Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В результате первого года работы по Проекту были разработаны подходы к созданию моноспецифических наноконструкций, узнающих заданную молекулярную мишень на поверхности модельных бактериальных клеток. Для этого в первую очередь был проведен отбор и синтез подходящих под цели проекта центральных микрочастиц с оптимальными коллоидно-химическими свойствами. Наночастицы были отобраны исходя из анализа опубликованной литературы на сновании таких критериев как биосовместимость, инертность и мультимодальность. Все синтезированные частицы и частицы, полученные из коммерческих источников, были охарактеризованы современными физическими и физико-химическими методами анализа. Были выбраны и синтезированы следующие типы частиц: Наночастицы гидратированного оксида железа (III). Был разработан новый метод синтеза кубических частиц гидратированного оксида железа (III) исходя из широкодоступных исходных соединений (хлорид железа (III), аммиак, азотная кислота). Показано, что их покрытие с использованием карбоксиметилдекстрана приводит к подавлению неспецифических взаимодействий с белками сыворотки крови такими как альбумин. Магнитные монодисперсные наночастицы различной природы. Был разработан эффективный метод получения различных по природе и размеру суперпарамагнитных наночастиц. Новый метод обладает универсальностью и позволяет синтезировать как частицы магнетита, так и ферриты других металлов, таких как кобальт, марганец и медь в одну экспериментальную стадию с высоким выходом практически монодисперсной фракции наночастиц в интервале размеров в пределах 8-30 нм. Магнитные частицы структуры ядро@оболочка. С целью создания магнитных частиц с поверхностью, позволяющей проводить их быструю и селективную модификацию, было успешно разработано два способа создания гибридных частиц, содержащих магнитное ядро и оболочку: 1) покрытие оксидом кремния и полисилоксанами и 2) слоем металлического золота. Полимерные частицы. Частицы различного состава (на основе таких полимеров, как полистирол, полималеиновый ангидрид) были приготовлены эмульсионным методом. Основной фокус синтеза был сделан на создании частиц, содержащих одно или несколько магнитных ядер в структуре частицы для обеспечения ее мультимодальности. На следующем этапе исследования было проведено изучение коллоидно-химических свойств центральных частиц и проверена эффективность ковалентного связывания с различными модельными рецепторами. Штамм бактерии Acinetobacter baumannii был выбран для создания модельной системы ввиду того, что он является одним из наиболее значимых возбудителей внутрибольничных инфекций, который характеризуется природной резистентностью ко многим антибиотикам. Использование специфических фаговых деполимераз было выбрано как эффективный подход для идентификации бактериальных клеток A. baumannii и формируемых ими биопленок. Ферменты, сохранившие активность и хорошо проявившие себя при изучении сорбции на твердой поверхности биочипа методом спектрально-корреляционной интерферометрии, были далее использованы для разработки методов иммобилизации биолигандов на поверхность наночастиц различной природы. Была исследована возможность функционализации золотых наночастиц деполимеразой, высокоспецифичной к штаммам A. baumannii, а также другими неспецифичными к данному штамму белками. Также были получены конъюгаты на основе наночастиц различной природы и осуществлен предварительный выбор нескольких лучших конъюгатов. Исследования показали, что золотые наночастицы являются отличной моделью для изучения базовых процессов специфического взаимодействия биофункционализированных (в том числе деполимеразами) наночастиц с различными бактериальными моделями. В тоже время, использование магнитных наночастиц с ковалентной иммобилизацией биолигандов является хорошей основой для дальнейших экспериментов по построению «умных» анти-бактериальных агентов. Был проведен выбор удобной и безопасной бактериальной модели для разработки методов изучения специфичности полученных конъюгатов, а также проведено тестирование различных методов детекции сигнала. Для более подробного изучения специфичности иммобилизованных деполимераз и отработки методов регистрации их активности, нами были изучены системы, содержащие A.Baumannii и E.coli как кандидаты на модельные бактериальные системы. Для проверки активности иммобилизованной фаговой деполимеразы была