Аннотация результатов, полученных в 2018 году
За отчетный период нами были получены линии мух с репортерными конструкциями egfp-3’UTR cdc42, egfp-3’UTR orb2, линии мух со сплайсирующимися формами 3' UTR apkc. Проведены предварительные эксперименты с линиями мух, содержащими репортерные конструкции egfp- 3' UTR apkc (RA, RC и сплайсирующиеся формы 3’UTR). Оптимизирован протокол для РНК-иммунопреципитации транскриптов, связывающихся с белком Orb2 в клетках центральной нервной системы дрозофилы. Подготовлены пробы для RIP-секвенирования из голов мух с использованием оптимизированного протокола для РНК-иммунопреципитации. Пробы были секвенированы, ведется биоинформатический анализ результатов. Оптимизирован метод иммуноокраски эмбрионов дрозофилы поликлональными антителами к Eve и 3,3′-диаминобензидином. Нами была получена линия мух с делецией 3’ UTR (orb delta 3’ UTR). Обнаружено, что 3' UTR гена orb имеет ключевое значение в оогенезе мух, поскольку самки линии orb delta 3’ UTR были полностью стерильны. Последовательность 3' UTR гена orb необходима для локализации и аккумуляции мРНК и белка Orb в клетке-предшественнике ооцита в гермарии. В линии мух orb delta 3’ UTR не происходило нормальной локализации и аккумуляции мРНК и белка Orb в клетках яичника, и клетки-предшественники ооцита не дифференцировались в ооцит в яичниках мух. Следовательно, последовательность 3' UTR гена orb необходима для дифференцировки ооцита. Введение в мутантную линию orb delta 3’ UTR генетической конструкции с аллелем orb дикого типа полностью восстановило фертильность мух, а также локализацию мРНК и белка Orb в клетках яичников. Мы определили, каким образом делеция 3’ UTR гена orb влияет на распределение основных маркеров ооцита (osk, bicD, Egl, Corolla), а также на цитоскелет микротрубочек в клетках яичника. Нарушение распределения мРНК и белка Orb ведет к нарушению локализации всех проанализированных маркеров ооцита и нарушению цитоскелета в клетках гермария, где должна происходить дифференцировка ооцита в норме у мух дикого типа. Нами получены две линии с неполными фрагментами последовательности orb 3’ UTR (orb-СЕ 3’ UTR и orb-XN 3’ UTR), чтобы определить минимальный набор функциональных сайтов в последовательности, необходимый для нормальной дифференцировки и созреваня ооцитов. В яичниках мух линии orb-СЕ 3’ UTR дифференцировки ооцита не происходило, и мухи этой линии были стерильны, несмотря на то что СЕ содержит сайты цитоплазматического полиаденилирования (СРЕ) для взаимодействия с Orb. В яичниках мух линии orb-XN 3’ UTR происходило частичное спасение мутантного фенотипа. На ранних стадиях оогенеза распределение мРНК и белка Orb было сходно с мутантной линией orb delta 3’ UTR, однако на 2-3 стадиях оогенеза в части яйцевых камер мРНК и белок Orb аккумулировались в одной клетке, сходно с мухами дикого типа, а на 4-7 стадиях в ~50% проанализированных яйцевых камер обнаружен ооцит и 15 питающих клеток. Нами обнаружено, что замедление локализации мРНК и белка Orb задерживает дифференцировку ооцита в яичниках мух линии orb-XN 3’ UTR. Наблюдался замедленный паттерн аккумуляции марекров ооцита (osk, bicD, Egl, Corolla), а также транспортного белка динеина, в клетке-предшественнике ооцита в яйцевых камерах яичников этой линии. Мы показали, что аккумуляция мРНК и белка Orb в клетке-предшественнике ооцита связана с дифференцировкой ооцита. Продемонстрировано, что мРНК и белки Orb колокализаваны с основными маркерами ооцита в клетке-предшественнике ооцита, и при достаточной концентрации мРНК и белка Orb клетка-предшественник дифференцировалась в ооцит. Был подтвержден дозозависимый характер экспрессии гена