Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В данном проекте исследуется возможность получения тканеинженерных ситем для реконструкции уретры. Данные конструкции включают в себя два основных компонента: пласты эпителиальных клеток и биодеградируемые эластичные трехмерные скаффолды, обеспечивающие механические свойства тканей. Для получения эпителиальных клеточных пластов будет применена технология безферментного снятия клеток с термочувствительных полимеров. Источником эпителиальных клеток будут клеточные сфероиды, полученные из буккального эпителия. На первом этапе работы были получена серия термочувствительных полимеров на основе N-изопропилакриламида (NIPAM), сополимер N-изопропилакриламида и N-трет-бутилакриламида, а также на основе биодеградируемых термочувствительных полимеров на основе поли(D,L-лактид)а - PLA, поли(ε-капролактон)а – PCL и полиэтиленгликоля - PEG. Кроме того, впервые был проведен синтез (со)полимеров на основе замещенных оксазолинов. У всех полимеров были определены молекулярные массы и полидисперсность. Определены температуры структурных переходов (нижние критические точки растворимости). На основе термочувстительных полимеров были получены ультратонкие (100 нм толщиной) термочувствительные покрытия. Покрытия получали методом spin-coating (центрифугирования). Показано, что покрытия нетоксичны и цитосовместимы. Термочувствительные покрытия поддерживалм адгезию и пролиферацию клеток. При понижении температуры ниже температуры перехода на данных полимерах наблюдали полное спонтанное открепление клеточных пластов. Были получены сфероиды из клеток буккального эпителия. Экспериментально показано, что сфероиды характеризуются высокой жизнеспособностью и пратически отсутствием некротических клеток. Для получения биодеградируемых трехмерных эластичных матриц-скаффолдов использовался метод поверхно-селективного лазерного спекания . Спекание осуществлялось за счет нанесения на слой подготовленного нами полимера заданной толщины микрокапель воды, с помощью ультразвукового диспергатора. Для спекания использовалась лазерное излучение длиной волны 1940 нм, которое не поглощалось полимерными частицами, однако хорошо поглощалось микрокаплями воды, за счет чего происходило спекание приповерхностных зон полилактидных частиц, избегая воздействия на основную массу полимера. Таким способом спекая слой полимерного материала за слоем мы получили трехмерные пористые конструкции необходимой нам формы. Были исследованы механические свойства полученных структур методом наноиндентометрии. Была изучена биодеградация полученных структур in vitro при 37°С в различных средах. Полученные результаты позволяют утверждать, что в зависимости от типа используемой среды за в зависимости от типа используемой среды за 4 недели скаффолды теряют от 20 до 50 процентов своей массы. Для оценки биосоместимости созданных материалов была использована конфокальная визуализация живых/мертвых мезинхемальных стромальных клеток культивировавшихся на скаффолдах (двух типов изготовленных с разной скоростью хода лазерного луча) в течении трех дней. Показано, что скаффолды обладают необходимыми характеристиками для для адгезии и пролиферации клеток.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На втором этапе выполнения проекта был проведен сравнительный анализ динамики открепления клеточных пластов из первичной культуры дермальных фибробластов человека с термочувствительных пленок разного состава. Для анализа были использованы три полимера – синтезированные pNIPAm и два его сополимера с NtBA разных молекулярных масс. Показано, что адгезия клеток и рост на ультратонких пленках из всех трех образцов не отличались. Однако в динамике открепления были выявлены различия – на чистом pNIPAm и его более низкомолекулярном сополимере в течение 50-60 мин появлялись лишь признаки открепления, в то время как на более высокомолекулярном pNIPAm-NtBA признаки открепления наблюдали уже через 15 минут, а через 45-50 минут полностью спонтанно откреплялся полный пласт. Таким образом показано, что от состава и свойств полимера зависит время и качество формирования клеточных пластов. Показано, что при откреплении пластов из дермальных фибробластов, культивированных в течение 7 суток на высокомолекулярном pNIPAm-NtBA, целостность структуры сохраняется, но происходит их спонтанная контракция. При этом площадь полученных пластов уменьшается в среднем в 9,85 раз относительно исходной площади культуральной поверхности. Анализ структуры пластов показал, что после открепления цитоскелет представлен F-актином, в основном с околомембранной локализацией. Внеклеточный матрикс в полученных пластах представлен фибронектином, а также коллагенами I и III типов. Показано, что на указанных сроках культивирования получаемые пласты не обладают достаточной механической прочностью для манипуляций. При переносе пластов на новую адгезивную поверхность с помощью пипетки формировался плотный агрегат клеток, несмотря на быструю адгезию к матрице. В течение двух недель после переноса распределение клеток по поверхности было неравномерным: в области адгезии и агрегации пласта наблюдали максимальную плотность клеток, на периферии плотность не достигала 100% конфлуэнтности. Для усиления свойств пластов без увеличения сроков культивирования были опробованы методики получения пластов из клеточных сфероидов, усиления синтеза внеклеточного матрикса с использованием методики макромолекулярного краудинга, а также сочетания двух этих подходов. Добавление макромолеклярного краудера каррагинана приводило к потере возможности открепления пластов с термочувствительной пленки. Добавление каррагинана в среду при 3D культивировании клеток не приводило к достоверным изменениям в интенсивности накопления коллагенов I и III типов в составе сфероидов. Однако добавление краудера ко вторичноприкрепленным культурам (после помещения сфероидов на адгезивную поверхность) приводило к большему накоплению коллагена I типа. При этом при понижении температуры наблюдали открепление сформировавшихся пластов и фрагментов пластов. Таким образом, сочетание методик 3D культивирования, вторичноприкрепленных культур на термочувствительных пленках и макромолекулярного краудинга может стать новой уникальной технологией для получения клеточной составляющей с более высоким содержанием внеклеточного матрикса для получения тканеинженерных конструкций. Другим возможным подходом к получению клеточных пластов с более оптимальными механическими свойствами стало культивирование клеток на трехмерных матрицах, полученных из сополимера pNIPAm-NtBA методом электроспиннинга, в присутствии краудера каррагинана. Такая технология также позволила за 7 суток получать более плотные многоклеточные структуры. Эффективность конструкций, полученных на 3D термочувствительных матрицах, оценили в эксперименте in vivo на модели полнослойных раны диаметром 5мм, включающих в себя эпидермис, дерму, подкожную клетчатку и мышечную ткань. Показано, что за 14 суток происходит полное заживление ран как в контрольной группе (без применения пластов), так и в экспериментальных группах, где на раны накладывали клеточные пласты, полученные без добавления и в присутствии краудера каррагинана. Однако на 7 сутки эксперимента площадь раны в группе пластов с добавлением каррагинана была достоверно ниже, чем в двух других группах.