КАРТОЧКА
ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер 18-75-10017
НазваниеСуточные ритмы чувствительности опухоли яичника к химиотерапевтическому воздействию и возможности их фармакологической коррекции
РуководительКиреева Галина Сергеевна, Кандидат биологических наук
Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Санкт-Петербург
Период выполнения при поддержке РНФ | 07.2018 - 06.2021 |
Конкурс№30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.
Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-208 - Онкология
Ключевые словациркадианные ритмы, cинхронизация циркадианных ритмов, часовые гены, рак яичника, модель, клеточная культура, химиотерапия, цисплатин, персонализированная химиотерапия, хронобиотики, мелатонин, экспериментальные животные
Код ГРНТИ34.45.05
СтатусУспешно завершен
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
Проект направлен на изучение суточной динамики пролиферации опухоли яичника, ее чувствительности к химиотерапии и возможности ее фармакологической модификации, а также выявлению роли часовых генов как регуляторов суточных ритмов в опухоли и в организме.
Существование связи между нарушением циркадианных ритмов в организме человека и увеличением риска возникновения рака подтверждено результатами нескольких крупных эпидемиологических исследований для таких злокачественных новообразований, как рак молочной железы, яичников, легких, поджелудочной железы, предстательной железы, эндометрия, колоректального рака и некоторых других. Также известно, что дисрегуляция часовых генов, контролирующих суточные ритмы в организме, ассоциирована с потерей контроля над клеточной пролиферацией, метаболизмом, репликацией и репарацией ДНК, апоптозом, ответом на повреждение ДНК и с повышенной резистентностью к противоопухолевым препаратам в клетках всех изученных типах рака человека. Материал ряда клинических исследований демонстрирует, что нарушение в системе часовых связано с опухолевым процессом. Однако, какое из этих событий является первичным (изменения в экспрессии часовых генов приводят к развитию опухоли или опухолевый процесс вызывает нарушения в работе часовых генов), а также точные молекулярные механизмы взаимосвязи данных процессов остаются неясны.
С практической стороны, известны успешные попытки разработки схем хроно-химиотерапии (введение химиопрепаратов по часам) у онкологических пациентов. В то же время отсутствует понимание общих принципов хроно-химиотерапии и надежные методы предсказания ее эффективности в каждом конкретном случае. Данные о циркадианных ритмах в опухоли и здоровых тканях могли бы способствовать разработке такого инструмента, сделать шаг в направлении персонализации химиотерапии, что является одной из наиболее актуальных задач в онкологии. Альтернативным подходом может быть не подстраивание введения химиопрепаратов под ритмы опухоли (куда может входить, например, введение в ночные часы, что значительно усложняет логистику процесса химиотерапии), а направленная коррекция циркадианных ритмов в опухоли, которая повысит ее чувствительность к химиотерапии. Так, известно, что добавление мелатонина (хронобиотик) в схему лечения пациенток с раком молочной железы, яичников, колоректальным раком имеет положительный эффект (увеличение объективных ответов и общей выживаемости пациентов, снижение частоты побочных эффектов по сравнению с химиотерапией без мелатонина), однако неясно на каком уровне (всего организма или на уровне опухоли) реализуется данный эффект. Чтобы это установить, необходимо изучить эффекты, происходящие в опухоли после локорегионального введения химиопрепаратов (контакт препарата непосредственно с опухолью при ограниченном его попадании в системный кровоток) и сравнить с эффектами, наблюдающимися в опухоли и во всем организме при стандартном системном введении противоопухолевых препаратов.
Таким образом, проект, направленный на персонализацию лечения, в первую очередь химиотерапевтического, и поиск новых инструментов прогнозирования и оценки эффективности химиотерапии у пациентов со злокачественными новообразованиями на основе данных о молекулярно-генетических механизмах реализации циркадианных ритмов в опухоли, имеет высокую актуальность и научную значимость.
