Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Первая серия экспериментов была направлена на изучение кинетики чувствительности BMDMs к индуцированному LPS некроптозу с использованием BMDMs от C57BL/6, а также мышей, дефицитных по IFNb1 и рецептору к IFN. Блокирование IFNAR за 1 час до заражения не влияло на кинетику клеточной смерти, несмотря на эффективную блокировку фосфорилирования STAT1 в ответ на экзогенный IFNb. Однако 20-часовая блокада IFNAR уменьшала клеточную смерть. Мышиные макрофаги, не имеющие рецептора интерферона I типа (Ifnar -/-), также демонстрировали неполноценную клеточную смерть, характеризующуюся замедленным началом и постепенным прогрессированием во времени. Длительное ингибирование передачи сигнала IFNAR не оказывало влияния на гибель клеток в каспаза-11-негативных макрофагах. В аналогичном эксперименте с использованием человеческих макрофагов показано, что для инициирования конститутивной антимикробной реакции требовался JAK/STAT-сигнал, а блокирование сигналинга IFN с использованием антител к рецептору IFN значительно замедляло кинетику цитотоксичности. Выяснена роль эндосомного TLR4-адаптера TRIF в LPS-индуцированном некроптозе путем сравнения между TRIF-дефицитными макрофагами и макрофагами дикого типа. Установлено, что цитотоксичность клеток от TRIF-KO независима от конститутивного IFN, и TRIF не участвует в продукции данного цитокина. Двухцепочечная РНК и LPS вызывают активацию TLR3 и TLR4, соответственно, для того чтобы запустить TRIF/IRF3 путь и быструю транскрипцию Ifn-генов. Интенсивность активации IRF3 наблюдается в течение 1-2 часов в прямом направлении от стимуляции TLR3 и TLR4 в мышиных макрофагах, что свидетельствует о высокой скорости синтеза IFN. В мышиных и человеческих макрофагах STING-стимуляция или RIG-I-обусловленная транскрипция генов Ifn требуют 3-4 ч, достигая максимума через 5-6 ч. Таким образом, успешный IFN-ответ, вызванный инфекцией, требует времени для установления. В свою очередь, IFN-зависимый антимикробный ответ, который легко может наблюдаться в первые 4 ч после контакта с патогеном, вряд ли будет управляться de novo синтезированным IFN, основываясь на времени стимуляции ISGs, которая в свою очередь гораздо более продолжительнее, чем наблюдаемый ответ смерти клеток. Управляемые инфекцией ответы интерферона отсутствуют во время пироптоза. IFNAR-негативные макрофаги демонстрируют существенную задержку пироптоза, что обусловлено необходимостью сигнала конститутивного интерферона для экспрессии chr3-кодируемых гуанилат-связывающих белков (GBРs) и далее разрушения внутриклеточных бактерий, например, Legionella pneumophila. Показано, что GBPs не участвуют в разрыве вакуоли патогена, и что цитозоль-экспозированная L. pneumophila запускает пироптоз макрофагов в отсутствии микроб-индуцированной передачи IFN-сигнала. Передача IFN-сигнала поддерживала экспрессию GBPs на стабильно низком, но достаточном для функционирования каспазы-11 и каспазы-1 уровне. Потеря целостности вакуоли не изменялась в Ifnar -/-, Gbpchr3-/-, Casp11 -/- макрофагах. Тем не менее, в пробах с L. pneumophila ΔsdhA-мутанты и Gbpchr3 -/- макрофаги демонстрировали задержку и снижение клеточной смерти. Результаты РНК-секвенирования из легких неинфицированных мышей C57BL/6 и Ifnar -/- животных (GEO: GSE110678) показали, что у C57BL/6, в отличие от Ifnar -/-, GBPs более высоко экспрессированы, экспрессия Gbp1 и Gbp11 однотипна. Gbp2, Gbp3 и Gbp7 имели небольшие различия, но далее с помощью RT-PCR было обнаружено, что они значительно уменьшены в легких Ifnar -/- и Ifnb -/- мышей. Также отмечена сниженная экспрессия Irf7, Isg15 и Mx1 у Ifnar -/- животных. Вторая серия экспериментов предполагала изучение возможной зависимости некроптоза от cGAS/STING и участия конститутивного IFN в фосфорилировании MLKL, RIP1 и RIP3 киназ. С использованием STING-KO мышей и мышей с гипоморфной аллелью Sting нами показано, что жизнеспособность клеток коррелирует с наличием функционального STING, а продукция конститутивного IFN зависит от cGAS/STING-пути. Мы наблюдали значительное сокращение профиля ISGs в