Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1) Разработана и оптимизирована универсальная методика генерирования высокореакционноспособных селенид-анионов из товарного элементного селена в основно-восстановительной системе «гидразингидрат-гидроксид калия». С использованием сгенерированных таким образом высокореакционноспособных ионов Se(2-) выступающих в качестве прекурсоров селена, а также стабилизирующего потенциала природных доступных биологически совместимых и активных полисахаридов арабиногалактана, галактоманнана и каппа-каррагинана нами осуществлен синтез ряда водорастворимых нанобиокомпозитов элементного селена с его содержанием 0.3-3.0 %. Полученные Se(0)-содержащие нанокомпозиты представляют собой водорастворимые порошки оранжевого или красно-оранжевого цвета с практическим выходом 79-94 % в пересчете на полисахарид и селен. Варьирование количественного содержания селена в нанобиокомпозитах осуществляли изменением соотношения Se(2-)/полисахарид. Наиболее выраженная стабилизирующая емкость наблюдалась для полисахарида галактоманнана. На его основе успешно синтезированы нанокомпозиты содержащие 0.4-3.0 % Se(0). Тогда как арабиногалактан и каппа-каррагинан проявили менее выраженную стабилизирующую емкость. Увеличение процентного содержания селена в составе нанокомпозита сопровождается ростом среднего размера частиц с 4.6 до 11.0 нм, с 13.0 до 24.0 и с 16.0 до 21.0 нм в нанокомпозитах на основе каппа-каррагинана, галактоманнана и арабиногалактана соответственно, а также увеличением их полидисперсности. Экспериментально установлено, что наиболее оптимальной температурой синтеза нанобиокомпозитов элементного селена является температура 60° С. При данной температуре, наиболее эффективно, осуществляется контроль наноморфологических и структурных характеристик нанокомпозитов, а получаемые образцы характеризуются агрегативной и фазовой устойчивостью и достаточно узким размерным распределением. Проведение синтеза Se(0)НЧ при комнатной температуре увеличивает его продолжительность, а также определяет низкую агрегативную стабильность получаемых нанокомпозитов. Высокие температуры синтеза (70-98° С) приводят к формированию более крупных Se(0)НЧ с высокой степенью полидисперсности, с ярко выраженной тенденцией к фазовому переходу селена в готовом нанокомпозите из аморфной модификации в форму гексагонального кристаллического селена. 2) Разработан новый способ получения водорастворимых агрегативно-устойчивых нанобиокомпозитов элементного селена с использованием в качестве его источника фосфорорганических соединений, в нашем случае - бис(2-фенилэтил)фосфинодиселенофосфината калия, а в качестве стабилизатора природных полисахаридов – арабиногалактана, галактоманнана и каппа-каррагинана. Содержание Se(0) в полученных нанокомпозитах, в зависимости от условий синтеза, варьировали в интервале 0.5-4.6 %. В результате взаимодействия бис(2-фенилэтил)фосфинодиселенофосфината калия с перекисью водорода происходит его окисление до бис(2-фенилэтил)фосфината калия, сопровождающееся выделением атомов элементного селена. Образовавшиеся на этом этапе атомы селена коалесцируют друг с другом с формированием Se(0)НЧ с последующей их стерической и электростатической стабилизацией макромолекулами арабиногалактана, галактоманнана и каппа-каррагинана. Установлено, что полученные данным методом нанокомпозиты формируются в виде наночастиц аморфного селена с формой близкой к сферической, диспергированных в полисахаридных матрицах арабиногалактана, галактоманнана и каппа-каррагинана. При этом, средний размер Se(0)НЧ в зависимости от типа матрицы и исходного соотношения реагентов варьировался в интервале от 34.0 до 59.0 нм. 3) Выполнен комплексный анализ состава, строения и наноморфологии синтезированных нанокомпозитов с привлечением современных физико-химических методов исследования. C использованием ИК-спектроскопии обнаружено непосредственное участие функциональных групп полисахаридов (гидроксильные группы, сульфогруппы, терминальные альдегидные группы) в стабилизации формирующихся Se(0)НЧ. Установлено, что в зависимости от типа стабилизирующей матрицы и количественного содержания селена, нанокомпозиты являются либо рентгеноаморфными, либо аморфно-кристаллическими веществами. Отсутствие рефлексов отражений соответствующих кристаллографическим плоскостям кристаллического Se (гексагональный, тригональный, ромбический, моноклинный) на дифрактограммах нанокомпозитов с небольшим содержанием селена (0.3-2.0 %), а также в случае использования в качестве стабилизирующих матриц арабиногалактана и каппа-каррагинана свидетельствует о формировании аморфной модификации селена. Тогда как нанокомпозиты на основе галактоманнана при содержании селена свыше 3.0 % имели аморфно-кристаллическую структуру. Согласно данным просвечивающей электронной микроскопии, нанокомпозиты синтезированные из объемного образца товарного селена формируются в виде частиц с формой близкой к сферической, диспергированных в полисахаридных матрицах. Средний размер наночастиц селена в зависимости от условий синтеза варьируется в интервале от 4.6 до 24.0 нм. При этом повышение содержания селена в составе нанокомпозитов сопровождалось увеличением среднего размера частиц с 4.6 до 11.0 нм, с 13.0 до 24.0 нм и с 16.0 до 21.0 нм для нанокомпозитов на основе каппа-каррагинана, галактоманнана и арабиногалактана соответственно. Размерный диапазон наночастиц составляет от 3.0 до 35.0 нм и является наиболее широким для нанокомпозитов на основе арабиногалактана, а также в образцах с содержанием селена свыше 1.3 %. Нанокомпозиты синтезированные с использованием в качестве прекурсора селена бис(2-фенилэтил)фосфинодиселенофосфината калия также формируются в виде сферических частиц диспергированных в полисахаридных матрицах. Однако размерный диапазон наночастиц селена в их составе является более широким (от 28.0 до 87.0 нм), а их средний размер в зависимости от типа матрицы и исходного соотношения реагентов варьировался в интервале от 34.0 до 59.0 нм. Обнаружено, что все синтезированные нанобиокомпозиты элементного селена дают в спектрах ЭПР сложный широкий сигнал со средними значениями g-фактора 2.2 и шириной 900 Гс и узкий синглет в районе g-фактора 2.005 и шириной около 7 Гс, при этом ширина обоих сигналов зависит от размеров наночастиц селена. Широкая линия объясняется сильным диполь-дипольным взаимодействием между частицами, в структуре микрокристаллитов которых может находиться значительное количество неспаренных электронов. Увеличение ширины сигнала с ростом размера наночастиц может объясняться усилением обменных взаимодействий в укрупняющихся частицах и, соответственно, укорочением времени релаксации. Можно предположить, что узкий сигнал относится к малым кластерам нульвалентного селена или присутствующим в нанокомпозитах свободным радикалам от полисахаридной матрицы, дающим сигналы в этой же области. Широкий сигнал может быть обусловлен электронами проводимости (CESR) наночастиц. Обнаружено, что спектры оптического поглощения водных растворов всех синтезированных нанобиокомпозитов в спектральном диапазоне 190-800 нм имеют невыразительный характер с плавным ростом в области высоких энергий и небольшим плато области 280-290 нм и 530 нм характерным для коллоидных растворов аморфного селена. Спектры люминесценции водных растворов нанокомпозитов на основе арабиногалактана и каппа-каррагинана характеризуются наличием узкой симметричной полосы с максимумом в области 660 нм. При этом ее положение и интенсивность определялись процентным содержанием селена в нанокомпозите, а соответственно и размерными характеристиками наночастиц. Установлено, что увеличение количественного содержания селена в составе нанокомпозита с 0.3 до 1.5 % сопровождается незначительным сдвигом максимума люминесценции в длинноволновую область (с 663.5 нм до 666.5 нм), а также снижением интенсивности и квантового выхода люминесценции с 