Поставленная задача будет решаться в рамках междисциплинарного подхода, с использованием методов экспериментальной онкологии, молекулярной биологии и генетики, с проведением экспериментов in vitro и in vivo. Исследования in vivo будут проводиться на модели распространенного рака яичника у крыс, которая по многим своим характеристикам близка соответствующей опухоли человека, а также позволяет осуществлять многократный забор опухолевого материала (для прослеживания изменений, происходящих в опухолевых клетках в динамике) благодаря формированию множественных опухолевых узлов в брюшной полости и асциту (анализ свободных опухолевых клеток, присутствующих в асцитической жидкости). Важным преимуществом исследований опухоли яичника на данной модели заключается в том, что воспроизведение подобного дизайна исследования в клинической практике – невозможно. Параллельно будут проводиться эксперименты in vitro на культурах опухолевых клеток человека.
В ходе реализации проекта впервые будет создана доказательная база, демонстрирующая взаимосвязь между циркадианными ритмами организма, циркадианными ритмами опухоли и пролифераций опухолевых клеток. Впервые будут получены данные о том, через какие молекулярно-генетические механизмы реализуются эффекты изменения чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии в течение суток, и можно ли осуществлять направленную регуляцию этих механизмов с помощью хронобиотиков. Впервые будет использовано локорегиональное (химиоперфузионное) введение химиопрепарата наряду с системным введением в качестве оригинального подхода, чтобы установить, как изменения и нарушения в системе часовых генов реализуются на местном (на уровне опухоли) и системном (на уровне организма) уровнях.
Проект имеет высокую степень реализуемости, что определяется присутствием в команде высококвалифицированных исследователей с научным опытом по тематике проекта, наличием необходимой материально-технической, лабораторной базы, а также научным заделом по теме проекта, позволяющим обосновать перспективность использования результатов исследования в клинической практике.
Ожидаемые результаты
Планируемый комплекс исследований позволит получить новую информацию о механизмах взаимодействия между циркадианными ритмами организма и опухоли яичника, механизмах регуляции ответа опухоли на химиотерапию через изменения в экспрессии часовых генов. Будут предложены возможные пути коррекции циркадианных ритмов опухоли и/или организма для повышения эффективности химиотерапии без увеличения токсичности проводимого лечения.
В результате запланированных исследований in vitro и in vivo:
− будет оценено влияние опухолевого процесса на суточные ритмы организма;
− будет проведена оценка суточного ритма экспрессии часовых генов и генов, регулирующих репарацию ДНК в нормальных тканях и в опухоли яичника;
− будет установлено время терапевтического «окна» для наиболее эффективного против опухолевых клеток и одновременно наиболее безопасного по отношению к здоровым тканям химиотерапевтического воздействия;
− впервые будет изучена возможность применения хронобиотиков в сочетании с химиотерапией с целью повышения чувствительности опухоли к проводимому лечению;
− будет оценена потенциальная значимость часовых генов как маркера эффективности и безопасности химиотерапии (системной и локорегиональной);
− будет оценен вклад прямого (на опухоль) и опосредованного (на весь организм) действия химиотерапии, и химиотерапии в сочетании с хронобиотиками в суммарный противоопухолевый эффект комбинированного лечения.
Комплексный характер исследования с применением широкого спектра современных методов позволит получить результаты мирового уровня, которые будут опубликованы в ведущих научных журналах (планируется 9 статей в журналах, индексируемых в Scopus или Web of Science) и представлены на международных конференциях.
Практические результаты работы будут использованы для расширения содержания образовательных курсов и лекций для клинических ординаторов – онкологов; методические разработки будут использованы в новых направлениях НИР студентов и молодежи.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В соответствии с планом работ, в первый год выполнения проекта проведен эксперимент in vivo на модели канцероматоза у крыс с последующей оценкой циркадианных ритмов у животных с опухолью и циркадианных ритмов пролиферации опухолевых клеток. Эксперимент проводился в два этапа.
В первой серии опытов на 24 крысах - самках линии Вистар была проведена оценка суточных ритмов активности крыс (интактных и с опухолью яичников), основой для которой послужили видеозаписи дневной и ночной активности животных в стандартных условиях содержания. Получены данные об фрагментации ритма локомоторной активности у крыс с опухолью яичника по сравнению с животными без опухоли. Ночная активность преобладала над дневной у всех животных, в период «субъективных сумерек» наблюдался рост активности, а в период «субъективного рассвета» – спад активности.