клетках, дефицитных по STING или cGAS. При TLR3/4-индуцированном некроптозе, включение TRIF вызывало производство IFN при активации RIP1/3 в макрофагах, полученных из мышиного костного мозга. Тогда как для выработки конститутивного IFN TRIF необязателен. После обработки B6 и Ticam-/- BMDMs высокой дозой экзогенного IFN (200 U/ml) совместно со стимулированием LZ обнаружено, что это не увеличило клеточную смерть у B6 BMDMs, и не сенсибилизировало Ticam1-/- BMDMs к некроптозу. TRIF-дефицитные клетки были полностью чувствительны к TLR-независимому некроптозу. Ticam1-/- BMDMs показали нормальные уровни ISGs в состоянии покоя. Таким образом, TRIF способствует некроптозу, способом, независимым от IFN-индуцирующей деятельности во время стимулирования LPS/zVAD, а выработка конститутивного IFN у макрофагов не зависит от передачи сигнала TRIF. Некроптоз зависит от заранее установленного статуса IFN, а не от IFN, производимого в ответ на триггер, вызывающий смерть клеток. Кроме того, MLKL требует конститутивного IFN для поддержания своего активного статуса. В результате внутриклеточная передача сигнала IFN контролирует скорость некроптоза, регулируя экспрессию MLKL, а низкие уровни активации cGAS/STING при повреждении ДНК увеличивают передачу сигнала интерферона и повышают клеточный ответ на вирусные и бактериальные инфекции. Третья серия экспериментов включала анализ полногеномной экспрессии генов у эмбрионов DNase2-/-StingMOLF/- методом секвенирования следующего поколения (NGS). Показано, что эмбриональная летальность опосредуется активацией STING. В результате определены пути с повышенной активностью у мертвых эмбрионов и различия в путях клеточной смерти. Первостепенная роль в этом процессе отводится ISGs. Изучен уровень STING-опосредованной активации от количества STING (эффект дозы), что характеризует STING как гаплонедостаточный. Для этого скрещивали животных DNase-/- Sting-/- и DNase+/- StingM/M и установили, что DNase-/- StingM/- животные оказались жизнеспособными по сравнению с эмбриональной летальностью, наблюдаемой у DNase-/- Sting+/- животных. DNase-/- StingM/-мыши были меньшего размера, особенно в раннем возрасте, и имели высокие уровни IFN в сыворотке. Их макрофаги были чувствительны к некроптозу, однако жизнеспособность эритроцитов у этих мышей была выше по сравнению с DNase-/- Sting+/- животными, показатель коррелировал с IFN-сигналингом. MOLF BMDMs были дефицитными по экспрессии некоторых ISGs в состоянии покоя, в частности Isg15, Inf7, в меньшей степени Mx1. Тем не менее, MOLF макрофаги легко проходили фосфорилирование STAT1 и восстанавливали уровни белка STAT1 в ответ на экзогенный IFNb1. MOLF BMDMs демонстрировали низкую кинетику некроптоза, похожую на таковую у Sting-/- и cGAS-/- BMDMs и, подобным же образом, блокада IFNAR во время стимулирования LZ предотвращала позднюю сенсибилизацию к некроптозу у макрофагов MOLF. Изучен вклад гипоморфной аллели MOLF в Sting-дефектной передаче сигнала контитутивного IFN и некроптотическом потенциале путем сравнения BMDMs от мышей, конгенных по аллели MOLF\Sting, и C57BL/6. Результаты показали низкий уровень конститутивного IFN в B6-StingМ/М BMDMs, что подтверждается MX1 мРНК и уровнем белка STAT1. MOLF Sting способствует низкой передаче сигнала контитутивного IFN, что приводит к устойчивости к некроптозу MOLF BMDMs. Для установления возможных генов-кандидатов некроптоза, сравнили профиль генной экспрессии B6 BMDMs с BMDMs из Ifnar-/-, Sting-/- , MOLF и B6-StingМ/М и идентифицировали более 50 генов, экспрессия которых обычно снижена в BMDMs Ifnar-/-, Sting-/- и Sting B6-М/М по сравнению с B6 BMDMs. Некоторые из этих генов могут играть роль активаторов некроптоза, требующих конститутивный IFN для экспрессии. MLKL является важным медиатором некроптоза, для этого важна не только экспрессия MLKL, но и олигомеризация белка. Интересно, что сверхэкспрессия MLKL не была достаточной для реализации некроптоза у Ifnar-/- макрофагов, поэтому нужен хотя бы один дополнительный ISG для RIPK-зависимого фосфорилирования MLKL и осуществления процесса. На роль такого кандидата может претендовать RIP3 киназа. В пользу данного утверждения свидетельствует то, что у мышей с дефицитом MLKL (MLKL-KO) была снижена DNase2-/- летальность. Все запланированные исследования данного этапа выполнены в полном объеме. http://рнф.