исследована модифицированная версия классического бактериологического метода с использованием культуральных чашек Петри и оригинального оптического метода детектирования взаимодействия плазмонных (золотых) наночастиц с бактериальными капсулами. На основе полученных данных нам удалось показать сохранение деполимеразной активности и специфичности фермента, сорбированного на поверхность наночастиц различной природы. Кроме описанных выше методов, в рамках проекта нами было также изучено применение альтернативного метода регистрации таких взаимодействий с участием магнитных наночастиц при помощи оригинального метода магнитометрии (MPQ – magnetic particle quantification) на комбинаторных частотах, разработанный с участием членов коллектива данного Проекта. Было продемонстрировано, что комбинация количественного метода MPQ и методом магнитной резонансной томографии (МРТ) может дать адекватное представление о процессах взаимодействия наночастиц с органами и тканями живого организма, а также оценить их фармакокинетические параметры. Существенная часть данных, полученных в ходе выполнения проекта по MPQ изучению поведения были опубликованы в Q1 журнале (Zelepukin I.V. et al. (2018). Nanotechnology, 30 105101, IF=3.404, https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1361-6528/aafa3a/meta). Таким образом, анализ полученных данных показывает возможность иммобилизации фаговых деполимераз на поверхность наночастиц с сохранением специфичности узнавания капсул определенных штаммов антибиотик-резистентных бактерий. Такое распознавание может иметь не только диагностическую значимость, но и терапевтическое применение, поскольку деполимеразы сохраняют свою ферментативную активность и могут быть использованы для не только для диагностики, но и снятия защитной пленки бактерий.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках второго года проекта были полностью выполнены обязательства по публикационной активности (3 публикации, из них две – в журналах Q1 по версии Scimago) и успешно завершены исследования по созданию и предварительному тестированию простейшей «умной» лиганд-зависимой антибактериальной наноструктуры, чувствительной к одному модельному лиганду. Для этого в первую очередь были подобраны оптимальные физические и биологические методы исследования для изучения взаимодействия разработанных в течение первого года активных коньюгатов наночастиц с различными бактериальными культурами. Так, были применены методы проточной визуализирующей цитометрии и оригинальный метод MPQ-цитометрии, которые были использованы для регистрации взаимодействий конъюгатов наночастиц и качественно подтвердили их специфический и обратимый характер. Исследования по изучению стабильности деполимераз на поверхности наночастиц показали, что деполимеразной активностью обладает именно конъюгат за счет иммобилизованных на поверхность молекул этих ферментов. Показана возможность уничтожения биопленки для дальнейшей разработки методов борьбы с антибиотик-резистивными инфекциями. Дополнительно с помощью проточной цитометрии и флуоресцентного иммуноферментного анализа были оценены параметры стабильности различных полимерных покрытий частиц на основе оксидов металлов. На модельной системе была показана эффективность данных методов в исследовании стабильности ряда синтезированных наноконструкций и было показано, что полимерное покрытие на основе полиакриловой кислоты обладает оптимальными свойствами. После тщательного анализа центральных наночастиц, были оптимизированы существующие и разработаны новые эффективные методы синтеза наночастиц малого размера на основе магнетита, гидратированного оксида железа (III) и частиц металлов 11 группы для использования их в качестве экранирующих частиц. Так, был разработан метод создания водорастворимых защитных наночастиц на основе магнетита и ферритов металлов с легкофункционализируемым поверхностным слоем из органического полимера с карбоксильными группами на поверхности. Были оптимизированы методы синтеза малых наночастиц золота и серебра и подобран оптимальные агенты для стабилизации водных растворов этих частиц и обеспечения легкой коньюгации их поверхности с биомолекулами. Были получены частицы серебра и золота, стабилизированные функционализированными N-гетероциклическими карбенами, так же обладающие высокой стабильностью в воде и возможностями для быстрой биомодификации. Дополнительно использование тиозамещенных