КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-73-10102

НазваниеРазработка «умных» тераностических наноагентов в качестве перспективных средств борьбы с антибиотико-резистентными возбудителями бактериальных инфекций

РуководительКолычев Евгений Леонидович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)", Московская обл

Срок выполнения при поддержке РНФ07.2018 - 06.2021

КонкурсКонкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 03 - Химия и науки о материалах, 03-405 - Наноструктуры и кластеры. Супрамолекулярная химия. Коллоидные системы.

Ключевые словатераностика; антибиотико-резистентные бактерии; умные материалы, наночастицы, лиганд-чувствительные наносистемы; бактериофаги; противообрастающие (anti-fouling) покрытия; N-гетероциклические карбены

Код ГРНТИ31.15.37


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проблема распространения антибиотико-резистентных форм бактериальных инфекций является одной из важнейших для современного здравоохранения и с каждым годом приобретает все большую медицинскую и социальную значимость. Во многих странах наблюдается рост инфекционной заболеваемости в стационарах лечебных учреждений, что существенным образом связано с распространением штаммов микроорганизмов, устойчивых к различным антибактериальным препаратам. Для возбудителей таких инфекций характерны резистентность к большинству доступных на сегодняшний день антибиотиков, устойчивость к дезинфицирующим средствам и антисептикам, толерантность к детергентам, ультрафиолетовому облучению и высушиванию, которые достигаются путем образования высокоустойчивых биопленок на различных биотических и абиотических поверхностях. В связи с этим данные возбудители широко распространены в условиях, например, больничной среды и трудно поддаются уничтожению, что способствует их передаче через медицинский персонал или предметы обихода. Несмотря на очевидный подъем интереса к исследованию новых способов борьбы с резистентными бактериальными инфекциями, например, с использованием природных врагов бактерий – бактериофагов и их высокоспецифичных и эффективных литических ферментов, остается круг нерешенных проблем, затрудняющих их использование в качестве лекарственных средств. В связи с этим, поиск комбинированных решений, синергично объединяющих лучшие черты сразу нескольких подходов, является наиболее оправданным. Такой комплексной платформой могут быть терапевтические наноагенты. Данный проект направлен на создание «умных» наноструктур (от англ. smart nanostructures), которые могли бы не только объединить в единое целое высокоспецифичные распознающие биорецепторы и эффективные антибактериальные агенты, но и, что очень важно, получили бы фундаментально новый функционал. А именно, предлагаемый подход позволил бы существенно повысить точность и специфичность распознавания биологических мишеней за счет анализа одновременно целой совокупности различных по своей природе параметров. В рамках данного проекта будет разработана возможность анализа как поверхностных маркеров бактерий, так и растворимых соединений локальной среды (метаболитов и других соединений). Подобные системы могли бы занять центральное место при создании высокоселективных лекарств нового поколения, способных одновременно анализировать большое количество данных для точного нахождения мишени и ее точного, но безопасного для нормальных клеток, поражения. Кроме того, использование наноструктур в качестве средств борьбы с бактериальными возбудителями дает практически уникальные возможности их высокоэффективного уничтожения за счет сообщения наноструктурам дополнительных функциональных свойств, например, за счет введения в наночастицы магнитных, светочувствительных и других агентов, способных к физическому воздействию на мишень. В сочетании с вышеописанным механизмом специфического узнавания бактериальной мишени, такие функциональные наноструктуры могли бы повышать эффективность уничтожения бактерий, например, путем гипертермии под действием высокочастотного магнитного поля или генерации синглетного кислорода. Для достижения этой крайне перспективной, но сложной мультидисциплинарной цели, необходимо