Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проведен аналитический обзор по проблеме связи заболеваний и дисфункции мозга с метаболитами микробного происхождения; использовались полнотекстовые статьи из журналов в специализированных базах данных, таких как Web of Science, Scopus, Pubmed, за период 20 лет (1999-2018 гг.). Оказалось, что большинство работ, вошедших в аналитический обзор (53%), опубликовано в последние два года (2017-2018 гг.), что убедительно свидетельствует об актуальности темы и востребованности исследований в данной области. Результаты проведенного патентного поиска также позволили сделать важный вывод о высокой востребованности исследований в области метаболических профилей низкомолекулярных соединений микробного происхождения для диагностики и коррекции нарушений деятельности мозга, в том числе при сепсисе, так как эти результаты не отражены в патентной литературе ведущих стран. Данный вывод служит основанием для оформления заявки на патент в 2019 году в рамках Проекта РНФ №15-15-00110. В ходе выполнения работ в 2018 году успешно решены ряд методологических задач. Так, для извлечения ароматических микробных метаболитов фенольной природы из образцов сыворотки крови использовали жидкость-жидкостную экстракцию диэтиловым эфиром с последующим анализом на газовом хроматомасс-спектрометре (ГХ/МС). Всего в 2018 году выполнено 954 определения фенольных метаболитов (бензойная (БК), фенилпропановая (ФПК), фенилмолочная (ФМК), коричная, п-гидроксибензойная (п-ГБК), п-гидроксифенилуксусная (п-ГФУК), п-гидроксифенилпропановая (п-ГФПК), гомованилиновая (ГВК), п-гидроксифенилмолочная (п-ГФМК) кислоты). При исследовании нового биологического объекта – спинномозговой жидкости в 2018 году получены воспроизводимые результаты по определению вышеперечисленные ароматических метаболитов. Показано, что все фенилкарбоновые кислоты извлекаются из образцов спинномозговой жидкости на 100% и могут быть количественно определены в диапазоне концентраций 0.5 – 10 мкМ (коэффициент корреляции R2 ≥ 0.9981). С целью решения задачи извлечения микробных метаболитов индольного строения [https://doi.org/10.1186/s40635-018-0196-z], таких как индол-3-уксусная, индол-3-молочная и 5-гидкроксииндол-3-уксусная кислоты, из биологических образцов исполнителями проекта активно разрабатывается альтернативная методика пробоподготовки, включающая микросорбционное концентрирование в шприце, заполненном сорбентом. Такой методологический подход позволяет получать воспроизводимые результаты по извлечению метаболитов из образцов сыворотки крови в клинически значимом диапазоне концентраций 0.5 – 10 мкМ. Новизна и охраноспособность полученных результатов подтверждены полученным Патентом РФ № 2663571 от 07.08.2018. Важно подчеркнуть, что метод микросорбционного концентрирования в шприце, заполненном сорбентом, является полуавтоматическим методом, значительно уменьшающим общее время пробоподготовки 1 образца (с 45 до 6 мин) и объем необходимого биологического образца (с 200 до 80 мкл). Для проверки гипотезы о влиянии АММ на сосудисто-тромбоцитарное звено гемостаза in vitro проведено 112 тестов для определения агрегации тромбоцитов в образцах здоровых добровольцев (n=11). Ранее было показано разнонаправленное влияние АММ на нативную агрегацию тромбоцитов; дозозависимый эффект не был выявлен. В настоящем исследовании показано значимое снижение индуцированной агрегационной активности тромбоцитов (ASPI test) под влиянием п-ГФУК в концентрации 15 μM и п-ГФМК в концентрации 30 μM (на 27% and 19.5%, соответственно). ASPI test позволяет оценить влияние ингибиторов циклооксигеназы (СОХ) и IIb/IIIa антагонистов посредством внесения в реакционную среду арахидоновой кислоты, являющейся субстратом для COX. Под влиянием COX формируется тромбоксан-A2 (TXA2), мощный активатор тромбоцитов. Снижение в эксперименте под воздействием гидроксилированных АММ агрегационной активности тромбоцитов потенциально свидетельствует о воздействии через данные сигнальный путь [https://doi.org/10.1186/s40635-018-0196-z]. При исследовании влияния производных триптофана – индол-3-уксусной и индол-3-карбоновой кислот, а также 5-гидроксииндола – на активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), которое оценивалось спектрофотометрически по восстановлению акцепторов электронов МТТ и ДХФИФ, обнаружено, что все индольные производные вызывали дозозависимое ингибирование СДГ. Подобный эффект индольные соединения оказывали на интегральные функции митохондрий, в частности на аккумуляцию ионов кальция и индукцию циклоспорин-чувствительной неспецифической проницаемости мембран. Механизм ингибирования как индольными, так и фенольными метаболитами, связан с их взаимодействием с тиоловыми группами белков и ферментов. В разделе клинических исследований продолжен поиск клинически значимых метаболитов у пациентов двух групп (группа А - с дисфункцией мозга, группа В - с дисфункцией миокарда) с применением метода газовой хроматомасс-спектрометрии (ГХ/МС). Предварительные результаты выявили различия метаболического профиля в исследуемых группах. Так, в группе А проведено 102 определения метаболитов триптофана; индол-3-уксусная кислота обнаружена в 38% образцов сыворотки и в 36% образцов кишечного содержимого; индол-3-карбоновая кислота – в 23% образцов кишечного содержимого. В группе В у пациентов с острой дисфункцией сердца (острый коронарный синдром, инфаркт миокарда в день поступления в стационар) проведено 275 определений метаболитов триптофана; индол-3-уксусная кислота в образцах сыворотки крови обнаружена во всех исследованных образцах (в 100% случаев). В группах сравнения получены достоверные различия по уровню ряда биомаркеров. Так, в группе А выявлены высокие корреляции между концентрациями маркера повреждения головного мозга S100B и бензойной кислотой (r =0.4, p<0.005), между S100B и кортизолом (r =0.52, p<0.005). Суммарный уровень ароматических микробных метаболитов в этой группе был очень низким и достоверно отличался от группы В: 0.07 (0.06-0.1) vs 5.97 (4.57-7.31) мкМ , соответственно, p<0.0001. В то же время, уровень NT-proBNP в группе В был в несколько раз выше по сравнению с группой А: 525 (212 - 3460) vs 155 (88- 266) пг/мл, соответственно, p<0,0001. Динамическое наблюдение показало, что нарастание трех ароматических метаболитов на фоне лечения, а также NT-proBNP и РСТ, является прогностически неблагоприятным и коррелирует с летальностью. У пациентов с острым коронарным синдромом повышение концентрации NT-proBNP параллельно с суммарной концентрацией ароматических метаболитов свидетельствует в пользу гипотезы о непосредственном участии АММ в развитии дисфункции миокарда в качестве миокардиодепрессантов. Набор клинического материала и анализ результатов продолжается. Результаты исследований доложены в форме устных или постерных докладов на зарубежных конгрессах, таких как - ESICM (European Society of Intensive Care Medicine) LIVES 2018, Париж, Франция, 20-24 октября 2018; - Sepsis-Forum 2018, Бангкок, Таиланд, 1-3 октября 2018; - 6th World Congress on Targeting Microbiota, Порту, Португалия, 28-30 октября 2018, и на российских конференциях с международным участием. В 2018 году результаты исследований по Проекту опубликованы в журналах "Shock", "Journal of Critical Care", "Intensive Care Medicine Experimental", "Journal of Bioenergetics and Biomembranes", "Журнал аналитической химии", "Биофизика", "Биологические мембраны" и др. В издательстве Медицинское информационное агентство (МИА) в 2018 году вышла в свет монография "Сепсис. Метаболомный подход" ISBN 978-5-9986-0350-1 [https://medbook.ru/books/31751]

