КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-75-00104

НазваниеИсследование эффективности комбинированной химиотерапии рака легкого ингибиторами тирозинкиназ семейства SRC (SFK) и белков теплового шока 90

РуководительДенека Александр Ярославович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный университет", Республика Татарстан (Татарстан)

Срок выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2020 

КонкурсКонкурс 2018 года по мероприятию «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-208 - Онкология

Ключевые словаРак легкого, маркеры злокачественности, тирозинкиназы, SRC-киназа, белки теплового шока, метастазирование, химиотерапия, персонализированная медицина

Код ГРНТИ76.03.31


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Целью данного исследования является выявление механизмов, которые регулируют рост, метастазирование и ответ на химиотерапевтическое воздействие при немелкоклеточном раке лёгкого (НМРЛ). Более глубокое понимание системных биологических явлений, лежащих в основе вышеописанных патологических процессов, позволит предложить более эффективные возможности терапии НМРЛ. В настоящее время в большинстве развитых стран мира немелкоклеточный рак легкого занимает лидирующее место по смертности среди всех онкологических заболеваний. Несмотря на постепенный прогресс в лечении этого заболевания пятилетняя выживаемость составляет всего 16% от общего количества диагностированных случаев. Прогрессирование, инвазия, химиотерапевтическая резистентность и усиленный ангиогенез у многих опухолей, в том числе и при раке легкого сопровождаются увеличением активности внутриклеточных сигнальных белковых путей. Одними из таких белков являются тирозинкиназы семейства SRC (SFK). Также при раке легкого, как и в других солидных опухолях, отмечается повышенная экспрессия белков теплового шока 90 (БТШ90). Поддерживающий белок NEDD9 регулирует активность SFK киназ и недавно был описан в литературе как маркер-предиктор течения и ответа на химиотерапевтическое воздействие при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ). В данном исследовании впервые будет произведена оценка эффективности двойного ингибирования - SFK и БТШ90 в контексте экспрессии NEDD9. Это позволит обнаружить и описать механизм роста и метастазирования НМРЛ за счет действия регуляторных белков, которые могут служить как мишенями таргетной химиотерапии, так и модуляторами клеточного ответа на химиотерапевтическое лечение.

