Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Проект направлен на создание новых наноматериалов биомедицинского назначения на основе оксида вольфрама(VI). Основной фундаментальной задачей проекта является разработка наноматериалов на основе оксида вольфрама, в том числе гибридных органо-неорганических материалов, в качестве потенциальных тераностических агентов для диагностики и терапии социально-значимых заболеваний, включая онкологические заболевания, а также антибактериальных препаратов широкого спектра действия. Этап 2018–2019 гг направлен на разработку методов получения нанодисперсного оксида вольфрама с заданными свойствами, его композитов с наноцеллюлозой, а также на оценку биологической активности WO3 (in vitro). В ходе выполнения этапа 2018–2019 гг были получены следующие основные результаты: 1. Синтез водных золей нанодисперсного оксида вольфрама(VI) Осуществлен синтез агрегативно устойчивых золей нанокристаллического оксида вольфрама с размером частиц в диапазоне 70–160 нм методом термолиза B-паравольфрамата аммония с последующим диспергированием агрегированных кристаллических частиц WO3 в воде с использованием мощной ультразвуковой обработки. Проведен детальный анализ закономерностей термолиза B-паравольфрамата аммония в диапазоне температур до 1000С и показано, что в зависимости от температуры его термического отжига могут быть получены однофазные порошки орторомбического (-WO3) или моноклинного (-WO3) триоксида вольфрама. Установлено, что высокая эффективность диспергирования агрегатов WO3 в условиях ультразвуковой обработки обусловлена их пористостью, достигающей 50%. Агрегативная устойчивость золей кристаллического WO3 обеспечивается высоким отрицательным значением -потенциала его частиц. Высокое значение -потенциала обусловлено образованием и диссоциацией вольфрамовой кислоты в поверхностном слое частиц WO3 при их контакте с водной фазой. В присутствии электролитов золи быстро теряют агрегативную устойчивость, при этом стабилизация неионогенными полимерами (декстран, поливиниловый спирт, целлюлоза, поливинилпирролидон, полиэтиленгликоль) незначительно увеличивает агрегативную устойчивость золей при добавлении электролитов. Синтезированы стабильные водные воли нанодисперсного оксида вольфрама методом катионитной обработки водных растворов вольфрамата натрия с последующей гидротермальной обработкой полученных дисперсий вольфрамовой кислоты в присутствии поливинилпирролидона. Показано, что полученные золи характеризуются ультрамалым размером частиц (около 1 нм по данным просвечивающей электронной микроскопии). Установлено, что полученные водные золи нанодисперсного WO3 характеризуются выраженными обратимыми фотохромными свойствами. В то же время, фотохромные характеристики таких золей достаточно быстро (в течение 10 циклов освещения / регенерации) деградируют, что отражается в снижении интенсивности их окраски при облучении УФ-светом. Полученные водные золи оксида вольфрама характеризуются крайне высокой агрегативной устойчивостью (не менее полугода). 2. Анализ термодинамических характеристик процессов фазовых переходов в нанокристаллическом триоксиде вольфрама при температурах до 950С Проведен детальный анализ термодинамических величин (C_p^0 (T), S^0 (T), Φ^0 (T), ΔH^0 (T)) и параметров фазовых превращений (T, ΔH^0) WO3 в широком диапазоне температур, от 80 K до 1200 K, с использованием методов дифференциальной сканирующей калориметрии и адиабатической калориметрии. Впервые определена зависимость удельной теплоемкости (Cp) WO3 от температуры в диапазоне (80–1200 K) и проведено уточнение имеющихся в литературе данных, в первую очередь в диапазоне 80–350 K, для которого указанная зависимость ранее была определена неверно. Проведена аппроксимация зависимости теплоемкости WO3 от температуры уравнением Майера-Келли и определены его коэффициенты для диапазонов температур 316–601; 601–1051; 1051–1176; 1176–1276 K, отвечающих существованию однофазного WO3. Зафиксировано наличие дополнительного, не описанного в литературе фазового превращения WO3 в диапазоне температур 720–800С, отвечающего, по литературным данным, единственному фазовому переходу. Выполнен детальный анализ изменений кристаллической структуры WO3 в диапазоне температур 25–950С методом высокотемпературной порошковой рентгеновской дифракции, позволившие впервые идентифицировать рефлексы, относящиеся к неописанной ранее фазе WO3, формирующейся при его превращении из орторомбической модификации в тетрагональную. Определены значения коэффициентов термического расширения кристаллического WO3 в диапазонах температур 373–523 K, 583–873 K, 1043–1093 K. Подтверждено, что в диапазоне температур 845…910С в структуре WO3 происходит фазовый переход, сопровождающийся превращению тетрагональной модификации в другую тетрагональную модификацию. 