рф/ru/node/3263 http://рнф.рф/ru/node/3351?sphrase_id=8388 https://ria.ru/science/20180918/1528788366.html https://ria.ru/science/20180801/1525722933.html http://rk.karelia.ru/social/science/karelskij-uchenyj-pomog-vyyasnit-kak-legkie-boryutsya-s-pnevmoniej/ http://science.25mk.ru/2018/09/20/biologi-raskryli-odin-iz-putej-zashhity-kletok-ot-bakterij-vyzyvayushhih-pnevmoniyu/ https://scientificrussia.ru/articles/rossijskie-biologi-i-ih-kollegi-iz-za-rubezha-vyyavili-pervuyu-liniyu-oborony-ot-infektsij http://www.sib-science.info/ru/institutes/interferony-zapuskayut-rannee-samoubiystvo-01082018 https://ria.ru/science/20181129/1533766960.html https://www.gazeta.ru/science/news/2018/11/29/n_12349087.shtml?updated https://minobrnauki.gov.ru/ru/press-center/card/?id_4=690 http://rscf.ru/ru/node/uchenye-ustanovili-pochemu-ot-chumy-v-srednie-veka-umirali-prezhde-vsego-lyudi-a-ne-gryzuny

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Первая серия экспериментов была направлена на изучение роли cGAS, IFI16, DDX41, AIM2 в ответах на ДНК у мышей линии MOLF, а также специфических взаимодействий между STING, с указанными (и другими) компонентами сигнального пути. Проведенные эксперименты показали, что ответы на ДНК у мышей линии MOLF в основном зависели от cGAS, однако, и другие сенсоры, такие как IFI16 или AIM2, имели значение для реализации эффекта. cGAS является нуклеотидилтрансферазой, которая связана с производством вторичного мессенджера cGAMP, активирующего адаптерный белок STING. В результате запускается путь TBK1/IRF3 и индуцируются гены Ifn. Таким образом, во время инфекции передача ДНК от патогена в цитозоль клетки-хозяина вызывает активацию cGAS и STING, что приводит к индукции IFN и экспрессии нескольких интерферон-активируемых генов (ISGs), в том числе IFN I типа, Ccl5, Cxcl10, Mx1, Ifit 1, Ifit2, Ifit3. У мышей линии C57BL/6 все именно так и происходит. Однако транскрипционный анализ ISGs в ответ на инфекцию (HSV - вирус простого герпеса и Listeria monocytogenes) MOLF подтвердил дефект в их IFN-ответе и некоторых NF-kB-регулируемых генах, гены IL-1a, IL-1b, Tnf, Tlr2 и IL-6 были апрегулированы. Причина подобного эффекта связана с дефектом в N-концевом домене STING (было нами показано ранее). Далее с использованием STING-специфических антител изучено взаимодействие MOLF-STING с IRF3, STAT6, cGAS, TBK1 и TRAF6. Сигнал от TLR4-рецептора может распространяться по двум путям – «MyD88-зависимому» и «MyD88-независиммому/TRIF-зависимому». Первый путь приводит к активации генов провоспалительных цитокинов, а второй – интерферонов I типа. В проведении «MyD88-зависимого» сигнала задействованы протеинкиназы IRAK, убиквитин-лигаза TRAF6, TAK1-киназа и другие участники, активирующие транскрипционный фактор NFkB или МАР-киназы. В случае «TRIF-зависимого» пути, сигнал передается на IRF-факторы, взаимодействующие с ISRE-элементами генов-мишеней. Для некоторых TLR (в том числе TLR4) возможно также переключение сигнала на путь запрограммированной клеточной гибели, в том числе, с участием STING и ISGs. Наши исследования показали, что специфическими компонентами, связывающимися со MOLF-STING, являются TBK1, IRF3, и cGAS: cGAS -это сенсор и нуклеаза ДНК, TBK1 - это киназа, которая активируется на поверхности STING, IRF3 - регуляторный фактор транскрипции интерферонов. Вторая серия экспериментов была направлена на изучение корреляции между экспрессией IL-6 и гиперактивацией NF-kB-пути у мышей MOLF, а также роли IRAK2 в высокой экспрессии IL-6 у мышей данной линии. MOLF макрофаги более сильные производители некоторых провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, по сравнению с макрофагами C57BL/6, из-за предпочтительной экспрессии провоспалительной изоформы IRAK2. NF-kB и p38 MAP-киназа вносят вклад в транскрипционное активирование IL-6, поэтому нами был исследован их статус в ДНК-активированных