0.047 до 0.026 %. Предположительно, это может быть обусловлено более высокой интенсивностью свечения Se(0)НЧ малых размеров, являющихся преимущественной составляющей нанокомпозитов с 0.3 % Se(0), а также концентрационным фактором тушения люминесценции. С использованием полученных данных люминесцентной и оптической спектроскопии нами определены средний размер формирующихся наночастиц селена (4.3-4.4 нм) в матрице каппа-каррагинана и оценен характер их дисперсного распределения (от 3.0 до 12.0 нм). Полученные нами расчетные данные хорошо согласуются данными ПЭМ. 4) Исследована антиоксидантная активность всех полученных нанокомпозитов и исходных наностабилизирующих матриц. Экспериментально установлено, что исходные арабиногалактан, галактоманнан и каппа-каррагинан в интервале концентраций 0.25-9.0 мг/мл практически не оказывают ингибирующего влияния на свободный радикал ДФПГ· и катион-радикал АБТС·+, что характеризует данные полисахариды как вещества с крайне низкой антирадикальной активностью. Нанобиокомпозиты селена на их основе в тех же концентрациях проявили выраженное антирадикальной действие (до 50 %). При этом, увеличение количественного содержания Se(0)НЧ в составе нанокомпозитов с 0.25 до 3.0 % сопровождалось снижением величины IC50%ДФПГ с 9.3 до 2.5 мг/мл и IC50% АБТС+• с 2.3 мг/мл до 0.83 мг/мл, что подтверждает непосредственное участие селена в реакциях ингибирования данных свободных радикалов. Обнаружено, что для 50 % нейтрализации 3.17·10-7 моль ДФПГ и 1.5·10-7 моль АБТС достаточно соответственно 3.8·10-7-2.75·10-6 и 1.32·10-7-6.62·10-7 моль Se (0) в составе нанокомпозитов. Данные величины хорошо соотносятся и даже превышают IC50% ДФПГ и АБТС для аскорбиновой кислоты (9.0·10-6 и 9.9·10-7 моль соответственно). Установлено, что увеличение среднего размера Se(0)НЧ сопровождается незначительным повышением величины количества молей селена необходимых для достижения 50 % нейтрализации ДФПГ и АБТС. Наиболее вероятно, данная закономерность обусловлена менее выраженной антиоксидантной активностью у наночастиц большего размера, присутствующих в образцах с повышенным содержанием селена в их составе, что еще раз подтверждает теорию об определяющем влиянии размера наночастиц на их свойства (в том числе биологические). Показано выраженное ингибирующее действие нанобиокомпозитов элементного селена в отношении модельных процессов перекисного окисления липидов мембран живой клетки. Установлено, что наибольшее торможение накопления продуктов перекисного окисления (в диапазоне 39 - 66 %) наблюдалось в случае использования нанокомпозитов с содержанием селена 1.4, 1.5 и 3.0 %, тогда как исходные полисахариды продемонстрировали практически полное отсутствие ингибирующего действия. В целом, необходимо отметить, что величины антиоксидантной активности полученных новых нанобиокомпозитов селена сопоставимы с таковыми для известных высокоактивных антиоксидантов - аскорбиновой кислоты и ионола. 5) Обнаружено выраженное антиоксидантное действие нанокомпозита селена на основе каппа-каррагинана (0.6 % Se) в экспериментах in vivo, проявляющееся в нормализации показателей продуктов перекисного окисления липидов (диеновые коньюгаты, малоновый диальдегид) в крови экспериментальных животных подвергшихся действию тетрахлорметана. Также экспериментально зафиксировано отсутствие гибели животных в группах получавших данный нанокомпозит после затравки CCl4 и в ее отсутствии (по сравнению с группой получившей затравку СCl4 в которой наблюдалось 50 % гибель животных), что свидетельствует о защитном действии синтезированного нами нанокомпозита на животный организм в условиях интенсивных свободнорадикальных повреждений.