решить ряд следующих проблем. Первой задачей является создание наноагентов, обладающих специфичностью к различным бактериям и способных транспортировать ряд антибактериальных препаратов (например, антибиотики, антимикробные пептиды, литические ферменты, эндолизины и наночастицы). В рамках проекта, в качестве распознающих компонентов предлагается использовать различные биолиганды, в том числе высокоспецифичные деполимеразы, взаимодействующие строго с определенными бактериями. Для обеспечения высокой селективности связывания с бактериальными мишенями и низкого уровня неспецифических взаимодействий с факторами физиологического окружения, состав, структура и коллоидно-химические свойства наноагентов будут реализованы с использованием богатого опыта коллектива исполнителей Проекта и, в частности, его руководителя – Колычева Е.Л. (4 публикации в JACS, IF=13.858) в области современных методов синтетической органической и металлорганической химии, в том числе на основе химии N-гетероциклических карбенов, путем использования самоорганизующихся полимерных слоев с противообрастающими (anti-fouling) свойствами, с применением методов «безмедной» клик-химии, высоко-ориентированных функциональных слоев и т.д. Для решения второй задачи – создания системы анализа локального окружения вокруг наноагента и управления его связыванием с бактериальными мишенями – предлагается использовать инновационный биокомпьютинговый подход, позволяющий создавать наноконструкции, способные выполнять математические вычисления с помощью биомолекул. Фундаментальные основы данного подхода были разработаны в Лаборатории Нанобиотехнологий МФТИ – одним из пионеров этого направления (M.P. Nikitin, et al. Nature nanotechnology. – 2014. – Т. 9. – №. 9. – С. 716-722). Лаборатория является одним из признанных мировых лидеров в области нанобиотехнологий, что подтверждается различными наградами (М.П.Никитин – премия Президента в области науки и инноваций для молодых учёных за 2017 год; второе место из более чем 2400 работ из 50 стран мира в финале международного конкурса молодых инноваторов Falling Walls Lab, Берлин, 2016; К.Г. Шевченко и М.П. Никитин с соавторами – вторая награда Biosensors & Bioelectronics Award 2016, Гетеборг, Швеция). В качестве практической реализации данной концепции в применении к созданию систем для борьбы с антибиотико-резистентными бактериальными инфекциями, предлагается создать лиганд-чувствительные супрамолекулярные вычислительные конструкции, способные анализировать концентрационный профиль различных водорастворимых маркеров (моделирующих клеточные метаболиты) согласно законам булевой логики и «разрешать» связывание с бактерией только в случае правильного профиля маркеров. Такой подход поможет сделать наноконструкции намного более селективными и управляемыми. Для реализации данного конкретного клинически значимого применения концепции биокомпьютинга, в рамках настоящего Проекта в Лаборатории нанобиотехнологий МФТИ будет создана отдельная научная группа молодых ученых. Ее руководителем будет молодой специалист в области синтеза и модификации органических и металлоорганических соединений, к.х.н. Колычев Евгений Леонидович, уже получивший мировое признание благодаря ряду работ в высокорейтинговых научных журналах (4 статьи в JACS, премия Европейского Союза Marie Curie Intraeuropean (Оксфорд, Великобритания, 2014)). Опыт и знания в области синтетической химии руководителя Проекта далее будут дополнены компетенциями других сотрудников Проекта, обладающих высокой квалификацией и опытом решения подобных мультидисциплинарных проблем, в том числе в области нанотехнологий (к.ф.-м.н. Никитин М.П.), биологии (Шевченко К.Г.) и микробиологии бактериофагов (к.б.н. Попова А.В.), что создает безусловно высокие шансы на успешную реализацию поставленной сложной и многоплановой задачи. Кроме того, поддержка данного Проекта со стороны Фонда оказала бы крайне своевременный вклад в сохранение лидирующих позиций коллектива на международной арене, а также создала бы предпосылки для демонстрации реального применения умных материалов, развитие которых на данный момент носит скорее фундаментальный, а не прикладной характер.