сеть к нормальному состоянию, что позволяет рассматривать XCT790 как потенциальный кандидат терапевтичского воздействия при кальцификации аортального клапана.