orb, при котором для дифференцировки и поддержания статуса ооцита необходимо пороговое значение концентрации мРНК/белка Orb в клетках для запуска петли положительной обратной связи в авторегуляции оrb. Мы получили транс-гетерозиготных самок orb-XN 3’UTR/orb[343] и orb-XN 3’UTR /orb[Dec], где orb[343] и orb[Dec] – два разных нуль-аллеля гена orb. Снижение дозы функционального гена orb приводило к стерильности транс-гетерозиготных самок, тогда как гомозиготные самки линии orb-XN 3’UTR были способны откладывать яйца. Нами показано, что экспрессия оrb необходима не только для дифференцировки, но и для поддержания статуса ооцита. Был использован нокдаун оrb с помощью РНК-интерференции (РНКи), чтобы подавить экспрессию гена оrb после дифференцировки ооцита в гермарии яичников мух. После подавления экспрессии оrb в ооците, локализация мРНК маркера ооцита osk изменялась. К 4-й стадии оогенеза мРНК osk исчезала в 60-100% яйцевых камер яичников. Эти результаты свидетельствуют о том, что статус ооцита на 1-4 стадиях оогенеза не поддерживается в отсутствии экспрессии гена оrb.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетном периоде мы выявили особенностях функционирования регулятора трансляции orb2 в норме, а также изучили влияние удаления 3′-нетранслируемой области (3’UTR) этого гена на его функционирование в семенниках и мозге дрозофилы. Мы обнаружили 5022 потенциальных генов-мишеней белка Orb2 в центральной нервной системе мух. Из них 4025 генов-мишеней имели канонические элементы цитоплазматического полиаденилирования (CPE) на 3'UTR, 997– неканонические CPE. 2472 потенциальных гена-мишени выявлены нами впервые, 2550 генов были ранее обнаружены при исследовании культуры клеток дрозофилы S2. Анализ функциональных групп генов показал, что наиболее часто белок Orb2 связывался с транскриптами генов, задействованных в функционировании нервной системы, а также генами, участвующими в изменении топологии ДНК и в процессах созревания мРНК и белков в клетке. Таким образом, мы значительно расширили количесво известных генов-кандидатов, участвующих в процессе формирования долговременной памяти посредством взаимодействия их мРНК с белком Orb2, регулирующим трансляцию. Нами была получена линия мух с делецией 3’ UTR в гене orb2 (orb2 delta 3’UTR). Обнаружено, что 3' UTR гена orb2 играет важную роль в сперматогенезе мух, поскольку только 26,5% гомозиготных по orb2 delta 3’UTR самцов были фертильны. У фертильных самцов с делецией 3' UTR гена orb2 выявлено снижение количества потомства. Таким образом, влияние полученной новой мутации на репродуктивную функцию самцов варьирует в разных особях от стерильности до пониженной фертильности. На начальных этапах сперматогенеза мы не выявили морфологических нарушений в семенниках мух orb2 delta 3’UTR, что свидетельствует о том, что мутация orb2 delta 3’UTR не нарушает процессы митотического и мейотического деления в сперматогенезе. Мы показали, что последовательность 3'UTR гена orb2 необходима для поляризациии сперматид на стадии элонгации. Ядра сперматид, которые в норме локализуются вблизи конца цисты, противоположном направлению роста аксонем, были рассеяны по всей длине сперматид. На стадии элонгации мРНК и белок Orb2 не аккумулировались на растущих концах сперматид, а имели равномерное распределение вдоль хвостов сперматид. Последовательность 3'UTR гена orb2 участвует в локализации мРНК и белка Orb2 в сперматогенезе. На стадии индивидуализации сперматид комплекс индивидуализации формировался только в 20% семенников мух, гомозигоных по orb2 delta 3’UTR. По-видимому, полное отсутствие или дефекты формирования комплекса индивидуализации на этой стадии