Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Работы в рамках проекта выполнялись в отчетный период с августа (даты подписания соглашения - 03.08.2018) по декабрь 2018 года. За первый год проекта выполнен начальный этап мультидисциплинарного исследования по изучению влияния глобального изменения климата на холодолюбивых эндемичных амфипод озера Байкал. Были установлены термохронометры для наблюдения за температурой в зоне верхней литорали озера в запланированных для проведения исследования точках сбора амфипод, согласно популяционной структуре изучаемых видов – юго-западное (пос. Большие Коты), южное (Порт Байкал) и восточное (Усть-Баргузин) побережье озера, а также в мелководном озере, расположенном в непосредственной близости от байкальского побережья (место обитания потенциального вселенца Gammarus lacustris). Проанализированы данные, полученные с предварительно установленных термохронометров в прибрежной зоне посёлка Большие Коты. В частности, определена среднегодовая температура, годовые максимумы и минимумы, самые теплые и самые холодные месяцы. Прослежена динамика изменений средимесячных температур в августе за три года. Определены периоды осенней и весенней гомотермии, динамика нагрева и охлаждения. На основании этих данных сделан предварительный вывод о тенденциях изменения температурного режима в этой зоне наблюдения за три года. Для проведения экофизиологической части работы выловлены и акклимированы амфиподы трех, выбранных для проведения исследования модельных видов – байкальские термочувствительный Eulimnogammarus verrucosus (Gerstf.) и термоустойчивый Eulimnogammarus cyaneus (Dyb.), а также потенциальный вселенец – голарктический Gammarus lacustris Sars. Для определения влияния сезона вылова на биохимические и молекулярно-биологические параметры выловленных из заложенных трансект амфипод сортировали и фиксировали в жидком азоте непосредственно после вылова ежемесячно, начиная с августа 2018 года. Кроме этого, было проведено экспериментальное исследование по оценке влияния длительной акклимации на амфипод при температурах, отличных от предпочитаемых и при температурах, отличных от среднегодовой температуры литорали оз. Байкал. В качестве предпочитаемых температур были выбраны исследованные нами ранее видоспецифические зоны температурного оптимума - 6 °C для E. verrucosus, 12 °C для E. cyaneus и 15 °C для G. lacustris (согласно Тимофеев, 2010). Все три температуры использовали для оценки биохимических адаптаций изучаемых видов в двух экспериментальных сценариях. Для оценки биохимического потенциала низкотемпературных адаптаций дополнительно проводили экспонирование изучаемых видов при 1,5°С. Результаты экспериментального исследования показали, что у байкальских литоральных амфипод показатели базовой активности трех антиоксидантных ферментов выше, чем у голарктического G. lacustris. Это согласуется с нашей гипотезой о наличии специфических адаптаций байкальских эндемиков к повышенному содержанию растворенного кислорода в воде Байкала, что может вызывать усиленное образование активных форм кислорода. Акклимация амфипод к температурам ниже предпочитаемых не вела к существенному изменению в активности антиоксидантных ферментов у байкальского холодолюбивого вида E. verrucosus, размножающегося в зимние месяцы, что согласуется с нашей гипотезой о наличии у этого вида особых биохимических и клеточных адаптаций к температурам, близким к нулю. При этом температуры выше предпочитаемых усиливают активность глутатион S-трансферазы у данного вида, что может означать развитие клеточного стресса. Показано, что оба термоустойчивых вида продемонстрировали изменение активности всех трех антиоксидантных ферментов при акклимации при температурах, ниже предпочитаемых. Это может означать активизацию клеточных процессов, связанных с усилением генерации активных форм кислорода и развитием клеточного стресса. Результаты продемонстрировали, что акклимация амфипод к их собственным, эволюционно обусловленным предпочитаемым температурам позволяет более корректно оценить ёмкость и направление биохимических адаптаций видов, поскольку 6 °С является температурой ниже оптимума для E. cyaneus и G. lacustris. Однако, данные результаты свидетельствуют, что акклимация к более низким температурам способна нивелировать биохимические реакции теплолюбивых видов (кроме глутатион S-трансферазы у E. cyaneus), а значит полученные результаты имеют больший экологический смысл. Результаты, полученных в ходе исследования, свидетельствуют о том, что уровни аэробного метаболизма у изучаемых видов