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1) Разработаны оптимальные условия для получения нанокомпозитов с выходом 97 % и в количестве превышающим первоначальные экспериментальные в 100 раз, соблюдение которых позволило увеличить их выход до 97 % и получать до 120 грамм нанокомпозита за один цикл синтеза. Установлено, что наиболее высокие выходы нанокомпозитов, наилучшая воспроизводимость и точный контроль структурных параметров получаемых нанокомпозитов (средний размер наночастиц, степень их полидисперсности, форма и стабильность в твердой фазе и в водном растворе) наблюдались в условиях синтеза наночастиц селена в количестве не превышающим 2.5 % в полисахаридной матрице каппа-каррагинана и арабиногалактана, однако в случае последнего выходы нанокомпозитов при масштабировании синтеза не превышали 84 %. Согласно данным просвечивающей электронной микроскопии форма наночастиц селена стабилизированных полисахаридными матрицами арабиногалактана, галактоманнана и каппа-каррагинана сгенерированных в оптимальных условиях преимущественно не отличалась от сферической. Средний размер наночастиц селена варьировался в интервале 8.0-25.0 нм в зависимости от стабилизирующей матрицы и количественного содержания селена в составе нанокомпозита. Посредством оптической спектроскопии и динамического рассеивания света установлено, что наиболее стабильными в течение 2 месяцев с момента приготовления являются нанокомпозиты с содержанием селена до 2.5 %. Спектры поглощения их водных растворов после двух месяцев хранения в темноте являются практически идентичными спектрам свежеприготовленных растворов. Данные динамического рассеивания света, отражающие дисперсное распределение гидродинамических радиусов частиц присутствующих в растворе также свидетельствуют об отсутствии каких-либо значительных агрегационных процессов в растворе нанокомпозитов в процессе их хранения (до 2 месяцев). 2) Проведено исследование биораспределения и оценена выраженность накопления селена при различных путях (пероральный, внутримышечный и внутрибрюшинный) введения нанокомпозита Se(0)/АГ (2.5 % Se) в организм крыс. Установлено, что при пероральном приеме нанокомпозита выведение селена осуществляется преимущественно с калом и мочой. Концентрация селена в печени и почках во всех опытных группах варьировала в интервале 6.05-7.53 ppm и 7.65-10.31 ppm соответственно с наибольшими значениями при внутрибрюшинном введении и наименьшим при внутримышечном. Однако низкая концентрация селена в кале и шерсти животных третьей и четвертой групп свидетельствует об отсутствии выведения его из организма, что может обуславливать накопление селена при его длительном приеме и проявлении впоследствии им токсических свойств. Вследствие этого дальнейшие эксперименты по исследованию биологической активности Se0-содержащих нанокомпозитов нами проводились с использованием перорального пути их введения. 3) Исследованы гепатопротекторная и антиоксидантная активность полученного нами нанокомпозита Se(0)/АГ (2.5 % Se0), а также установлен дозо-зависимый характер данных активностей в условиях коррекции токсического повреждения печени. Предварительное введение крысам получившим затравку CCl4 нанокомпозита Se(0)/АГ в количестве 0.5 мг/100 г веса не показало значимого снижения их концентрации на 7 день эксперимента. Их уровень составил 412 и 312 U/L соответственно, что свидетельствует о недостаточной дозе селена необходимой для проявления нанокомпозитом своих гепатопротекторных свойств. Увеличение дозы нанокомпозита Se(0)/АГ до 1 мг/100 г веса животного сопровождалось резким снижением концентрации АЛТ в сыворотке крови до значений 206 и 200 U/L соответственно. Снижение (в 2 раза) концентрации АЛТ и практически полная нормализация уровня АСТ в сыворотке, вероятно, обусловлены гепатопротекторным действием наночастиц селена, за счет его активного участия в биосинтезе селенопротеинов и ферментов системы антиоксидантной защиты организма и подавления образования АФК. Введение нанокомпозита Se0/АГ в количестве 5мг/100 г веса животного, сопровождается сохранением высоких концентраций АЛТ и АСТ (391 и 275 U/L соответственно), значение которых близко величине концентрации АЛТ и АСТ во второй группе. Вероятно это обусловлено