клетках MOLF. Результаты экспериментов показали, что в ответ на стимуляцию TLR наблюдалась гиперактивaция NF-kB и p38 у мышей MOLF, от которой, в свою очередь, зависела активация STING. После проведения экспериментов по нокдауну IRAK2 мы наблюдали значительное снижение продукции IL-6 у мышей MOLF. Таким образом, в данном случае можно с уверенностью сделать вывод о наличии MOLF-специфических взаимодействий между NF-kB и STING-путями на уровне IRAK2. При изучении динамики изменения уровня провоспалительных цитокинов было показано, что если в течение первых 2 час после инъекции TNF-альфа уровень IL-1 и IL-6 в крови RIP3(-/-) особей увеличивался в той же степени, что и у WT мышей, то через 6 час концентрация данных цитокинов была значительно ниже у мышей первой группы. Из наблюдения следует два вывода: а) у RIP3(-/-) мышей провоспалительный NFkB-путь остается интактным, так как RIP3-киназа в нем не задействована; б) стабильно высокий уровень воспалительных цитокинов у WT мышей, вероятнее всего, является результатом «вторичного» иммунного ответа, вызванного некроптотической гибелью клеток, нежели результатом первичной активации макрофагов при действии TNF-альфа. Эти данные еще раз подчеркивают физиологическую значимость типа клеточной гибели: именно при некроптозе формируется положительная «обратная петля», амплифицирующая воспалительные реакции. Мы протестировали, показывают ли макрофаги C57BL/6 и MOLF различную чувствительность к некроптозу, индуцированному через Toll-подобные рецепторы. Cистема сигналинга MOLF включает в себя негативные регуляторы TLR сигналинга, которые не экспрессируются в C57BL/6 макрофагах, такие как IRAK1-BP1, чтобы ослабить некоторые из этих провоспалительных эффектов. Мы исследовали чувствительность MOLF макрофагов к TLR-индуцированному некроптозу в следующих условиях: макрофаги были активированы агонистом TLR4, LPS, или агонистом TLR7, IMQ, в присутствии или в отсутствие zVAD. Хотя C57BL/6 макрофаги были чувствительны к клеточной гибели, индуцированной TLR стимуляцией в присутствии zVAD, MOLF макрофаги были устойчивы. Важно отметить, что это различие зависело от активности RIP1 киназы, потому что ингибирование киназной активности Nec-1 значительно увеличивало выживаемость C57BL/6. Макрофаги и той, и другой линии, активированные без zVAD, не показали снижения жизнеспособности. Кроме того, макрофаги из F1 (C57BL/6xMOLF) гибридов показали промежуточную чувствительность, что предполагает кодоминантный тип наследования, поддающийся классическому генетическому анализу. Направление сигнала по пути апоптоза/некроптоза/выживания, сложным образом зависит от уровня экспрессии cFLIP и от баланса его «короткой» (cFLIPR) и «длинной» (cFLIPL) изоформ, которые в разной степени подавляют протеолитическую активность CASP8. Наши исследования показали, что дефицит cFLIPL способствует образованию Комплекса II, стимулируя пироптоз и секрецию IL-1 и IL-6 в ответ на LPS. В итоге, LPS-индуцированная смерть в отсутствие cFLIPL протекала по типу пироптоза, в то время как стимуляция LPS при ингибировании TAK1 одновременно активировала как апоптотические, так и пироптотические пути гибели клеток. Результаты экспериментов также показали, что LPS-индуцированная выработка IL-1 и IL-6 в макрофагах с дефицитом cFLIPL поразительно схожа с TLR4-TRIF-RIPK1-FADD-CASP8-зависимой «альтернативной активацией инфламмасом», выявленной в моноцитах человека, но это требует дальнейшего изучения. Таким образом, если уровни cFLIPL достаточно высоки, что может быть достигнуто при предварительной обработке LPS до ингибирования TAK1, активация CASP8 ингибируется, как и пироптоз. При низких уровнях cFLIPL, например, при одновременной обработке LPS/5z7, CASP8 активируется сначала локально, образуя гетеродимеры cFLIP/CASP8, которые могут вступать в контакт и расщеплять CASP3 и RIP1. Когда cFLIPL истощается, гомодимеры CASP8 легко образуются, проявляю свою биологическую активность, а LPS-активированные макрофаги быстро подвергаются пироптозу и выделяют IL-1, который, в свою очередь, стимулирует выработку IL-6. Третья серия экспериментов