примерно одинаковы при их акклимации к предпочитаемым температурам, что подтверждает полученные нами ранее данные о соответствии метаболического кислородного окна зоне предпочитаемых температур (Axenov-Gribanov et al., 2016). Данные свидетельствуют о наличии метаболической компенсации у холодолюбивого вида в условиях низких температур, что выражается в отсутствии реакции лактатдегидрогеназы. Многократное повышение активности фермента при температуре 15 °С свидетельствует о выходе за предела метаболического кислородного окна и активизации процессов анаэробиоза, что соответствует полученным нами данным о верхних границах метаболического кислородного окна для этого вида (Axenov-Gribanov et al., 2016; Jakob et al., 2016). Исследование базовых уровней энергетических метаболитов позволяет предположить повышенный уровень метаболизма у небайкальского G. lacustris, что подтверждает полученные нами ранее данные (Jakob et al., 2016). Более высокий уровень глюкозы, депонированной в гликогене, указывает на повышенную метаболическую активность теплолюбивого E. cyaneus по сравнению с холодолюбивым E. verrycosus. Полученные данные свидетельствуют о наличии разных стратегий адаптации к низким температурам у изучаемых видов. Так, когда оба теплолюбивых вида реагируют на низкие температуры усилением гликогенеза, или депонирования свободной клеточной энергии, на фоне снижения общей метаболической активности, у холодолюбивого вида этого не происходит. Для проведения молекулярно-биологической части исследования по проекту прочитаны и аннотированы транскриптомы изучаемых видов. Было выявлено, что около 10% транскриптов наиболее вероятно принадлежат инфузориям (Ciliophora). Этот результат подтверждает данные литературы о том, что на покровах амфипод обитают разнообразные инфузории (Fenchel, 1965; Chatterjee et al., 2013). При качественном сравнении транскрибируемых генов у трех изучаемых видов в контрольных условиях (после акклимации к 6 °С) было выявлено, что, у представителей холодолюбивого E. verrucosus, в отличие от родственных ему теплолюбивых видов, наблюдали присутствие в транскриптоме белков антифризов, аннотированных как ABA41369.1 type II antifreeze protein [Clupea harengus] (два транскрипта) и ACI32416.1 antifreeze protein [Siniperca chuatsi]. Повышенная экспрессия генов данных белков может быть связана с высокой метаболической активностью E. verrucosus в зимние месяцы, являясь, таким образом, одним из механизмов адаптации данного вида к температурам, близким к нулю. На основании полученных последовательностей транскриптомов была разработана база данных для идентификации белков, содержащая 167 948 аминокислотных последовательностей. С её помощью удалось идентифицировать 944 белков у байкальского вида E.cyaneus. Функциональная аннотация полученного протеома показала, что распределение терминов GO соответствует таковому для аннотированного транскриптома этого вида. Это подтверждает, что описанный протеом адекватно отображает доминирующие клеточные процессы у изученного вида, и данный метод может быть использован в исследовании. Проект «Влияние изменения климата на адаптированных к холоду эндемиков озера Байкал» был анонсирован в СМИ по следующим ссылкам: https://www.baikal-daily.ru/news/16/320176/ https://regnum.ru/news/2520378.html https://www.irk.kp.ru/online/news/3162035/ http://baikal-info.ru/uchyonye-issleduyut-kak-privykshie-k-holodu-endemiki-baykala-perezhivayut-izmeneniya-klimata

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе второго года проекта были получены результаты, освещающие вопросы биохимической адаптации байкальских эндемиков к низким температурам. Было продолжено круглогодичное наблюдение за температурным режимом местообитания объектов исследования. Было выявлено, что температурный режим верхней литорали юго-западного побережья существенно отличается от восточного, что связано с рельефом дна и интенсивностью прибрежных апвелингов. В 2019 году в точках наблюдения пос. Большие Коты и Порт Байкал (юго-западное побережье) отмечали интенсивные суточные колебания температуры (до 8 °С), начиная с июля, в отличии от наблюдений 2016-18 годов, когда интенсивные суточные колебания отмечали только в августе. В литорали пос. Большие Коты среднемесячная температура августа составила 12,8 °С, что выше средней августовской температуры за период наблюдений 2016-2018 г (12,598 °С). Для оценки влияния сезона на физиологические и биохимические параметры были произведены пробоотборы амфипод в литоральной зоне озера на глубине 1–1,5 метра рядом с поселком Большие Коты в такие