Вторая серия опытов выполнялась на 36 крысах - самках линии Вистар в возрасте 4 месяцев для оценки циркадианных ритмов экспрессии в опухолях и нормальных тканях генов и белков, ответственных за регуляцию суточных ритмов на клеточном уровне.
Выявлено, что ритм пролиферации в опухолевых клетках отсутствует, в то время как в клетках кишечного эпителия здоровых животных максимум митотической активности приходится на ночное и утреннее время, а минимум – на вечер. У крыс с опухолью обнаружено нарушение ритма пролиферации кишечного эпителия.
Проведена оценка суточного ритма экспрессии часовых генов в нормальных тканях яичника и в опухолях. Обнаружено, что среднесуточный уровень экспрессии часовых генов существенно снижен в опухоли по сравнению с нормальной тканью. Возможной причиной является повышенная экспрессия в опухоли онкогена C-myc, который активирует экспрессию репрессора часовых генов REV-ERB alpha. Продолжается оценка уровня экспрессии генов, регулирующих репарацию ДНК, для последующей оценки суточной динамики чувствительности опухолей и нормальных тканей к повреждающему действию цитостатика.
На основании полученных данных по локомоторной активности и ритму пролиферации кишечного эпителия у здоровых животных, выбраны 2 временные точки для проведения химиотерапии в экспериментах in vivo, запланированных на второй и третий год реализации проекта. Экспериментальное воздействие будет проводится в период «субъективных сумерек», когда наблюдался рост локомоторной активности и минимум митотической активности в клетках кишечника, и в период «субъективного рассвета» - спад локомоторной активности и пик пролиферативной активности в клетках крипт кишечника.
По результатам исследования первого года подготовлены 2 статьи:
1. Киреева Г.С., Беляева О.А., Сенчик К.Ю., Беспалов В.Г., Стуков А.Н., Губарева Е.А., Майдин М.А. Асцитная опухоль яичников у крыс – адекватная доклиническая модель канцероматоза для изучения интраперитонеального химиоперфузионного лечения. Современное состояние вопроса. Сибирский онкологический журнал. 2019; 18 (1): 71–78. – doi: 10.21294/1814-4861-2019-18-1-71-78. (Индексируется Scopus).
2. Kireeva G.S., Gubareva E.A., Tyndyk M.L., Maydin M.A., Panchenko A.V., Anisimov V.N. Does tumor development affect circadian rhythms in the tumor bearing animals – experimental study in two animal models (Подана в журнал Chronobiology International. Индексируется WoS, IF 2.64)
Научно-популярная информация о ходе выполнения проекта “Помогут ли часовые гены вылечить рак, выясняют петербургские ученые” доступна на сайте сетевого издания “Доктор Питер”: http://doctorpiter.ru/articles/20448/?fbclid=IwAR0OoXWGGF1mSjoFMXMEuWb2A26PJtUiM0XylK0cXzoSl9oTc1BqwgqlC7Q
Публикации
1. Г.С. Киреева, О.А. Беляева, К.Ю. Сенчик, В.Г. Беспалов, А.Н. Стуков, Е.А. Губарева, М.А. Майдин АСЦИТНАЯ ОПУХОЛЬ ЯИЧНИКОВ У КРЫС – АДЕКВАТНАЯ ДОКЛИНИЧЕСКАЯ МОДЕЛЬ КАНЦЕРОМАТОЗА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ИНТРАПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ХИМИОПЕРФУЗИОННОГО ЛЕЧЕНИЯ СИБИРСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, Том 18, № 1, Стр. 71–78. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.21294/1814-4861-2019-18-1-71-78
2. - Помогут ли часовые гены вылечить рак, выясняют петербургские ученые Сетевое издание «ДокторПитер», - (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В соответствии с планом работ, проведен эксперимент in vitro с синхронизацией клеточных культур дексаметазоном. В расширение изначального плана, использовано три клеточные линии рака яичника и три линии рака легкого человека.