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В результате многочисленных исследований разработан способ одновременного (в одном образце сыворотки крови) определения восьми ароматических метаболитов (бензойная - БК, фенилпропановая - ФПК, фенилмолочная - ФМК, пара-гидроксибензойная - п-ГБК, пара-гидроксифенилуксусная - п-ГФУК, гомованилиновая - ГВК, пара-гидроксифенилпропионовая - п-ГФПК, пара-гидроксифенилмолочная - п-ГФМК) в клинически значимом диапазоне (0,5-15 мкМ), основанный на микросорбционном концентрировании в шприце, заполненном силикагелем с привитой фазой С18 (MEPS), с последующим переводом целевых компонентов в летучие производные (дериватизация) и анализом методом газовой хроматомасс-спектрометрии (ГХ-МС). Разработанный способ характеризуется высокой экспрессностью, удовлетворительной воспроизводимостью, и будет востребован для решения практических задач лабораторной диагностики в медицине и для научных целей в метаболомике. Подробно разработанные условия и полученные результаты опубликованы в журнале "Clinical Mass Spectrometry» (2019, Scopus, Cite Score 1.25, https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2376999818300527?via%3Dihub). Результаты, достигнутые с применением MEPS, связаны с уменьшением влияния матрицы на сорбцию и загрязнение сорбента. Поскольку именно эти факторы ранее являлись лимитирующими при использовании сверхсшитого полистирола для извлечения фенольных метаболитов из сыворотки крови, изучена возможность использования этого сорбента в варианте MEPS. Иглы со сверхсшитым полистиролом не производятся (отсутствуют на рынке), авторами сконструирован аналог MEPS, позволяющий пропускать образец через сорбент несколько раз. Разработаны условия наиболее полного извлечения фенольных метаболитов из сыворотки крови, проведено сопоставление полученных результатов с результатами для коммерческой установки MEPS, показана принципиальная возможность использования сверхсшитого полистирола в качестве альтернативного сорбента. Разработанные условия и полученные результаты подробно представлены в статье в журнале «Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis» (2020, WoS, Scopus, IF 2,983, Q1 https://doi.org/10.1016/j.jpba.2019.112883). Для одновременного определения концентрации микробных и митохондриальных метаболитов в сыворотке крови у пациентов с сепсисом разработаны ГХ-МС условия, позволяющие наряду с фенилкарбоновыми кислотами (ФКК) количественно определять трикарбоновые кислоты, а именно янтарную и фумаровую, в клинически-значимом диапазоне концентраций 0.5-70 мкМ, а также итаконовую кислоту в диапазоне 0.5-15 мкМ. Разработанные условия и полученные результаты подробно представлены в статье, опубликованной в отчетном году в журнале «Metabolites» (2019, WoS, Scopus, IF 3,303, Q1 https://www.mdpi.com/2218-1989/9/10/196). Целенаправленные клинические исследования привели к важному результату: в крови пациентов с сепсисом обнаружен особый метаболит митохондрий – итаконовая кислота. Этот метаболит синтезируется в цикле трикарбоновых кислот только в ответ на инфекцию (под действием бактериальных липополисахаридов). Итаконовая кислота в физиологических условиях является противовоспалительным фактором, регулируя активность иммунных клеток как ингибитор, сукцинатдегидрогеназы (СДГ). Ранее другим исследователям при сепсисе удавалось обнаруживать итаконовую кислоту только в активированных клетках (макрофагах), но не в крови. В нашем исследовании установлено, что итаконовая кислота обнаруживается в крови пациентов с клинической картиной документированного сепсиса – но только на ранней стадии этого состояния. Для пациентов с поздней стадией сепсиса характерны высокие уровни фенольных метаболитов, что клинически сопровождается жизнеугрожающими дисфункциями органов с плохим прогнозом. В нашей работе впервые обнаружено, что микробные метаболиты фенольной природы, действуя по аналогии с итаконовой кислотой, также способны ингибировать активность СДГ. Показано, что итаконовая кислота, ФМК и п-ГФМК снижают активность СДГ на 20-50% в одном и том же диапазоне концентраций: от 0,5 до 5,0 мМ. Важно, что действие микробных метаболитов на митохондрии (то есть на клеточный метаболизм) осуществляется на разных сайтах комплекса, так как промежуточный переносчик электронов феназинметасульфат полностью снимает ингибирование, вызванное микробными фенольными кислотами, и не влияет на ингибирование, индуцированное итаконовой