месяцы как: ноябрь, декабрь, февраль, март, июнь, июль, август. Голарктический вид отлавливали в «Озере 14» в черте того же поселка в марте, июне, июле, августе. Был проведен эксперимент по экспонированию объектов исследования при температурах 6 и 1,5 °С для выявления молекулярно-биологических, физиологических и биохимических механизмов холодовой адаптации. Впервые за всю историю наблюдений за представителями вида E.verrucosus, в пробах из пос. Большие Коты были обнаружены животные, конечности которых были густо покрыты белым опушением, напоминающим нити гриба. При детальном микроскопическом анализе было выявлено, что на конечностях рачков массово развиваются инфузории семейств Vorticillidae и Lagenophryidae. При акклимации пораженных амфипод к лабораторным условиям отмечали дальнейшее развитие поражения и высокую смертность. Для выявления взаимосвязи обнаруженного явления с развивающимся экологическим кризисом в прибрежной зоне озера Байкал были взяты дополнительные пробы из точек наблюдения на юго-западном побережье озера. У двух эндемичных байкальских амфипод и одного голарктического вида-убиквиста обнаружены межвидовые отличия в сезонной динамике активности антиоксидантных ферментов пероксидазы, каталазы и глутатион S-трансферазы. У обоих байкальских видов показана высокая активность каталазы как в зимние, так и в летние месяцы, а у теплолюбивого байкальского вида E. cyaneus показана высокая активность пероксидазы в течение всего года и глутатион S-трансферазы в зимние месяцы. Активность каталазы и пероксидазы меняется в разные сезоны у байкальских эндемиков, в отличии от G.lacustris, у которого показатели активности этих ферментов остаются относительно стабильными. Это позволяет предположить участие исследуемых антиоксидантных ферментов в биохимической адаптации к годовому температурному режиму у байкальских видов. Было показано, что в ходе сезона уровень энергетического метаболизма падает с температурой у всех изучаемых видов. Согласно полученным данным, у представителей G. lacustris отмечали высокое содержание гликогена в мартовских образцах по сравнению с байкальскими видами, что может быть обусловлено запасами метаболической энергии для зимнего периода. Выявлено, что активность Na+/K+-АТФазы при температурах физиологического оптимума зависит от термотолерантности вида и максимальна у наиболее термочувствительного байкальского эндемика E. verrucosus. Анализ физиологических параметров, таких как ЧДД и двигательная активность позволили выявить отличия в реакции на пониженную температуру у изучаемых видов. У всех трех видов длительная инкубация при 1,5 °С приводила к снижению ЧДД, что свидетельствует о снижении скорости метаболизма. Однако, двигательная активность в условиях пониженной температуры менялась видоспецифично. Так, у холодолюбивого E.verrucosus двигательная активность практически не менялась, относительно контроля. У теплолюбивого байкальского E.cyaneus отмечали снижение двигательной активности. Однако у небайкальского G.lacustris двигательная активность падает как в контроле, при 6 °С, так и в эксперименте, при 1,5 °С. Учитывая, что предпочитаемые температуры G.lacustris лежат в области 16-18 °С, данный результат подчеркивает угнетение энергетического метаболизма G.lacustris как при 1,5, так и при 6 °С. Использование метода двумерного электрофореза и масс-спектрометрии позволило выявить наличие видоспецифичных белковых механизмов адаптации к низким температурам у изучаемых видов. Поскольку данный метод позволяет выявить только белки, представленные в протеоме в высокой концентрации, полученные результаты свидетельствуют о значительных отличиях в механизмах энергетического метаболизма и иммунного ответа. Для выявления большего спектра белковых механизмов низкотемпературных адаптаций, была проведена отработка метода глубинного протеомного анализа с применением мечения образцов изобарными метками. Для тестовых образцов было идентифицировано около 30% MS/MS спектров и обнаружено 8426 пептидов для образца № 3 и 9927 пептида для образца № 4. 78.19% пептидов из образца № 3 были успешно помечены TMT-меткой, в то время как 95.27% пептидов из образца № 4 были идентифицированы как помеченные данной меткой. Идентифицировано 967 белковых группы для образца № 3 и 1489 белковых группы для образца № 4. http://www.rscf.ru/upload/iblock/8ed/8edd92dec739b8323529ba89ff3f7dd3.pdf https://nauka.tass.ru/nauka/6937383 https://www.gazeta.ru/science/news/2019/09/27/n_13515079.shtml https://indicator.ru/biology/biologi-podtverdili-unikalno-vysokuyu-skorost-evolyucii-v-bajkale-27-07-2019.htm?fbclid=IwAR16PSd5JsT2UGv7BsoXtUneWPPzCBruzASZJiyk3K7OmaVrbMvjOX4P_0o&utm_source=fbsharing&utm_medium=social https://indicator.ru/biology/shaperon-rachkov-ekologicheskiy-monitoring-bajkala-25-07-2019.htm https://www.gazeta.ru/science/news/2019/07/25/n_13260265.shtml