3. Синтез новых гибридных органо-неорганических материалов в виде пленок на основе наноцеллюлозы и нанодисперсного оксида вольфрама Разработана синтетическая стратегия, обеспечивающая получение композитных материалов на основе WO3 с улучшенными фотохромными свойствами, основанная на модифицировании наночастиц оксида вольфрама одновременно двумя видами полимеров – поливинилпирролидоном и целлюлозой. Создана простая и масштабируемая методика получения гибридных органо-неорганических нанокомпозитов в виде пленок на основе стабильных водных суспензий нанокристаллической целлюлозы и водных золей оксида вольфрама. Впервые получены оптически прозрачные пленки наноцеллюлозы, модифицированные наночастицами триоксида вольфрама, демонстрирующие выраженный, стабильный и обратимый фотохромизм. Показано, что полученные пленки сохраняют высокую фотохромную активность после длительного (6 месяцев) хранения, при этом их свойства могут быть полностью восстановлены выдерживанием во влажной атмосфере. Показана высокая однородность распределения наночастиц оксида вольфрама в полученных композитах, а также их высокая концентрация (от 4 мас.%). В соответствии с развиваемой нами концепцией, полученные результаты представляют интерес для создания фотоактивных нанокомпозитов, в которых комбинируются нетоксичные, экологически безопасные и биосовместимые пленки наноцеллюлозы и фотоактивные наночастицы триоксида вольфрама, перспективные в качестве антибактериальных покрытий. Пленки нанокристаллической целлюлозы получены с помощью оригинального двухстадийного метода, основанного на растворении целлюлозного сырья в растворе комплексного аммиаката меди, с последующей регенерацией посредством кислотного гидролиза (c применением 20% H2SO4 при 70°C в течение 1 ч). Существенным преимуществом данного подхода является использование слабоконцентрированной серной кислоты на завершающем этапе получения наночастиц целлюлозы по сравнению с традиционными методами, основанными на применении многостадийной предварительной обработки исходного сырья концентрированными растворами H2SO4 (60–65 масс.%). Показано, что пленки наноцеллюлозы, в том числе модифицированные оксидом вольфрама проявляют высокую термостабильность (до 200С), что достаточно для проведения процедур стерилизации материалов при их биомедицинском применении. 4. Комплексный анализ токсичности наноматериалов на основе оксида вольфрама Проведен комплексный анализ токсичности наночастиц оксида вольфрама, полученных различными методами, по отношению к различным клеточным культурам, прежде всего к нормальным и малигнизованным клеткам. Высококристаллические наночастицы оксида вольфрама с размером частиц > 60 нм, полученные термическим разложением паравольфрамата аммония, нетоксичны по отношению к мезенхимальным стволовым клеткам (МСК) и клеткам культуры рака молочной железы (MCF-7). В присутствии таких наночастиц WO3 не происходила гибель клеток в диапазоне концентраций (от 0.2 до 200 мкг/мл), при этом лишь незначительно снижалась метаболическая активность клеток. Низкая токсичность стабилизированного декстраном золя WO3 для нормальных (стволовых) и малигнизованных клеток делает этот препарат перспективным рентгеноконтрасным материалом. Показано, что нанодисперсный оксид вольфрама, стабилизированный поливинилпирролидоном и полученный методом катионного обмена с последующей гидротермальной обработкой, проявляет зависимый от дозы и времени культивирования ингибирующий эффект по отношению к культуре фибробластов мыши (NCTC L929). Механизм ингибирующего эффекта связан со снижением пролиферативной активности, индукцией сильного окислительного стресса, приводящего к гибели клеток. Золи оксида вольфрама с невысокой концентрацией (5 