Ожидаемые результаты
Результаты данного исследования обладают высокой значимостью в области научного поиска новых методов лечения рака легкого. Во-первых, представляется возможной идентификация новых биомаркеров, сопряженных с ответом на химиотерапию, которые могут быть использованы в роли предикторов химиотерапевтического ответа. Во-вторых, в результате проведения данного исследования, будет произведена оценка чувствительности или устойчивости к новому методу терапии рака легкого, за счет выявления новых молекулярных механизмов, лежащих в основе прогрессирования рака легкого. В-третьих, представляется возможным охарактеризовать новый подход в лечении рака легкого, который представляется возможным быстро расширить на этап клинических испытаний.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В результате in vivo исследований, проведенных в течение первого года работы над проектом, нами обнаружено, что белок NEDD9 может выступать в роли одного из ключевых регуляторов роста и инвазии немелкоклеточного рака легкого, за счет регуляции процессов аутофагии и метаболизма опухолевых клеток. Отмечено, что отсутствие активности белка NEDD9 на ранних этапах развития опухоли, включая момент опухолевой трансформации клетки, приводит к компенсаторному перестроению внутриклеточных белковых сигнальных путей и в конечном итоге к более злокачественному прогрессированию заболевания, предположительно за счет изменения метаболической активности опухолевых клеток и активации аутофагии. Мы предполагаем, что белок Nedd9 играет важную роль в процессе развития опухоли от момента инициации ее роста. Эта роль отличается от таковой в уже сформированных опухолях (будь то клеточные линии или ксенографты) и не описана в литературе. На первом этапе работы над проектом нами была проведена серия in vitro экспериментов по оценке эффективности моно- и комбинированной таргетной терапии ингибитором БТШ90 ганетеспибом и ингибитором SFK дазатинибом с использованием клеточных моделей аденокарциномы легкого, в которых мы также изменяли статус активности NEDD9. С помощью анализа данных белковой экспрессии и мРНК-секвенирования, находящихся в энциклопедии опухолевых клеточных линий (Cancer Cell Line Encyclopedia, CCLE) (https://portals.broadinstitute.org/ccle) нами был оценен мутационный профиль клеточных линий. На основании полученных данных нами были отобраны три клеточных линии, сходные по мутационному профилю и экспрессирующие NEDD9 и SFK в достаточном количестве. В выбранных клеточных линиях были проведены и оптимизированы условия временного выключения NEDD9 с помощью трансфекции малыми интерферирующими РНК (миРНК). Эффективность выключения NEDD9 (70-90% спустя 24 и 48 часов после трансфекции) была подтверждена с помощью Вестерн-блоттинга. Оценка эффективности лечения клеточных линий НМРЛ ганетеспибом, дазатинибом и комбинацией препаратов проводилась с помощью метода оценки кривых жизнеспособности клеток. В результате проведенных экспериментов подтверждена большая эффективность ганетеспиба in vitro, в сравнении с дазатинибом, а также установлено, что комбинация ганетеспиба и дазатиниба не является более эффективной чем ганетеспиб в отдельности. Кроме того отмечалось, что снижение активности NEDD9 способно оказывать влияние на жизнеспособность клеток in vitro: «выключение» NEDD9 само по себе способно снижать жизнеспособность клеток на 35%. На следующем этапе с целью оценки эффективности терапии ганетеспибом и дазатинибом, а также их комбинацией in vivo, нами была охарактеризована новая трансгенная Kras/p53 мышиная модель, с интактным и выключенным NEDD9. У этих мышей введённый мутантный аллель р53 сочетается с активирующей мутацией аллеля Kras, что приводит к развитию опухолей в легком; по своим свойствам они схожи с аденокарциномой человека. После инициации роста опухолей в легких животных с помощью введения аденовируса, активирующего Adeno-Cre рекомбиназу мы следили за развитием опухолей в легких с помощью магнитно-резонансного томографического сканирования (МРТ) и обнаружили, что у животных с «выключенным» NEDD9 опухоли достигали большего размера, а также росли быстрее по сравнению с контролем – мышами с неизмененным NEDD9. В опубликованной ранее литературе для уменьшения уровня экспрессии NEDD9 в клеточных линиях НМРЛ применялась исключительно технология РНК-интерференции, после чего наблюдалось уменьшение инвазии и роста опухолевых клеток и ксенографтов. Наши результаты, полученные от мышей с абсолютным «выключением» NEDD9, показали противоположные тенденции. Поэтому далее нами был проведен расширенный анализ опухолевых лизатов с применением протеиновых тест-систем обратной фазы (reverse phase protein array, RPPA) на предмет изменения уровней более 200 белков-маркеров. Анализ показал, что в результате полного «выключения» NEDD9 изменились уровни белков, участвующих в метаболизме (GYS1, GAPDH, SCD), а также маркеров аутофагии (BECN1, белки семейства ATG). Также, в соответствии с первоначальной гипотезой, отмечалось уменьшение уровней белков-маркеров сигнальных путей, регулируемых NEDD9 – тирозин киназы SRC, АКТ и ERK1 (MAPK3). Была проведена работа по валидации данных, полученных в ходе RPPA анализа в клеточных линиях НМРЛ с помощью методов транзиентной трансфекции и сверхэкспрессии NEDD9. Отмечается снижение активности тирозин киназы SRC, AKT в клетках с уменьшенной активностью NEDD9. Также валидированы уровни изменения белков GYS1 и GSK3альфа/бэта. Дальнейшее проведение экспериментальных работ по лечению трансгенных мышей дазатинибом и ганетеспибом, а также комбинацией препаратов позволит оценить влияние статуса NEDD9 на эффективность терапии in vivo и выявить новые биохимические маркеров-предикторов.

 