являются следствием нарушения поляризации сперматид, которое происходит на предыдущей стадии элонгации. Зрелые сперматозоиды обнаружены только в 30% семенных пузырьков самцов линии orb2 delta 3’UTR, что коррелируют с данными о сниженной фертильности самцов orb2 delta 3’UTR. Ранее было показано, что белок Orb2 иммунопреципитирует свою собственную мРНК в экстрактах семенников. Поскольку мРНК orb2 имеет консенсусные CPE мотивы в 3’UTR, мы предположили, что белок Orb2 связывается с 3’UTR мРНК orb2 для авторегуляции. Уровень мРНК и белка Orb2 снижался в 2 раза в семенниках линии orb2 delta 3’UTR. Эти результаты свидетельствуют о том, что последовательность 3’ UTR необходима для поддержания нормального уровня мРНК и белка Orb2 в семенниках. Для оценки дозозависимого характера экспрессии гена orb2 мы получили мух с делецией 3'UTR на фоне нуль мутации: оrb2 delta 3'UTR/orb236. Такие гетерозиготные самцы были полностью стерильны, у них не происходила кластеризация ядер в цистах сперматид, не формировался комплекс индивидуализации, а семенные пузырьки у них были пустые. В гетерозиготной линии orb2 delta 3’UTR/orb236 уровни экспресси мРНК и белка Orb2 снижались в 10 раз. На основании полученных результатов и имеющихся литературных данных мы заключили, что для нормального процесса поляризации сперматид необходимо наличие в них определенной пороговой концентрации белка Orb2. В отсутствии CPE сайтов 3’ UTR, имеющийся в начинающих поляризоваться после мейоза сперматидах белок Orb2 не способен связываться со своей собственной мРНК и активировать трансляцию на достаточном уровне, что приводит к наблюдаемым фенотипическим нарушениям. Мы определили, каким образом делеция 3’ UTR гена orb2 влияет на распределение мРНК и белков потенциальных генов-мишеней Orb2 в семенниках и мозге мух. Локализация мРНК и белка Orb нарушалась в семенниках линии orb2 delta 3’UTR. Также нарушалось распределение белка Boule, мРНК которого не является мишенью Orb2, однако белки Bol и Orb2 непосредственно взаимодействуют друг с другом. В мозге мы обнаружили нарушения в распределении белков Еya и Fas2 в линии мух orb2 delta 3’UTR. Оба белка практически исчезали из центрального отдела мозга дрозофилы, концентрация Fas2 значительно снижалась в грибовидных телах, ответственных за формирование долговременной памяти у мух. Таким образом, нарушение функционирования регулятора трансляции orb2 при удалении его 3’UTR или при нуль мутации ведет к каскаду нарушений в функционировании генов-мишеней, с мРНК которых Orb2 связывается, что приводит к расстройству в работе целых органов, таких как семенники и мозг. Мы обнаружили нарушения нейрогенеза, проявлявшиеся в нарушении ассиметричного деления нейробластов, в 37% эмбрионов линии мух с делецией 3'UTR в гене orb2. Полученные данные свидетельствуют о том, что изучаемая делеция приводит к нарушению эмбрионального нейрогенеза, однако мутация является гипоморфной и на выживаемость особей влияет незначительно.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном периоде мы исследовали роль 3’- нетранслируемой области (3' UTR) гена orb2 в функционировании фактора трансляции Orb2 в мозге. В частности, мы изучили влияние делеции 3' UTR гена orb2 на экспрессию и локализацию Orb2 и белков потенциальных мРНК-мишеней Orb2 в клетках мозга, а также влияние этой мутации на поведение, включая локомоторную активность, краткосрочную и долгосрочную память у дрозофил. В 3' UTR мРНК orb2 находятся CPE последовательности, с которыми может связываться белок Orb2, авторегулируя синтез белка. Для экспериментального подтверждения гипотезы авторегуляции Orb2 мы использовали линию мух с делецией 3’ UTR гена