мг/мл) показали значительное ингибирование пролиферации клеток, тогда как контакт клеток с золями с более высокими концентрациями (10 и 15 мг/мл) приводил к развитию апоптоза и гибели клеток. Контакт клеток с золями оксида вольфрама низких концентраций (менее 2.5 мг/мл) не приводил к повышенной гибели клеток и не оказывал значительного влияния на клеточный метаболизм. Полученные данные указывают на то, что наночастицы WO3 в высоких концентрациях могут оказывать токсическое действие на клетки млекопитающих. Установлено, что нанодисперсный оксид вольфрама, стабилизированный поливинилпирролидоном и полученный методом катионного обмена с последующей гидротермальной обработкой, проявляет высокоселективный цитотоксический эффект по отношению к нормальным и малигнизованным клеткам in vitro. Наши результаты свидетельствуют о том, что наночастицы WO3 способны значительно модулировать экспрессию про- и антиоксидантных генов. Показано, что наночастицы WO3 вызывают гибель клеток остеосаркомы (линия клеток MNNG/HOS), IC50 составляет 5 мг/мл, при этом проявляют лишь незначительную токсичность по отношению к здоровым мезенхимальным стволовым клеткам человека (МСК). Механизм гибели клеток в присутствии наночастиц WO3 связан с развитием внутриклеточного окислительного стресса, который приводит к апоптозу. Селективное действие наночастиц WO3 по отношению к здоровым и малигнизованным клеткам обусловлено различной активностью наночастиц в процессах генерации активных форм кислорода, что приводит в малигнизованных клетках к повышению модуляции уровня экспрессии генов, участвующих в метаболизме активных форм кислорода, дисфункции митохондрий и апоптозе.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект направлен на создание новых наноматериалов биомедицинского назначения на основе оксида вольфрама(VI). Основной фундаментальной задачей проекта является разработка наноматериалов на основе оксида вольфрама, в том числе гибридных органо-неорганических материалов, в качестве потенциальных тераностических агентов для диагностики и терапии социально-значимых заболеваний, включая онкологические заболевания, а также антибактериальных препаратов широкого спектра действия. Этап 2019–2020 гг направлен на синтез композитных материалов на основе оксида вольфрама, анализ их фотокаталитических, сенсорных свойств, а также биологической активности. В ходе выполнения этапа 2019–2020 гг были получены следующие основные результаты: Проведен детальный анализ фотохромных свойств и фотокаталитической активности водных золей WO3. Фотохромные золи WO3@PVP получены методом катионитной обработки, а также подкислением солей вольфрамовых кислот в присутствии поливинилпирролидона. Показано, что присутствие катионов натрия в реакционной системе при синтезе WO3@ПВП способствует образованию восстановленных форм вольфрама (W+5) при УФ-облучении оксида вольфрама, оказывая ключевое влияние на фотохромные и фотокаталитические свойства полученных материалов. Установлена зависимость фотохромных свойств золей оксида вольфрама от концентрации поливинилпирролидона и катионов натрия в коллоидной системе. Показана выраженная фотоиндуцируемая восстановительная активность золей WO3@ПВП в фотокаталитических реакциях с участием красителей метилового оранжевого и кристаллического фиолетового. Благодаря своим восстановительным свойствам в условиях УФ-облучения фотохромные золи оксида вольфрама могут выступать в качестве эффективных фотопротекторов органических соединений. Установлен количественный состав двухфазных смесей полиморфных модификаций WO3, получаемых нагревом -WO3 до температур 730–760С. Установлено, что в данном температурном диапазоне, наряду с тетрагональной модификацией WO3, присутствует моноклинная модификация WO3, кристаллическая решетка которой имеет более низкую симметрию по сравнению с полиморфной модификацией, устойчивой при более низкой температуре (орторомбической). Установлена зависимость параметров элементарной ячейки высокотемпературной моноклинной модификации WO3 от температуры в диапазоне 730–760С. Предложен метод получения материалов на основе триоксида вольфрама с высокой степенью кристалличности, характеризующихся высокими сенсорными свойствами по отношению к диоксиду азота. Метод основан на растворении металлического