КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-74-10091

НазваниеИдентификация новых мишеней для диагностики и терапии онкологических заболеваний, связанных с нарушениями системы Polycomb

РуководительЧетверина Дарья Александровна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии гена Российской академии наук, г Москва

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2021  , продлен на 07.2021 - 06.2023. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-210 - Молекулярная генетика

Ключевые словаpolycomb, репрессия транскрипции, ДНК-связывающие белки, транскрипционные факторы, рак.

Код ГРНТИ34.15.23


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Персонализированная медицина нуждается в существенных прорывах как в понимании механизмов, лежащих в основе заболеваний, так и в современных способах быстрой идентификации молекулярных причин заболеваний. В идеале каждому пациенту должна подбираться оптимальная комбинация терапевтических средств, обеспечивающих наиболее эффективное лечение. Онкологические заболевания имеют наиболее разнообразный набор причин их возникновения и вовлеченных в этот процесс факторов. Превращение нормальных клеток в раковые сопровождается нарушениями в транскрипции генов, в том числе снижением экспрессии онкосупрессоров. Группа высоконсервативных белков у многоклеточных, объединенных под названием Polycomb (PcG), обеспечивает специфичную репрессию транскрипции. В большом проценте злокачественных трансформаций наблюдается нарушение уровня экспрессии белков группы PcG. Два основных типа комплексов PcG человека осуществляют убиквитинилирование (PRC1) и метилирование (PRC2) белков. В настоящее время в процессе разработки и валидации находится множество терапевтических средств (пептидов и низкомолекулярных химических соединений), которые ингибируют одну из этих двух активностей белков группы PcG. Однако подавление основных активностей PcG-комплексов может приводить к непредвиденным нарушениям функционирования клеток. В данном проекте планируется начать развитие альтернативного подхода лечения онкологических заболеваний, основанного на воздействии на определенные группы факторов, контролирующих рекрутирование PcG белков. Данный проект направлен на идентификацию и изучение новых консервативных ДНК-связывающих факторов, участвующих в привлечении репрессоров группы PcG на хроматин у человека и Drosophila melanogaster (как модельной системы). Открытые и исследованные в ходе выполнения проекта ДНК-связывающие белки человека могут в дальнейшем быть использованы в персонализированной медицине как мишени для прогнозирования, диагностики и терапии онкологических заболеваний