orb2 (orb2R). Делеция 3' UTR гена orb2 не влияла на уровень мРНК orb2 в мозге дрозофил, однако влияла на количество этого белка. Мы наблюдали снижение суммарного белка Orb2 примерно в два раза в мозге линии orb2R, в то время как в зоне сомы нейронов количество белка не отличалось от контрольной линии. Снижение суммарного белка Orb2 в мозге линии orb2R происходило за счет значительного падения его уровня в зоне синапсов. Мы предполагаем, что снижение уровня белка Orb2 происходило в результате нарушения транспорта мРНК в зону синаптических контактов и/или в результате разрыва цепи положительной авторегуляции трансляции мРНК orb2 в этой части нейронов по причине отсутствия CPE последовательностей в orb2 3' UTR. Таким образом, 3' UTR гена orb2 необходима для поддержания уровня белка Orb2 в зоне синапсов. Белок Orb2, связываясь с целевой мРНК, может выступать как в качестве ингибитора, так и активатора трансляции. За отчетный период мы изучили влияние делеции 3' UTR orb2 на трансляцию белков, которые локализованы преимущественно в соме нейронов (Arm, Eya) и зоне нейронных отростков (Pyd, CSP). Изменений в уровне белка Arm в мутантной линии обнаружено не было, в то время как содержание белка Eya было понижено в фракции сомы из нейронов мух линии orb2R. Иммуноокрашивание препаратов мозга мух линии оrb2R показало отсутствие белка Eya в части клеток центрального отдела мозга по сравнению с контролем. Механизм, обуславливающий данный эффект, пока не ясен, поскольку мы не наблюдали снижения уровня белка Orb2 в соме нейронов, что могло бы привести к уменьшению связывания Orb2 с мРНК гена eya, однако возможно существуют дополнительные механизмы регуляции, которые напрямую не зависят от РНК- белкового взаимодействия Orb2 с целевой мРНК. Мы обнаружили увеличение содержания белков Pyd и CSP в синапсах у линии мух оrb2R с помощью полуколичественного Вестерн блота. Эти данные были подтверждены иммуноокрашиванием препаратов мозга дрозофил мутантной линии, где мы наблюдали более сильный сигнал белков Pyd и CSP по сравнению с диким типом. На основании этих результатов мы предполагаем, что Orb2 выступает в качестве ингибитора трансляции мРНК-мишеней, по крайней мере в синапсах. При нарушении процесса авторегуляции гена оrb2 происходит снижение содержания белка Orb2 в синапсах, что приводит к снижению уровня ингибирования трансляции целевых мРНК. В экспериментах по определению влияния делеции 3' UTR гена orb2 на локомоторную функцию дрозофил мы не обнаружили достоверных различий с мухами дикого типа. Также мы не обнаружили влияния делеции на краткосрочную и среднесрочную память мух. Однако, у мух линии оrb2R наблюдались сильные нарушения в процессе формирования долговременной памяти. Сходный эффект мы наблюдали и для мух линии с нуль-мутацией оrb2-36, у которых также наблюдалось нарушение в переходе краткосрочной памяти в долгосрочную. В основе наблюдаемых нами нарушений лежит снижение уровня белка Orb2 в мозге. При этом механизмы, приводящие к этому снижению, различны для линий оrb2-36 и orb2R. В первом случае нуль-мутация orb2-36 приводит к уменьшению количества мРНК Orb2, что выражается в общем снижении количества белка в мозге. Во втором случае происходит нарушение распределения Orb2 в нейронах вследствие отсутствия локальной трансляции этого белка в нейронных отростках. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что последовательность 3' UTR гена orb2 важна для правильной локализации и активации локальной трансляции белка Orb2 в синапсах, которые опосредованы процессом авторегуляции orb2. Нарушение этого процесса приводит к невозможности нормального формирования долговременной памяти.