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будет сделан существенный шаг в решении глобальной проблемы борьбы с антибиотико-резистентными возбудителями бактериальных инфекций путем создания принципиально нового подхода, основанного на использовании тераностических наноструктур, способных самостоятельно, точно и специфично идентифицировать бактериальную мишень и принимать решение о ее наиболее эффективном уничтожении. На пути к решению этой сложной мультидисциплинарной проблемы необходимо решить ряд сложнейших задач, и первый шаг в этом направлении – получение наноконструкций, специфичность которых к определенным бактериальным штаммам можно регулировать наличием заданных молекулярных маркеров – будет сделан в рамках настоящего проекта. В ходе его выполнения будут созданы наноконструкции на основе специально синтезированных наночастиц и высокоспецифичных биомолекул, благодаря которым они будут способны связываться с бактериями или образованными ими биопленками и, таким образом, проводить их идентификацию. Далее, конструкция таких структур будет усовершенствована за счет придания им способности «включать» и «выключать» умение связываться с бактериальными мишенями. Триггером такого переключения будет служить наличие определенных малых молекул, моделирующих, например, продукты жизнедеятельности бактерий, что в перспективе позволит проводить дополнительную селекцию бактериальных мишеней по их метаболитам. Реализация таких функций данной наноконструкцией не только позволит более точно идентифицировать бактериальные мишени, но и в перспективе запускать по такому же механизму различные эффективные процессы элиминирования бактерий только в случае их идентификации, а также переключаться между мишенями в зависимости от факторов внешней среды. По мнению авторов, пошаговое решение подобных задач поможет создать принципиально новый подход к борьбе с антибиотико-резистентными бактериальными возбудителями, а также заложить основу для решения других практических биомедицинских задач, имеющих высокую социальную значимость.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В результате первого года работы по Проекту были разработаны подходы к созданию моноспецифических наноконструкций, узнающих заданную молекулярную мишень на поверхности модельных бактериальных клеток. Для этого в первую очередь был проведен отбор и синтез подходящих под цели проекта центральных микрочастиц с оптимальными коллоидно-химическими свойствами. Наночастицы были отобраны исходя из анализа опубликованной литературы на сновании таких критериев как биосовместимость, инертность и мультимодальность. Все синтезированные частицы и частицы, полученные из коммерческих источников, были охарактеризованы современными физическими и физико-химическими методами анализа. Были выбраны и синтезированы следующие типы частиц: Наночастицы гидратированного оксида железа (III). Был разработан новый метод синтеза кубических частиц гидратированного оксида железа (III) исходя из широкодоступных исходных соединений (хлорид железа (III), аммиак, азотная кислота). Показано, что их покрытие с использованием карбоксиметилдекстрана приводит к подавлению неспецифических взаимодействий с белками сыворотки крови такими как альбумин. Магнитные монодисперсные наночастицы различной природы. Был разработан эффективный метод получения различных по природе и размеру суперпарамагнитных наночастиц. Новый метод обладает универсальностью и позволяет синтезировать как частицы магнетита, так и ферриты других металлов, таких как кобальт, марганец и медь в одну экспериментальную стадию с высоким выходом практически монодисперсной фракции наночастиц в интервале размеров в пределах 8-30 нм. Магнитные частицы структуры ядро@оболочка. С целью создания магнитных частиц с поверхностью, позволяющей проводить их быструю и селективную модификацию, было успешно разработано два способа создания гибридных частиц, содержащих магнитное ядро и оболочку: 1) покрытие оксидом кремния и полисилоксанами и 2) слоем металлического золота. Полимерные частицы. Частицы различного состава (на основе таких полимеров, как