кислотой. Подробно полученные результаты представлены в статье: «Metabolites» (2019, WoS, Scopus, IF 3,303, Q1 https://www.mdpi.com/2218-1989/9/10/196). В ходе клинических исследований у пациентов группы ранней стадии сепсиса концентрации трех «сепсис-ассоциированных» ФКК (ФМК, п-ГФУК и п-ГФМК) и их суммы (∑3ФКК) в среднем в 10 раз превышала значения нормы; а у пациентов группы поздней стадии сепсиса более чем в 30 раз превышала значения нормы. Самые высокие корреляции обнаружены в группе пациентов с ранней стадией сепсиса между уровнем п-ГФМК и значением по шкале SOFA (r=0,84); корреляции между микробными и митохондриальными метаболитами также были достоверными и превышали значение r>0,5. Наличие выраженной прямой корреляционной связи между уровнями микробных, митохондриальных метаболитов в крови и шкалой SOFA подтверждает участие микробных метаболитов в развитии митохондриальной дисфункции при сепсисе и целесообразность поиска способов управления этим процессом. Результаты также представлены в статье, опубликованной в журнале «Metabolites» (2019, WoS, Scopus, IF 3,303, Q1 https://www.mdpi.com/2218-1989/9/10/196). Прогностическая значимость микробных метаболитов ароматической структуры была показана нами на предыдущих этапах работы (в ходе выполнения проекта №15-15-00110, 2015-2017 гг.) у пациентов с абдоминальным сепсисом, доказаны их участие в патогенезе септического шока и связь с летальностью. В отчетном году изучена прогностическая значимость трех сепсис-ассоциированных метаболитов (ФМК, п-ГФМК, п-ГФУК) у пациентов ОРИТ с внебольничной пневмонией. У пациентов с ИВЛ ассоциированной пневмонией выявлены корреляционные зависимости между ФКК и тяжестью состояния, наличием шока, степенью ацидоза, уровнем прокальцитонина, лактата (p<0,001). Две группы пациентов с благоприятным и неблагоприятным исходами в момент обследования различались по значениям шкал APACHE II: 8 (6-12) vs 18 (12-22), p<0.001; шкале SOFA: 2 (1-4) vs 7 (6-10), p<0,001; шкале CURB-65: 2 (1-3) vs 3 (3-4); по сывороточным концентрациям ФМК 0,6 (0,3-1,1) vs 1,9 (0,7-3,1) мкМ, p<0,001; п-ГФМК 1,8 (1,4-3,1) vs 4,2 (2,9-9) мкМ, p<0,001; п-ГФУК 1,5 (0,8-3,2) vs 3,7 (0,9-9,3) мкМ, p=0,05; по сумме трех метаболитов Σ3ФКК 4,3 (2,8-8,4) vs 13,8 (4,9-35,1) мкМ, p<0,001. Показано, что один метаболит, а именно ФМК, обеспечивает прогностические характеристики схожие с любой из общепринятых многопараметрических шкал (APACHE II, SOFA или CURB-65). Таким образом, сывороточные концентрации ФКК могут быть использованы в качестве независимых критериев для оценки прогноза у пациентов с внебольничной пневмонией, что в перспективе найдет применение для раннего выявления пациентов самого высокого риска. Результаты доложены на конгрессе и опубликованы в виде тезисов в журнале "Critical Care» (2019, WoS, Scopus, IF 6,959, Q1, https://ccforum.biomedcentral.com/articles/supplements/volume-23-supplement-2). Для проверки гипотезы о значимости ароматических метаболитов в осуществлении взаимосвязи «микробиота-кишечник-мозг» проанализированы образцы спинномозговой жидкости нейрохирургических пациентов (n=37) в критическом состоянии с инфекцией центральной нервной системы, после перенесенной черепно-мозговой травмы и опухолью мозга. Выявлены следующие достоверные корреляционные связи (p<0,05) между ароматическими метаболитами и биомаркерами: Σ6ФКК и прокальцитонином – 0,35; 5-гидроксииндолуксусной кислотой и интерлейкином-6 – 0,39; 5-гидроксииндолуксусной кислотой и нейроспецифической енолазой (NSE) – 0,43; п-ГБК и белком S100 – 0,39; п-ГБК и NSE – 0,50; ГВК и S100 – 0,42; п-ГФМК и NSE – 0,36.Полученные результаты указывают на потенциальное участие фенольных и индольных метаболитов в патогенезе дисфункции головного мозга и являются основанием для дальнейших целенаправленных исследований. Результаты представлены в докладе на международном конгрессе, тезисы опубликованы в журнале «Intensive Care Medicine Experimental» (2019, https://icm-experimental.springeropen.com/articles/supplements/volume-7-supplement-2).