проявлением токсического эффекта селена присутствующего в данной группе животных в избыточном количестве на фоне протекающего воспалительного повреждения печени. На фоне коррекции токсического повреждения печени у крыс четвертой группы, получивших нанокомпозит Se(0)/АГ в дозе 1мг/100 г веса обнаружено снижение показателей основных продуктов перекисного окисления липидов – ДК, КД_СТ и МДА до величин 1.84 мкМ/л, 0.85 усл. ед. и 2.19 мкМ/л, а также повышение показателя ДС до 1.52 по сравнению с группой крыс затравленных тетрахлорметаном, но не получавших лечения. В сыворотке животных пятой группы получивших нанокомпозит в дозе 5 мг/100 г веса наблюдалось снижение содержания МДА до 2.75 мкМ/л вероятно вследствие частичного включения селена в биосинтез селенопротеинов участвующих в антиоксидантной защите организма, однако вследствие избыточного его количества к положительному антиоксидантному эффекту добавляется токсический эффект селена, идентифицируемый нами по сохранению высоких концентраций эндогенных ферментов АЛТ и АСТ. Кроме того наиболее выраженный витаминосберегающий эффект в процессе коррекции токсического повреждения печени также выявлен в группе получившей нанокомпозит в дозе 1 мг/ 100 г веса. Предварительное его введение способствовало сохранению концентрации α-токоферола (7.89 мкМ/л) и ретинола (0.85 мкМ/л) практически на уровне интактной группы ( 6.87 мкМ/л и 0.71 мкМ/л соответственно) в сравнении с резким падением их концентрации во второй группе получившей затравку без коррекции (4.90 мкМ/л и 0.51 мкМ/л соответственно). 4) Проведено тестирование антирадикальной активности синтезированных Se(0)-содержащих нанокомпозитов посредством хемилюминесцентного детектирования кинетики хемилюминесценции в системе «пероксидаза хрена-перекись водорода-люминол». Использование в качестве антиоксидантов полученных нами Se(0)-содержащих нанокомпозитов сопровождается ингибированием хемилюминесценции, что свидетельствует об определяющей роли наночастиц селена в проявлении нанокомпозитами антирадикальных свойств. Величина ингибирования хемилюминесценции определялась количественным содержанием селена в составе нанокомпозита, их размером и типом его аллотропной модификации. Установлено, что наименее выраженная антирадикальная активность наблюдалась для нанокомпозитов Se/КГ и Se/ГМ с высоким (3.0 %) процентом селена в составе и гексагональным типом его кристаллической решетки. Тогда как, нанокомпозиты содержащие в своем составе наночастицы аморфного селена обладали более выраженной антирадикальной активностью. Их МИК50% в объеме пробы в зависимости от процентного содержания селена и размера наночастиц варьировали в интервале 6.5-13.5 мг/мл, что в пересчете на чистый селен составляет 1.14•10-8 - 8.1•10-8 моль Se(0). Полученные значения находятся в хорошем соответствии с количеством молей аскорбиновой кислоты необходимой для 50 % ингибирования хемилюминесценции (4.0•10-8 моль). 5) В экспериментах in vivo исследовано биологическое действие κ-КГ-стабилизированных наночастиц Se(0) с размерами 6.8 и 24.5 нм с целью оценки влияния размера наночастиц на их биологическую активность. Установлено, что состояние органов крыс после 10-дневного введения нанокомпозитов селена и исходного κ-КГ в дозе 500 мкг/кг не отличалось от состояния контрольной группы. Макроскопическая картина основных органов и систем организма находилась в пределах нормы. Полученные результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными по токсичности нанокомпозитов селена и свидетельствуют о низкой токсичности этих соединений. Микроскопическое исследование печени, почек, легких и головного мозга крыс, получавших нанокомпозиты с размерами частиц Se(0) 6.8 нм и 24.5 нм и исходный κ-КГ, показало, что структура этих органов также не имела статистически значимых отклонений от контроля. Исключением является мозг крыс второй группы, животные которой получали нанокомпозит Se(0)/κ-КГ с размером наночастиц 6.8 нм. В этой