Ожидаемые результаты
Основными результатами данного проекта будут идентификация и изучение новых консервативных ДНК-связывающих белков, необходимых для рекрутирования PcG-комплексов на хроматин у человека и дрозофилы. Будут установлены полногеномные профили распределения идентифицированных факторов и их консенсусные сайты связывания. Будут картированы домены в PcG-рекрутерах, необходимые для взаимодействия с белками PcG-комплексов. Будет исследована роль найденных факторов в PcG-зависимой репрессии. Идентификация факторов, вовлеченных в рекрутирование PcG-белков, а также установление базовых принципов сборки PcG-комплексов на хроматине, необходимы для понимания роли PcG-системы в разных социально значимых заболеваниях, прежде всего онкологических. Открытые и исследованные в ходе выполнения проекта ДНК-связывающие белки могут в дальнейшем быть использованы как мишени для прогнозирования, диагностики и терапии в различных приложениях персонализированной медицины.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Основной целью данного проекта является -идентификация и изучение новых консервативных ДНК-связывающих факторов, участвующих в привлечении репрессоров группы Polycomb (PcG) на хроматин у человека и Drosophila melanogaster (как модельной системы). Одной из задач первого года проекта было исследование обнаруженных ранее в нашей группе ДНК-связывающих белков Drosophila melanogaster: CG17829, Pad и CG32767. Получены качественные поликлональные антитела к белку CG17829. Используя данные антитела в экспериментах по иммунопреципитации хроматина (X-ChIP) мы показали, что CG17829 ассоциирован с рядом известных PRE-элементов генома Drosophila melanogaster. C помощью метода редактирования генома CRISPR/Cas9 получена делеция гена pad - кодирующая область гена была заменена на attP-сайт. С использованием антител к белку Pad установлен его полногеномный профиль связывания ДНК (ChIP-seq анализ) на эмбриональной стадии развития Drosophila melanogaster. Обнаружено 1702 участка связывания Pad, при этом многие пики перекрываются с хорошо охарактеризованными PRE-элементами (участками ДНК, на которые рекрутируются белки PcG). Методом дрожжевого двугибридного анализа был проведен поиск прямых партнеров Pad среди белков PcG. В результате обнаружено сильное взаимодействие между белками Pad и Sce – коровым компонентом комплекса PRC1. Для белка CG32767 методом pull-down подтверждена его способность взаимодействовать с PcG-фактором Sfmbt. Установлены минимальные области белков CG32767 и Sfmbt, необходимые для взаимодействия. В области теломерных повторов третьей хромосомы Drosophila melanogaster обнаружен элемент генома CR40450, который, вероятно, неправильно аннотирован как псевдоген и может являться функциональным паралогом CG32767. С использованием системы attP/attB, позволяющей встраивать трансгены в одну и ту же точку генома (attP2), созданы и проанализированы трансгены, несущие элемент bxdPRE с нативным или мутированным сайтом связывания CG32767. Установлено, что мутация сайта CG32767 приводит к полной потере репрессии маркерного гена white. Второй задачей первого года проекта была идентификация новых потенциальных рекрутеров методом иммунопреципитации с последующим высокочувствительным пептидным секвенированием. Был обнаружен новый партнер PcG-белка Sfmbt - фактор Hangover, имеющий в своем составе 19 ДНК-связывающих мотивов «цинковые пальцы» С2Н2-типа. В ходе первого года проекта был обнаружен и исследован новый PRE-элемент из генома Drosophila virilis. К данному элементу легко подобрать уникальные праймеры, не встречающиеся в геноме Drosophila melanogaster. Обнаруженный PRE-элемент обуславливает сильную репрессию маркерного гена white при инсерции в геном Drosophila melanogaster и взаимодействует с PcG-белками комплексов PRC1 и PhoRC (https://journals.eco-vector.com/0869-5652/article/view/11778). Исследована способность проходящей транскрипции блокировать активность интрон-расположенного энхансера (https://journals.eco-vector.com/0869-5652/article/view/12569). Для PcG-репрессоров человека - CBX2, CBX4, CBX6, CBX8, L3MBTL2, Th-POK и HINFP (гомолог белка CG17829 Drosophila melanogaster) - получены антитела и/или сыворотки. Проведен поиск гомологов белков с мотивами «цинковые пальцы» С2Н2-типа в геноме человека, которые имеют схожие домены с факторами Pad и CG32767. Для выявленных факторов - ZNF167, ZNF407, ZNF546, ZNF33A и ZNF273 - созданы плазмиды, несущие фрагменты данных белков, для последующего получения поликлональных антител.

 

Публикации

1. Ерохин М.М., Михайлова А.В., Георгиев П.Г., Четверина Д.А. Влияние транскрипции на активность энхансера гена white, интегрированного в интрон Доклады Академии наук, том 484, № 4, с. 495—497 (год публикации - 2019).