полистирол, полималеиновый ангидрид) были приготовлены эмульсионным методом. Основной фокус синтеза был сделан на создании частиц, содержащих одно или несколько магнитных ядер в структуре частицы для обеспечения ее мультимодальности. На следующем этапе исследования было проведено изучение коллоидно-химических свойств центральных частиц и проверена эффективность ковалентного связывания с различными модельными рецепторами. Штамм бактерии Acinetobacter baumannii был выбран для создания модельной системы ввиду того, что он является одним из наиболее значимых возбудителей внутрибольничных инфекций, который характеризуется природной резистентностью ко многим антибиотикам. Использование специфических фаговых деполимераз было выбрано как эффективный подход для идентификации бактериальных клеток A. baumannii и формируемых ими биопленок. Ферменты, сохранившие активность и хорошо проявившие себя при изучении сорбции на твердой поверхности биочипа методом спектрально-корреляционной интерферометрии, были далее использованы для разработки методов иммобилизации биолигандов на поверхность наночастиц различной природы. Была исследована возможность функционализации золотых наночастиц деполимеразой, высокоспецифичной к штаммам A. baumannii, а также другими неспецифичными к данному штамму белками. Также были получены конъюгаты на основе наночастиц различной природы и осуществлен предварительный выбор нескольких лучших конъюгатов. Исследования показали, что золотые наночастицы являются отличной моделью для изучения базовых процессов специфического взаимодействия биофункционализированных (в том числе деполимеразами) наночастиц с различными бактериальными моделями. В тоже время, использование магнитных наночастиц с ковалентной иммобилизацией биолигандов является хорошей основой для дальнейших экспериментов по построению «умных» анти-бактериальных агентов. Был проведен выбор удобной и безопасной бактериальной модели для разработки методов изучения специфичности полученных конъюгатов, а также проведено тестирование различных методов детекции сигнала. Для более подробного изучения специфичности иммобилизованных деполимераз и отработки методов регистрации их активности, нами были изучены системы, содержащие A.Baumannii и E.coli как кандидаты на модельные бактериальные системы. Для проверки активности иммобилизованной фаговой деполимеразы была исследована модифицированная версия классического бактериологического метода с использованием культуральных чашек Петри и оригинального оптического метода детектирования взаимодействия плазмонных (золотых) наночастиц с бактериальными капсулами. На основе полученных данных нам удалось показать сохранение деполимеразной активности и специфичности фермента, сорбированного на поверхность наночастиц различной природы. Кроме описанных выше методов, в рамках проекта нами было также изучено применение альтернативного метода регистрации таких взаимодействий с участием магнитных наночастиц при помощи оригинального метода магнитометрии (MPQ – magnetic particle quantification) на комбинаторных частотах, разработанный с участием членов коллектива данного Проекта. Было продемонстрировано, что комбинация количественного метода MPQ и методом магнитной резонансной томографии (МРТ) может дать адекватное представление о процессах взаимодействия наночастиц с органами и тканями живого организма, а также оценить их фармакокинетические параметры. Существенная часть данных, полученных в ходе выполнения проекта по MPQ изучению поведения были опубликованы в Q1 журнале (Zelepukin I.V. et al. (2018). Nanotechnology, 30 105101, IF=3.404, https://iopscience.iop.org/article/10.1088/1361-6528/aafa3a/meta). Таким образом, анализ полученных данных показывает возможность иммобилизации фаговых деполимераз на поверхность наночастиц с сохранением специфичности узнавания капсул определенных штаммов антибиотик-резистентных бактерий. Такое распознавание может иметь не только диагностическую значимость, но и терапевтическое применение, поскольку деполимеразы сохраняют свою ферментативную активность и могут быть использованы для не только для диагностики, но и снятия защитной пленки бактерий.