группе наблюдалось статистически значимое (р = 0.03) снижение количества клеток астроглии - 278.5 (269.0-292.0) ед. по сравнению с контрольной группой – 336.5 (319.0-364.5) ед. и группами получавшими более крупные наночастицы и исходный каппа-каррагинан – 357.0 (325.5-385.0) ед. и 314.0 (298.5-329.5) ед. соответственно. Кроме того, было обнаружено, что введение крысам нанокомпозита с малым размером частиц уровень концентрации селена в печени, почках и мозге повышается по сравнению с контрольной группой и группой, получившей нанокомпозит с размером частиц 24.5 нм. Наблюдаемое значительное увеличение концентрации селена в головном мозге вероятно обусловлено проникновением наночастиц селена с размером 6.8 нм через гематоэнцефалический барьер, который остается непроницаемым для крупных частиц. В то же время уменьшение количества клеток астроглии, вероятно, связано с воздействием наночастиц селена на структурные элементы сенсомоторной коры головного мозга. Учитывая высокую значимость астроглии в поддержании гомеостаза тканей мозга, такая селективность может привести к существенным изменениям функционального состояния сенсомоторной коры в долгосрочном постконтактном периоде. Выявленная селективность действия исследуемого нанокомпозита с размером наночастицы селена 6.8 нм требует дальнейшего детального изучения. 6) Исследованы люминесцентные свойства полисахарид-стабилизированных наночастиц Se(0), а также на основе спектров люминесценции и поглощения нами оценено дисперсное распределение наночастиц селена в полисахаридных матрицах. Установлено, что наночастицы селена, проявляют свойства квантовых точек, люминесцируя в зависимости от длины волны возбуждающего излучения в спектральном диапазоне 600-790 нм с максимальной интенсивностью в области 630-660 нм. Увеличение размера наночастиц и уширение их дисперсности сопровождается сдвигом максимума люминесценции в длинноволновую область и снижением ее интенсивности. Наименее выраженная люминесценция наблюдалась в случае исследования водных растворов нанокомпозитов селена на основе галактоманнана с высоким (3.0 %) содержанием селена. Согласно данным рентгенодифракционного анализа в данном нанокомпозите селен, представлен в виде кристаллической гексагональной аллотропной модификации, что вероятно и обуславливает отсутствие у данного нанокомпозита люминесцентных свойств, в отличие от нанокомпозитов на основе АГ, КГ и других нанокомпозитов на основе ГМ с небольшим содержанием селена. 7) Проведено определение параметров острой токсичности Se(0)-содержащих нанокомпозитов на основе арабиногалактана (2.5 % Se) и каппа-каррагинана (2.6 % Se) при их однократном парентеральном введении в предельной дозе (2000 мг/кг массы тела (ГОСТ 3241-2013)) белым беспородным мышам-самцам массой тела 30-32 г. Продолжительность наблюдения за экспериментальными животными составляла 14 суток. Оценивалось общее состояние животных (внешний вид, состояние кожных покровов, наличие гиперсаливации, гибель), изменения в поведении. Обнаружено, что в первые часы наблюдения после парентерального введения нанокомпозитов отмечалось незначительное снижение двигательной активности, вялость, и снижение реакции на акустический раздражитель. Спустя сутки после введения нанокомпозитов данные изменения нивелировались и на протяжении оставшегося срока наблюдения внешних признаков отравления у животных не наблюдалось. Гибели животных в течение всего срока наблюдения зарегистрировано не было. По истечению срока наблюдения внутренние органы подвергали макроскопическому обследованию. Внешне животные выглядели опрятно, телосложение правильное, слизистые оболочки гладкие, блестящие, розовые. Грудная и брюшная полость не содержали какого-либо экссудата и спаек. Видимых изменений внутренних органов и желез не обнаружено. С учетом комплекса показателей и отсутствием, за период наблюдения, гибели животных, исследуемые вещества были отнесены к 5 классу опасности (малоопасные вещества).