2. Четверина Д. А., Михайлова А.В., Георгиев П.Г., Ерохин М.М. Новый PRE-элемент генома Drosophila virilis как удобный модельный сайленсер Доклады Академии наук, Том 484, № 3, Страницы: 363-366 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Представленный проект направлен на поиск и исследование ДНК-связывающих факторов, участвующих в привлечении репрессоров группы Polycomb (PcG) на хроматин. В ходе выполнения второго года проекта получены новые данные о рекрутерах человека. Методом дрожжевого двугибридного анализа установлены взаимодействия между PcG-белком L3MBTL2 и двумя ДНК-связывающими факторами - ZNF281 и ZFP64. Потенциально ДНК-связывающие белки, взаимодействующие через L3MBTL2 могут играть ключевую роль в привлечении L3MBTL2 и других белков Polycomb на хроматин у человека. Так, ранее важная роль в рекрутировании была продемонстрирована для комплекса PhoRC Drosophila, который включает паралог L3MBTL2 – белок Sfmbt и ДНК-связывающие субъединицы. В ходе проекта мы также продемонстрировали взаимодействие между ДНК-связывающим фактором ZNF76 и одним из компонентов репрессорного комплекса PRC2 – PHF19, что предполагает, что ректутирование потенциально может также осуществляться и через другие факторы. Установлены взаимодействия между белками ZFP64 - ZNF76 и ZNF281 - ZNF76, что поддерживает идею кооперативного связывания рекрутеров и PcG-факторов с хроматином (модель «платформы»). Продемонстрировано, что белки ZNF76 и ZFP64 могут взаимодействовать со своей копией в двугибридной системе. На модели дрозофилы исследованы свойства ДНК-связывающих белков CG32767, CG17829 и Pad. Для белка CG32767 методом ко-иммунопреципитации показано взаимодействие с ключевыми PcG-белками – Sfmbt и E(z). Продемонстрировано, что мутация сайтов связывания CG32767 в ДНК-последовательности bxdPRE приводит к полному нарушению репрессии маркерного гена в трансгенных мухах. Проведен ChIP-seq анализ для определения полногеномного профиля связывания белка Pad на стадии личинки и показана колокализация Pad со многими PRE-элементами. Методом иммунопреципитации с последующим высокочувствительным масс-спектрометрическим анализом (IP/MS) был исследован интерактом фактора CG17829. В качестве основных партнеров выявлены белки группы Trithorax: Osa, Trx, Brm, Snr, Mor. Продемонстрирована роль CG17829 в рекрутировании факторов Trx, Osa на хроматин: методом иммунопреципитации хроматина показано, что на фоне мутации по CG17829 происходит падение связывания Osa и Trx с PRE-элементами. Проведен масштабный мета-анализ нарушений Polycomb-комплекса PRC2 (белки EZH2/SUZ12/EED) при различных онкологических патологиях у человека с использованием различных баз данных. Идентифицированы основные типа рака, при которых наблюдается нарушение активности EZH2/SUZ12/EED.

 