вольфрама в пероксиде водорода с последующим отжигом полученного пероксосодержащего соединения при 400C. Показано, что сенсорные свойства полученного композита, содержащего -WO3 и h-WO3, находятся на уровне лучших материалов на основе оксидов вольфрама, известных в литературе. Уникальной особенностью полученного нами материала является крайне высокий и воспроизводимый уровень сенсорного отклика при комнатной температуре, примерно в 100 раз превышающий характеристики известных из литературы аналогов. Предложены методы получения нанодисперсного оксида вольфрама, модифицированного анионными и катионными полиэлектролитами, а также композитных полиэлектролитных микрокапсул, модифицированных оксидом вольфрама. Проведена комплексная оценка биосовместимости полученных коллоидных растворов и гибридных материалов на культурах нормальных и трансформированных клеток, исследованы молекулярные механизмы их эндоцитоза и цитотоксичности. Показано, что наночастицы WO3, модифицированные полиэлектролитами, проявляют дозозависимую токсичность к клеточным культурам, что выражается в снижении жизнеспособности и развитии апоптоза, при этом токсичность по отношению к нормальным и трансформированным клеткам значимо различается. Показано, что наибольшей степени загрузки WO3 в полиэлектролитные микрокапсулы можно добиться путем их введения в полость или средний полиэлектролитный слой микрокапсул. Интеграция в полиэлектролитные микрокапсулы фотохромных композитов триоксида вольфрама, модифицированного поливинипирролидоном, оказалась неэффективной вследствие низкого значения -потенциала композитных наночастиц. Проведен комплексный анализ биосовместимости микрокапсул на культурах нормальных и трансформированных клеток, показано что их цитотоксичность носит выраженный дозозависимый характер. Из трех проанализированных клеточных культур (мышиные фибробласты, клетки глиобластомы человека, мезенхимальные стволовые клетки человека) наиболее чувствительной оказалась культура мезенхимальных стволовых клеток. Показано, что все клеточные культуры способны эффективно захватывать полиэлектролитные микрокапсулы, загруженные оксидом вольфрама. Показано, что основным механизмом эндоцитоза полиэлектролитных микрокапсул является макропиноцитоз. Анализ уровня митохондриального потенциала культуры мезенхимальных стволовых клеток показал, что интернализация и механический контакт микрокапсул с клеткой не являются критическим для функционирования клетки. Полученные данные подтверждают перспективность использования полиэлектролитных микрокапсул в качестве эффективной системы доставки наночастиц WO3 в клетки различного типа. Проведен комплексный анализ фотокаталитических и бактерицидных свойств гибридных пленок на основе наноцеллюлозы и наночастиц оксида вольфрама. Показано, что модифицирование гибридных пленок поливиниловым спиртом способствует увеличению времени обратного фотохромного перехода до 5 ч в темновых условиях. Установлено, что полученная гибридная пленка обладает отличными фотокаталитическими свойствами. В частности, под воздействием УФ-облучения пленка эффективно обесцвечивает модельный краситель на 94% за 60 мин, под воздействием облучения видимым светом – на 70% за 40 мин. По результатам исследования бактерицидной активности при помощи диско-диффузионного теста на твердой питательной среде установлено, что гибридные пленки в темновых условиях, а также при активации слабым УФ-облучением в течение 30 мин, не обладают антибактериальной активностью в отношении B. thuringiensis и E. coli. Отсутствие антибактериальной активности композитного наноматериала на твердой питательной среде обусловлено сильным связыванием наночастиц оксида вольфрама с целлюлозной матрицей, что препятствует их высвобождению и последующему взаимодействию с клеточной стенкой для ее разрушения. Результаты исследования антибактериальной активности показали, что гибридный нанокомпозит обладает бактерицидными свойствами в жидкой питательной среде против штамма E. coli, а также антифунгальной активностью в отношении дрожжей S. cerevisiae. Минимальная ингибирующая концентрация наночастиц WO3 в гибридной пленке, которая вызвала задержку роста штамма S. cerevisiae, составила 15 мг/мл. Оценка влияния гибридной пленки на рост тест-культур в жидкой питательной среде показала, что при концентрации 10.0 мг/мл оксида вольфрама в гибридной пленке происходит ингибирование роста E. coli на ~40% через 10 ч культивирования. При двукратном увеличении концентрации наночастиц оксида вольфрама антибактериальная активность пленки возрастает вдвое.