 

Публикации

1. Зелепукин И.В., Яременко А.В., Петерсен Е.В., Деев С.М., Черкасов В.Р., Никитин П.И., Никитин М.П. Magnetometry based method for investigation of nanoparticle clearance from circulation in a liver perfusion model NANOTECHNOLOGY, Том: 30, выпуск: 10, номер статьи: 105101 (8pp). (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках второго года проекта были полностью выполнены обязательства по публикационной активности (3 публикации, из них две – в журналах Q1 по версии Scimago) и успешно завершены исследования по созданию и предварительному тестированию простейшей «умной» лиганд-зависимой антибактериальной наноструктуры, чувствительной к одному модельному лиганду. Для этого в первую очередь были подобраны оптимальные физические и биологические методы исследования для изучения взаимодействия разработанных в течение первого года активных коньюгатов наночастиц с различными бактериальными культурами. Так, были применены методы проточной визуализирующей цитометрии и оригинальный метод MPQ-цитометрии, которые были использованы для регистрации взаимодействий конъюгатов наночастиц и качественно подтвердили их специфический и обратимый характер. Исследования по изучению стабильности деполимераз на поверхности наночастиц показали, что деполимеразной активностью обладает именно конъюгат за счет иммобилизованных на поверхность молекул этих ферментов. Показана возможность уничтожения биопленки для дальнейшей разработки методов борьбы с антибиотик-резистивными инфекциями. Дополнительно с помощью проточной цитометрии и флуоресцентного иммуноферментного анализа были оценены параметры стабильности различных полимерных покрытий частиц на основе оксидов металлов. На модельной системе была показана эффективность данных методов в исследовании стабильности ряда синтезированных наноконструкций и было показано, что полимерное покрытие на основе полиакриловой кислоты обладает оптимальными свойствами. После тщательного анализа центральных наночастиц, были оптимизированы существующие и разработаны новые эффективные методы синтеза наночастиц малого размера на основе магнетита, гидратированного оксида железа (III) и частиц металлов 11 группы для использования их в качестве экранирующих частиц. Так, был разработан метод создания водорастворимых защитных наночастиц на основе магнетита и ферритов металлов с легкофункционализируемым поверхностным слоем из органического полимера с карбоксильными группами на поверхности. Были оптимизированы методы синтеза малых наночастиц золота и серебра и подобран оптимальные агенты для стабилизации водных растворов этих частиц и обеспечения легкой коньюгации их поверхности с биомолекулами. Были получены частицы серебра и золота, стабилизированные функционализированными N-гетероциклическими карбенами, так же обладающие высокой стабильностью в воде и возможностями для быстрой биомодификации. Дополнительно использование тиозамещенных карбоновых кислот позволило синтезировать водорастворимые частицы сульфида индия серебра, обладающие в добавок к антибактериальной активности соединений серебра люминесцентными свойствами. Затем на основе модельной конструкции «центральная микрочастица – экранирующая наночастица» (связь рецептор-лиганд) были отработаны методы формирования слоя защитных наночастиц для максимального экранирования иммобилизованных биолигандов от взаимодействия со своим молекулярным или клеточным субстратом. Были изучены несколько комбинаций центральная частица/экранирующая частица, используя в качестве критерия степень блокирования активности деполимераз в отношении к бактериям с использованием модельного входного лиганда. Было показано, что разработанные методы экранирования деполимераз проявили сравнимую эффективность и могут быть использованы для дальнейшего построения на их основе «умных» анти-бактериальных систем. Далее была проведена проверка функционирования наноразмерных конструкций, способных реагировать на содержание модельных малых молекул. Были установлены ключевые параметры функционирования наноконструкций. В условиях in vitro и in vivo было изучено поведение отдельных элементов наноконструкций, в т.ч. по таким параметрам как время циркуляции в организме и их биораспределение по органам, а также по их неспецифической токсичности. В частности, была исследована неспецифическая токсичность наночастиц гематита различной формы и состава как in vitro (с использованием МТТ-теста, визуализирующей проточной цитометри и флуоресцентной микроскопии), так и in vivo в мышах с использованием биохимического анализа крови. В результате было показано, что допирование небольшим количеством тяжелого металла не влияет на токсичность центральных наночастиц из гематита, однако следует контролировать геометрическую форму частиц, которая может вызвать их токсичность. Наконец, с помощью in vivo магнитной резонансной томографии было показано увеличение контрастирующих свойств центральных наночастиц на основе гематита с введением в них небольшого количества европия как допирующего элемента. С помощью оптической флуоресцентной томографии было проанализировано биораспределение in vivo в организме мыши частиц гематита, меченого флуоресцентным красителем. В заключении, поведение наночастиц, составляющих наноструктуры, было изучено путем оценки параметров выведения магнитных частиц с различной природой поверхностного покрытия из кровотока лабораторных животных при помощи метода MPQ.

 

Публикации

1. Лунин А.В., Лизунова А.А., Мочалова Е.Н., Яковцева М.Н., Черкасов В.Р., Никитин М.П., Колычев Е.Л. Hematite Nanoparticles from Unexpected Reaction of Ferrihydrite with Concentrated Acids for Biomedical Applications Molecules, 25(8), 1984 (год публикации - 2020).

2. Лунин А.В., Соколов И.Л., Зелепукин И.В., Зубарев И.В., Яковцева М.Н., Мочалова Е.Н., Розенберг Ю.М., Никитин М.П., Колычев Е.Л. Spindle-like MRI-active europium-doped iron oxide nanoparticles with shape-induced cytotoxicity from simple and facile ferrihydrite crystallization procedure RSC Advances, Vol. 10, pp. 7301-7312 (год публикации - 2020).

3. Рынгач А.С., Шевченко К.Г., Черкасов В.Р., Колычев Е.Л. MIL-100 coated nanoparticles as a potential tool for in vitro delivery of therapeutic agents Cell Death Discovery, Vol. 6, suppl. 1, p. 16, RPC 29 (год публикации - 2020).