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения последнего этапа проекта были проведены протеомные и транскриптомные исследования ответа байкальских и голарктических амфипод на воздействие низких температур. Был осуществлен системный анализ полученных данных, сведение и обобщение результатов исследований за три года проекта, формулировка выводов и рекомендаций. Впервые мы выявили белки, активизирующиеся на понижение температуры у амфипод и выявили основные межвидовые различия. В частности, мы выяснили, что, в отличии от G.lacustris, у обоих байкальских видов в ответ на низкие температуры происходит повышение содержания различных белков антиоксидантной системы – тиоредоксина пероксидазы, ксантиндегидрогеназы/оксидазы, каталазы и пероксиредоксина. Кроме того, у байкальских видов в ответ на холод запускаются механизмы, связанные с катаболизмом, транспортом и фолдингом белков. В отличии от термотолерантного байкальского E. cyaneus, у термочувствительного E.verrucosus отмечали повышение содержание белков, связанных с мышечной функцией и цитоскелетом, а также с липидным обменом. Примечательно, что у двух отдаленных популяций E. verrucosus (из пос. Большие Коты и Порта Байкал), которые по нашим данным представляют разные генетические линии с генетическими дистанциями, близкими к разным видам, нами был показан абсолютно разный протеомный ответ на понижение температуры. На функциональном уровне ответы у этих двух линий также различались. Являются ли данные генетические линии разными видами, либо мы наблюдаем фенотипическую пластичность протеомного ответа – предстоит выяснить в будущих исследованиях. Для более полного системного анализа и валидации протеомных данных мы провели также транкриптомное исследование низкотемпературных адаптаций. На транскриптомном уровне нам удалось выявить ранние стадии впадения G. lacustris в оцепенение, типичное для метаболической депрессии через высокую долю генов, связанных с активностью, ростом и размножением, подавленных при воздействии низких температур. Другим свидетельством возникновения оцепенения является обогащение генов, активируемых при 1,5 °C, генами, участвующими в сигнальном пути MAPK, который, как было показано, играет важную роль при входе в спячку, что подтвердило наши протеомные результаты. Более того, наблюдаемая низкая активность G. lacustris при 1,5 °C отражается в падении экспрессии генов, участвующих в регуляции пути актинового цитоскелета у животных, подвергшихся воздействию 1,5 °C. Дополнительно к нашим протеомным данным, на уровне транскриптома мы обнаружили рост экспрессии генов, участвующих в биогенезе рибосом и процессинге мРНК, что можно рассматривать как стратегию компенсации наблюдаемого подавления активности генов. При низкой температуре у E. verrucosus наблюдалось повышение активности экспрессии генов, связанных с трансляцией, а также генов, связанных с оплодотворением и эмбриональным развитием. Это свидетельствует о температурно-индуцируемом начале цикла размножения для данного вида. Выявленная на уровне протеома активизация клеточных функций, связанных с цитоскелетом, передачей сигнала и фолдингом белка, подтвердилась и на уровне транскриптома. Транскриптомный метод позволил нам выявить у подверженного воздействию низких температур E. cyaneus клеточные функции, связанные с функционированием митохондрий, процессами гомеостаза, деградацией белков и липидного обмена. Таким образом, у данного вида транскриптомный и протеомный ответы имели максимальные отличия. Полученные в ходе выполнения проекта результаты играют важное значение в понимании негативного эффекта глобального изменения климата на экосистему озера Байкал. В связи с климатическими особенностями, в которых происходила эволюция современной байкальской фауны, у термочувствительных байкальских эндемиков, к которым относится исследованный в проекте вид E. verrucosus, сформировались физиологические, биохимические и клеточные механизмы поддержания метаболической активности при низких температурах, близких к нулю. Эти механизмы, представленные в отчете, помогают представителям фауны расти и размножаться круглый год, включая зимние месяцы с минимальными температурами. Однако такая способность определяет и повышенную чувствительность к высоким температурам в летние месяцы.