Публикации

1. Д.А. Четверина, Д.В. Ломаев, П.Г. Георгиев, М.М. Ерохин Генетические нарушения активности PRC2 при онкологии: проблемы и перспективы Генетика, - (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Настоящий проект направлен на исследование белков группы Polycomb как мишеней для разработки новых подходов для терапии онкологических заболеваний. В ходе выполнения третьего года проекта исследованы интерактомы двух ДНК-связывающих факторов: ZNF281 и ZNF131, a также белка EZH2 комплекса PRC2. Для этого применялся метод иммунорпеципитации с последующим высокопроизводительным пептидным секвенированием всего пула выделенных белков методом LC-MS. В случае белка ZNF131 были получены наиболее интересные результаты. Во-первых, топовые партнеры ZNF131 представлены компонентами хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF (группа Trithorax) - белками SMARCA5, SMARCA4, SMARC1, SMARCC2 и др. Во-вторых, в топе взаимодействий детектируется Polycomb-фактор SCML2. Кроме того, два других компонента из группы PcG – белки RING2 и PHC2 – также детектируются в IP. Как и ZNF131, ZNF281 ассоциирован с SCML2, а также с белком PRC1-комплекса RING1. Для белка EZH2 показано взаимодействие c ДНК-связывающим фактором ZNF24. На дрозофилиной модели методом иммунопреципитации-масс-спектрометрии установлены белковые партнеры сразу четырех ДНК-связывающих факторов, ассоциированных с системой Polycomb, - Zeste, Adf1, Combgap и Psq. Показано, что, кроме контактов с Polycomb-факторами, данные белки имеют свои уникальные наборы взаимодействий. Adf1 преципитирует все компоненты медиаторного комплекса субъединиц «голова», «тело» и «хвост». Антитела против Combgap эффективно преципитируют промотор-ассоциированные факторы комплексов NELF и TFIID. Psq из всех четырех протестированных факторов наиболее сильно взаимодействует с хроматин-ремоделирующим комплексом SWI/SNF. Кроме того, антитела против Combgap эффективно преципитируют Adf1 и GAF. Psq и Zeste взаимодействуют друг с другом, как и с двумя другими PRE-ассоциированными ДНК-связывающими факторами – Dsp1 и Fs(1)h (dBRD4). В связи с присутствием разных PRE-связывающих белков в инетрактомах друг друга мы протестировали возможность образования прямых белок-белковых взаимодействий между исследуемыми ДНК-связывающими факторами методом дрожжевой двугибридной системы. Как и ожидалось, были обнаружены несколько прямых контактов: Combgap - Adf1, Psq – Dsp1, Pho – spps. Таким образом, полученные данные полностью согласуются с выдвинутой нами в заявке моделью «платформы» как механизма специфичного рекрутирования репрессоров системы Polycomb на хроматин. Наконец, мы провели подробный анализ делеций компонентов комплекса PRC2 (Polycomb repressive complex 2) в раковых линиях человека (данные были взяты из проекта DepMap) c целью выявления типов опухолей, для которых могла бы подойти терапия, основанная на разработанных ингибиторах PRC2. Обнаружено, что наибольшую чувствительность к делециям генов коровых компонентов PRC2 (EZH2, SUZ12 и EED) имеют клетки из линий лимфоидных новообразований. Более того, линии с GOF-мутациями EZH2 обладали наибольшей чувствительностью к подавлению активности PRC2. На следующем этапе мы проанализировали данные DepMap на предмет корреляций между наличием мутаций вторичных генов и их чувствительностью к делециям PRC2-кодирующих генов в 777 раковых линиях. Для этого был разработан уникальный компьютерный алгоритм, позволяющий количественно обсчитать зависимости между наличием мутаций и чувствительностью раковых клеток (доступен на портале GitHub https://github.com/genesolution/PRC2_data). Помимо мутаций генов, кодирующих субъединицы комплекса SWI/SNF (что было известно ранее), к гиперчувствительности раковых клеток приводят мутации в других генах (компоненты COMPASS и COMPASS-like комплексов, ряд Polycomb-ассоциированных факторов и др.). При этом для трех генов показаны значимые корреляции в случае делеции любого из трех коровых компонентов PRC2-комплекса. Таким образом, нами были выявлены гены, нарушения которых могут потенциально быть использованы в качестве маркеров эффективности применения терапии, основанной на низкомолекулярных ингибиторах PRC2.. В будущем полученные данные могут иметь важное значение для персонализированной медицины при применении препаратов, подавляющих активность PRC2.

 

Публикации

1. Ерохин М., Горбенко Ф., Ломаев Д., Мазина М., Михайлова А., Гараев А., Паршиков А., Воробьева Н., Георгиев П., Шедл П., Четвернина Д. Boundaries potentiate Polycomb Response Element-mediated silencing BMC Biology, - (год публикации - 2021).

2. М. М. Ерохин, Ю. В. Шидловский, Д. В. Ломаев, П. Г. Георгиев, Д. А. Четверина Sfmbt взаимодействует с белком Hangover и субъединицами SWI/SNF-комплекса у Drosophila melanogaster 1608-3091, - (год публикации - 2021).

3. Михайлова А., Ломаев Д., Георгиев П., Ерохин М., Четверина Д. Identification of Pipsqueak interacting proteins in Drosophila melanogaster FEBS Open Bio, - (год публикации - 2021).

4. Четверина Д. А., Ломаев Д. В., Георгиев П. Г., Ерохин М. М. Генетические нарушения активности PRC2 при онкологии: проблемы и перспективы Генетика, 2021, том 57, № 3, с. 255–269 (год публикации - 2021).

5. Четверина Д., Ерохин М., Шедл П. GAGA factor: a multifunctional pioneering chromatin protein Cellular and Molecular Life Sciences, Pudlished online: 02 February 2021 (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
не указано