Публикации

1. Топчу Ю.А., Мазитова А.М., Абрамова З.И., Денека А.Я. Nedd9 регулирует метастазирование немелкоклеточного рака легкого за счет активации эпителиально-мезенхимального перехода и миграционной способности опухолевых клеток Ученые записки Казанского университета. Серия Естественные науки, - (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе исследований, проведенных в течение второго года работы над проектом, нами обнаружено, что белок NEDD9 играет важную роль в процессе развития опухоли от момента инициации ее роста. Эта роль отличается от таковой в уже сформированных опухолях (будь то клеточные линии или ксенографты) и не описана в литературе. С целью оценки динамики развития опухолей в легких животных, а также оценки эффективности терапии ингибитором БТШ90 ганетеспибом и ингибитором тирозин киназ семейства SRC дазатинибом, а также их комбинацией in vivo, нами была использована новая трансгенная Kras/p53 мышиная модель, с интактным и выключенным NEDD9. В ходе работы показано, что отсутствие активности белка NEDD9 на ранних этапах развития опухоли, включая момент опухолевой трансформации, приводит к компенсаторному перестроению внутриклеточных белковых сигнальных путей и в конечном итоге к более злокачественному прогрессированию заболевания. Полное «выключение» NEDD9 приводит к снижению активности тирозин киназ семейства SRC и делает опухоли более чувствительными к таргетной терапии ингибитором SFK. Этот эффект является определяющим, и таким образом нивелирует эффект от ингибирования БТШ90. Далее нами было принято решение сфокусироваться на изучении материала, полученного от мышей леченных ингибитором SFK дазатинибом с целью изучения биологического механизма лежащего в основе наших наблюдений. В опубликованной ранее литературе с целью изучения биологических механизмов регуляции роста опухолей в легких и других системах органов онкогенным белком NEDD9 применялся исключительно ксенографтный экспериментальный подход, где в клеточных линиях НМРЛ с помощью технология РНК-интерференции производилось «выключение» NEDD9, после чего опухоли подсаживались животным и наблюдалось уменьшение инвазии и роста опухолевых ксенографтов с выключенным NEDD9. Наши результаты были получены от мышей с более физиологичным, абсолютным «выключением» NEDD9, и показали противоположные тенденции. Поэтому далее нами был проведен расширенный анализ опухолевых лизатов с применением протеиновых тест-систем обратной фазы (reverse phase protein array, RPPA) на предмет изменения уровней более 200 белков-маркеров. Анализ показал, что в результате полного «выключения» NEDD9 изменились уровни белков, участвующих в метаболизме (GYS1, GAPDH, SCD), а также маркеров аутофагии (BECN1, белки семейства ATG). Также, в соответствии с первоначальной гипотезой, отмечалось уменьшение уровней белков-маркеров сигнальных путей, регулируемых NEDD9 – тирозин киназы SRC, АКТ и ERK1 (MAPK3). В ходе проведенной работы по валидации маркеров аутофагии, идентифицированных в ходе RPPA анализа, показано, что в опухолях мышей с выключенным NEDD9 наблюдается значительно более высокий уровень детекции аутофагосом, позитивных на маркеры аутофагии. Лечение этих мышей дазатинибом приводит к снижению уровней маркеров аутофагии, сопоставимому с уровнями экспрессии этих белков в контроле. Таким образом, в ходе работы над данным проектом впервые обнаружено, что вариативность уровней активности белка NEDD9 на ранних стадиям онкогенеза немелкоклеточного рака лёгкого способна оказывать влияние на прогрессию этого заболевания за счет модуляции аутофагии. Учитывая терапевтическую привлекательность этого биологического процесса, NEDD9 потенциально может быть использован в качестве биомаркера ответа на терапию ингибиторами аутофагии. Нами также было обнаружено, что при протекании опухолевого процесса в легких трансгенных мышей, использованных в данной работе, у них наблюдается большое количество плеврального выпота. С использованием нашей мышиной модели была оценена эффективность нового метода плевродеза – с помощью термостабильной гидрогелевой пены с тальком, введение которой в плевральную полость позволяет предотвратить возникновение плеврального выпота за счет лучшего «спаивания» листков париетальной и висцеральной плевры, по сравнению с традиционными методами плевродеза, такими, как суспензия талька. Эти данные демонстрируют обоснованность дальнейшей экспериментальной работы по переводу тестирования гидрогелевой пены со стадии доклинических исследований в клинику.

 

Публикации

1. - Минерал, который помогает дышать и жить Коммерсантъ, BMC Cancer (2019) 19:614 https://doi.org/10.1186/s12885-019-5777-z (год публикации - ).

2. - Найден способ уменьшить последствия плеврального выпота Газета.ru, BMC Cancer (2019) 19:614 https://doi.org/10.1186/s12885-019-5777-z (год публикации - ).

3. - Вспененный тальк эффективно борется с плевральный выпотом Indicator.ru, BMC Cancer (2019) 19:614 https://doi.org/10.1186/s12885-019-5777-z (год публикации - ).

4. Бек Т.Н., Денека А.Я., Чаи Л., Канач С., Джохал П., Альварес Н.Д., Бумбер Я., Големис Э., Лауб Г.В. An improved method of delivering a sclerosing agent for the treatment of malignant pleural effusion BMC Cancer, 19(1):614 (год публикации - 2019).

5. Денека А.Я., Комп М., Никонова А.С., Гапонова А.В., Киселева А.А., Флидер Д., Серебрийский И.Г., Големис Э.А. Nedd9 restrains non-small cell lung cancer (NSCLC) growth Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), - (год публикации - 2020).