карбоновых кислот позволило синтезировать водорастворимые частицы сульфида индия серебра, обладающие в добавок к антибактериальной активности соединений серебра люминесцентными свойствами. Затем на основе модельной конструкции «центральная микрочастица – экранирующая наночастица» (связь рецептор-лиганд) были отработаны методы формирования слоя защитных наночастиц для максимального экранирования иммобилизованных биолигандов от взаимодействия со своим молекулярным или клеточным субстратом. Были изучены несколько комбинаций центральная частица/экранирующая частица, используя в качестве критерия степень блокирования активности деполимераз в отношении к бактериям с использованием модельного входного лиганда. Было показано, что разработанные методы экранирования деполимераз проявили сравнимую эффективность и могут быть использованы для дальнейшего построения на их основе «умных» анти-бактериальных систем. Далее была проведена проверка функционирования наноразмерных конструкций, способных реагировать на содержание модельных малых молекул. Были установлены ключевые параметры функционирования наноконструкций. В условиях in vitro и in vivo было изучено поведение отдельных элементов наноконструкций, в т.ч. по таким параметрам как время циркуляции в организме и их биораспределение по органам, а также по их неспецифической токсичности. В частности, была исследована неспецифическая токсичность наночастиц гематита различной формы и состава как in vitro (с использованием МТТ-теста, визуализирующей проточной цитометри и флуоресцентной микроскопии), так и in vivo в мышах с использованием биохимического анализа крови. В результате было показано, что допирование небольшим количеством тяжелого металла не влияет на токсичность центральных наночастиц из гематита, однако следует контролировать геометрическую форму частиц, которая может вызвать их токсичность. Наконец, с помощью in vivo магнитной резонансной томографии было показано увеличение контрастирующих свойств центральных наночастиц на основе гематита с введением в них небольшого количества европия как допирующего элемента. С помощью оптической флуоресцентной томографии было проанализировано биораспределение in vivo в организме мыши частиц гематита, меченого флуоресцентным красителем. В заключении, поведение наночастиц, составляющих наноструктуры, было изучено путем оценки параметров выведения магнитных частиц с различной природой поверхностного покрытия из кровотока лабораторных животных при помощи метода MPQ.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках заключительного года реализации проекта полностью выполнены обязательства по публикационной активности (1 публикация в журналах Q1 по версии Scimago) и успешно завершены исследования по созданию «умной» наноструктуры для распознавания бактериальных мишеней под управлением нескольких низкомолекулярных модельных лигандов. Уточнены и оптимизированы ряд параметров, ответственные на чувствительность и четкость переключения аффинности наноструктур, а также разработаны количественные и полуколичественные методы регистрации этих параметров. Для пяти различных иммобилизованных на наночастицы деполимераз статистически подтверждены данные по скорости протекании акта первичного узнавания полисахаридов бактериальной стенки и его последующего разрушения в течение относительного короткого времени. Показана возможность создания «умных» переключающихся наноструктур, связывающихся с бактериальными клетками при появлении в их микроокружении специфических модельных лигандов. Проведена оценка чувствительности бактериального таргетинга под управлением модельных лигандов. Отмечена высокая специфичность таргетинга как в отношении «разбирающих» лиганодов, так и по отношению к целевому бактериальному штамму. Продемонстрирована возможность создания мультиспецифичных наноструктур путем совместной иммобилизации коктейля из нескольких деполимераз различной специфичности, а также лиганд-чувствительных агентов, способных к избирательному «переключаемому» таргетингу бактериальных штаммов в зависимости от появления того или иного лиганда. Показана возможность дальнейшего усиления бактерицидного действия «умных» лиганд-чувствительных наноструктур на основе деполимераз за счет введения в их состав дополнительных антибактериальных препаратов (например, наночастиц серебра) с последующим модулированием их высвобождения под действием внешних химических факторов.