была направлена на изучение вклада индивидуальных мутаций и одиночных полиморфизмов STING у мышей MOLF в продукцию IL-6, а также идентификацию локусов, обеспечивающих высокую продукцию IL-6 у мышей данной линии. Используя промотор IL-6, было исследовано влияние мутаций 47/48 (и S53L) на активацию IL-6, так как именно у них наибольший вклад в дефект IFN-сигнала. Ранее нами мы обнаружили, что множественные полиморфизмы в STING MOLF (L47V, A48G, S53L, S103F, I114M, Y115C, Y126S и 6-аa делеций 116-122 в NTD, с одной заменой, N210D, в CTD STING) будут влиять на вторичную структуру белка и нарушать трансмембранные участки связывания STING. Так, удалось обнаружить естественный мутантный вариант STING, в котором АК-замены (L47V, A48G, and S53L) располагаются в N-концевом домене и сопряжены с нарушением трафика STING из ER в аппарат Гольджи. В данной серии экспериментов мы показали, что высокая продукция IL-6 у MOLF обусловлена задержкой STING в ER, а 47/48-полиморфизмы коррелируют с высоким уровнем IL-6. Поскольку MOLF является дикой инбредной линией, на которой технически сложно провести интересующие нас нокауты, мы воспользовались подходом даунрегуляции экспрессии генов с использованием лентивирусoв, кодирующих сайленсинг-шпильки. Для анализа эффективности сайленсинга гена MyD88 макрофаги мышей линий MOLF и C57BL/6, трансдуцированные лентивирусом, кодирующим shРНК3257, активировали различными TLR-агонистами (LPS, LTA, CL-097, CpG) и проводили оценку уровня секретируемых цитокинов. Инактивация экспрессии MyD88 приводит к значительному снижению продукции IL-6 в макрофагах мышей линии MOLF. Таким образом, внутриклеточный адаптер MyD88, взаимодействующий с цитоплазматическим доменом TLR и активирующий компоненты TLR-сигнального пути, играет центральную роль в активации макрофагов мышей линий MOLF. Нокдаун гена MyD88 полностью подавлял иммунный ответ в клетках. Далее мы ввели мутации в домен димеризации (DD) STING, которые обеспечили конститутивную активацию и транслокацию STING из ER. Затем проклонировали 47/48-мутации в DD у конститутивно активированных мутантов STING, в результате чего процесс транслокации STING из ER стал невозможен, что привело к переключению IL-6 на конститутивный режим, еще раз подтвердив вышеуказанное заключение. Нами также были получены гибридные мыши F1 (MOLFхC57BL/6), которые были использованы в F2-интеркроссе. У полученных гибридов проведен анализ ассоциации между фенотипом (высокий уровень IL-6) и индивидуальными локусами генома MOLF. Оказалось, что уровень IL-6 в гибридных макрофагах сравним со средним значением уровня IL-6 в C57BL/6. Мы провели генетический скрининг на введение агонистов TLR. В качестве агонистов были использованы LTA (липотейхоевая кислота) и CpG (CpG-олигонуклеотиды, аналоги гипометилированной ДНК), которые являются активаторами MyD88-зависимого сигнального каскада и модулируют STING-ответ. Нам удалось определить, что генетические различия в ответах иммунной системы на CpG ассоциируются с двумя хромосомными локусами. Один из локусов на хромосоме 2 содержит ген маннозного рецептора (MRC1), низкие уровни экспрессии которого были отмечены только у макрофагов мышей линии MOLF. Другой локус, расположенный на хромосоме 10, обуславливает низкий иммунный ответ на стимуляцию большинством из агонистов рецепторов TLR (CpG (TLR9), LTA (TLR2), LPS (TLR4), Имиквимод (TLR7)), обладает ингибиторным эффектом на TLR-опосредованную активацию. Вклад этого локуса в фенотип наследуется по доминантному признаку. С использованием гибридов мы обнаружили, что более выраженные ответы у мышей линии MOLF обусловлены локусом в хромосоме 13. Последующий анализ генов-кандидатов позволил выявить несколько представителей, которые дифференциально экспрессируются в MOLF макрофагах и содержат многочисленные полиморфные замены. Согласно предлагаемой рабочей модели, ITIM домен в цитоплазматическом «хвосте» данных белков имеет нарушенную структуру в линии MOLF и поэтому не способен рекрутировать ингибиторную фосфатазу, что придает иммунному ответу в MOLF мышах более выраженный провоспалительный характер.