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект направлен на создание фундаментальных основ получения новых наноматериалов биомедицинского назначения на основе оксида вольфрама (VI). Основной задачей проекта является разработка наноматериалов на основе оксида вольфрама, в том числе гибридных органо-неорганических материалов, в качестве потенциальных тераностических агентов для диагностики и терапии социально-значимых заболеваний, включая онкологические заболевания, а также антибактериальных препаратов широкого спектра действия. Этап 2020–2021 гг был направлен в первую очередь на анализ биологической активности ряда композитных материалов на основе оксида вольфрама под действием электромагнитного излучения (УФ- и рентгеновского диапазона). В ходе выполнения этапа 2020–2021 гг были получены следующие основные результаты: • Фотохромные коллоидные растворы наночастиц WO3@ПВП при их концентрации не менее 0.5 мг/мл проявляют ярко выраженный фотосенсибилизирующий эффект по отношению к мезенхимальным стволовым клеткам человека и клеткам линии MNNG/Hos в результате кратковременного (10 мин) воздействия УФ-излучения. При концентрации наночастиц выше 0.125 мг/мл в условиях УФ-облучения наблюдается снижение уровня митохондриального потенциала и увеличение уровня активных форм кислорода. При концентрации WO3@ПВП в культуре клеток 1 мг/мл и выше в условиях УФ-облучения наблюдается выраженная конденсация хроматина и разрушение ядерного аппарата, а также практически полное угнетение метаболической и митохондриальной активности. В отсутствие УФ-облучения культура мезенхимальных стволовых клеток человека не показала снижения жизнеспособности, пролиферативной активности, митохондриального потенциала при концентрациях наночастиц WO3@ПВП 0.125–1 мг/мл. Аналогичным образом, внесение в клеточные культуры предварительно обработанных УФ-излучением коллоидных растворов WO3@ПВП не оказывало заметного влияния на метаболическую активность клеток. • Обнаружен выраженный селективный цитотоксический фотосенсибилизирующий эффект при УФ-облучении клеточных культур, культивируемых в присутствии наночастиц WO3@ПВП. В результате УФ-облучения и последующего культивирования клеток наблюдается генотоксическое действие наночастиц WO3@ПВП в отношении трансформированных клеток при концентрациях наночастиц выше 5 мг/мл, что выражается в дефрагментации ядер и нарушении их нативных морфологических характеристик. При этом культура нормальных клеток (МСК человека) проявляет подобные клеточные реакции при концентрациях выше 15 мг/мл. Анализ уровня экспрессии генов после облучения клеточных культур подтверждает данные анализа морфологических и метаболических характеристик клеточных культур в присутствии наночастиц WO3 и показывает активацию сигнальных путей, вовлеченных в развитие окислительного стресса, нарушение клеточного цикла и пролиферативной активности. Молекулярные механизмы биологической активности наночастиц WO3@ПВП, по всей видимости, связаны с их сенсибилизирующим действием в условиях УФ облучения при непосредственном контакте с компонентами культуральной среды (например, белковой фракцией), на поверхности клеток или непосредственно в цитоплазме, что обеспечивает вовлечение биологических молекул в окислительно-восстановительные процессы, протекающие с участием атомов вольфрама. • Установлено, что селективный цитотоксический фотосенсибилизирующий эффект при УФ-облучении клеточных культур, культивируемых в присутствии наночастиц WO3@ПВП, вероятнее всего вызван различной эффективностью эндоцитоза наночастиц раковыми и нормальными клетками – концентрация наночастиц в трансформированных клетках превышает аналогичную величину для нормальных клеток в 2,8 раза (при концентрации внесенных наночастиц 25 мг/мл). • Установлено, что полиэлектролитные микрокапсулы на основе декстрансульфата и поли-L-аргинина, а также полиаллиламина и полистиролсульфоната, содержащие в полости наночастицы WO3@ПВП, эффективно поглощаются как нормальными (МСК человека, фибробласты мыши), так и трансформированными (MCF-7 и Hela) клеточными культурами и, локализуясь в цитоплазме, способны нарушать метаболическую активность клеток через развитие окислительного стресса и механическое воздействие на органоиды клетки. В то же время, высокая концентрация сыворотки (FBS) в культуральной среде приводит к значительной агрегации микрокапсул, что снижает эффективность эндоцитоза микрокапсул клетками. • Полиэлектролитные микрокапсулы (PAH/PSS/PAH/PSS/PAH/PSS), модифицированные наночастицами WO3@ПВП, при введении в клеточные культуры как нормальных, так и трансформированных клеток, не проявляют выраженного фотосенсибилизирующего эффекта. По всей видимости, причиной данного эффекта является физическая изоляция наночастиц от компонент цитоплазмы и клеточных органелл стенками микрокапсул. • Скорость деградации микрокапсул зависит от их состава, при этом микрокапсулы состава PLA/DS/PLA/DS/PLA/DS после эндоцитоза изменяют свою структуру под действием эндогенных ферментов уже через 18–24 ч культивирования. • Наночастицы WO3@ПВП (как в индивидуальном виде, так и в составе полиэлектролитных микрокапсул) не проявляют радиосенсибилизирующих свойств в условиях воздействия рентгеновского излучения дозой до 15 Гр на клеточные культуры МСК человека и MCF-7. Методом усиленной хемилюминесценции установлено, что концентрации пероксида водорода и гидроксильного радикала после облучения водных коллоидных растворов WO3@ПВП с концентрацией 0.06–0.5 мг/мл составляют около 80 и 1.5 нМ, соответственно, что практически не отличается от аналогичных характеристик для дистиллированной воды. Рентгеновское излучение не обеспечивает радиосенсибилизирующего эффекта наночастиц WO3@ПВП и модифицированных такими наночастицами микрокапсул в отношении нормальных и трансформированных клеточных культур. • Получены новые гибридные нанокомпозиты в виде пленок на основе нанокристаллической целлюлозы (CNC) и нанодисперсного оксида вольфрама (WO3@ПВП), включающие в себя полимерный пластификатор (поливиниловый спирт или поливинилпирролидон с различной молекулярной массой). • Проанализирована кинетика и степень высвобождения наночастиц WO3 из композитных пленок на основе целлюлозы и полимерного пластификатора. Показано, что указанные параметры можно в широких пределах варьировать за счет изменения содержания полимерного пластификатора и его молекулярной массы. Профиль высвобождения наночастиц оксида вольфрама из гибридной пленки на основе нанокристаллической целлюлозы и поливинилового спирта (Mw 85 000–124 000 или Mw 146 000–186 000) соответствует динамике контролируемого высвобождения. Наиболее пролонгированным профилем высвобождения обладает гибридная пленка на основе нанокристаллической целлюлозы и WO3@ПВП (5 мас.%) с добавлением поливинилового спирта с молекулярной массой Mw 146 000–186 000 в количестве 15 мас.%. Анализ профилей высвобождения WO3 из гибридных пленок, проведенный с использованием различных математических моделей, показал, что высвобождение WO3 из гибридных пленок, содержащих в составе низкомолекулярный поливинилпирролидон (5–15 мас.%, Mw 55 000), описывается кинетической моделью нулевого порядка, т.е. скорость высвобождения WO3 не зависит от времени и характеризуется «взрывным эффектом». Удовлетворительное описание кинетики высвобождения наночастиц в рамках модели Хигучи (коэффициент корреляции R2 более 0.9) свидетельствует о диффузионном характере высвобождения WO3 из гибридных пленок на основе нанокристаллической целлюлозы и полимерного пластификатора. • Определена минимальная ингибирующая концентрация наночастиц WO3, содержащихся в гибридных пленках на основе нанокристаллической целлюлозы и полимерного пластификатора, в отношении грамотрицательных и грамположительных бактерий. Установлено, что гибридная целлюлозная пленка, модифицированная оксидом вольфрама, проявляет антибактериальную активность против B. thuringiensis var. israelensis 7-1/23 с содержанием WO3 в концентрации 0.25 мг/мл, а против E. coli – в концентрации 1.58 мг/мл. • Анализ цитотоксичности гибридных пленок на основе нанокристаллической целлюлозы и наночастиц оксида вольфрама показал, что после активации УФ-облучением они проявляют токсичность для иммортализованных клеток человека (линия THP-1).