Использовали клеточный анализатор xCELLigence и автоматический клеточный анализатор Cell-IQ . В качестве синхронизирующего агента применяли дексаметазон в концентрации 200 нМ. Показано, что синхронизация клеточных культур дексаметазоном увеличивает их чувствительность к цисплатину. Такой эффект наблюдался в том числе и в резистентных к цисплатину культурах. При этом использование только дексаметазона стимулировало пролиферацию. Таким образом, доказана целесообразность применения препаратов-хронобиотиков для модификации чувствительности опухоли к химиотерапии.
Эксперимент in vivo был выполнен на 36 крысах-самках линии Wistar, которые получали локорегиональное (химиоперфузию) или внутривенное введение цисплатина в начале световой и в начале темновой фазы суток. За 6 животными в каждой группе вели динамическое наблюдение, 3 животных были выведены из эксперимента для отбора тканей и органов. Локорегиональное введение цисплатина обеспечивало преимущества в выживании по сравнению с внутривенным введением, а введение в утренние часы – по сравнению с вечерним. Кроме этого, пролиферативная активность опухолей была наименьшей у крыс с химиоперфузией утром и наибольшей – при внутривенном введении вечером. У крыс после химиоперфузии в начале световой фазы наблюдался наименьший уровень поражения почек, печени и кишечного эпителия по сравнению с группами животных с перфузией вечером или при внутривенном введении цисплатина. В свою очередь, внутривенное введение цисплатина утром оказывало меньший токсический эффект по сравнению с введением вечером.
Дополнительно к изначальному плану работ, был проведен опыт по изучению фармакокинетики цисплатина при химиоперфузии и внутривенном введении с использованием 18 крыс-самок. У 6 животных из группы отбирали кровь по временным точкам, 3 крысам была проведена эвтаназия для забора образцов. Для определения платины в образцах крови и органов использовали метод масс-спекткрометрии с индуктивно связанной плазмой. У животных, получавших внутривенные инъекции препарата, отмечено большее накопление платины в почках, а также большая концентрация не связанной с белками платины в крови.
Таким образом, доказано преимущество химиоперфузионного лечения над внутривенным введением, а также большая эффективность химиотерапии в обоих режимах в утренние часы по сравнению с вечерними.
По результатам исследования второго года было опубликовано или принято в печать 4 статьи.
Публикации
1. Губарева Е.А., Панченко А.В., Майдин М.А., Федорос Е.И., Тындык М.Л., Янус Г.А., Анисимов В.Н., Киреева Г.С. Влияние опухолей молочной железы на суточные колебания экспрессии часовых генов дистантных тканей, не затронутых опухолевым процессом, у мышей Вопросы онкологии, - (год публикации - 2020)
2. Данилова А.Б., Авдонкина Н.А., Губарева Е.А., Балдуева И.А., Зозуля А.Ю., Киреева Г.С. Влияние циркадных ритмов на пролиферацию и химиорезистентность культивируемых клеток солидных опухолей Вопросы онкологии, - (год публикации - 2020)
3. Киреева Г.С., Губарева Е.А., Митюшкина Н.В., Панченко А.В., Майдин М.А., Тындык М.Л., Гаврилов И.В., Круглов С.С., Харченко Е.В., Анисимов В.Н. Исследование циркадианных ритмов на модели опухоли яичников у крыс: есть ли связь между развитием опухоли и нарушением ритмичности в интактных тканях? Вопросы онкологии, - (год публикации - 2019)
4. Киреева Г.С., Губарева Е.А., Майдин М.А., Панченко А.В., Тындык М.Л., Федорос Е.И., Круглов С.С., Осетник В.К., Анисимов В.Н. ОБЗОР ИССЛЕДОВАНИЙ ВЗАИМОСВЯЗИ ЦИРКАДИАННЫХ РИТМОВ И КАНЦЕРОГЕНЕЗА, ВЫПОЛНЕННЫХ НА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МОДЕЛЯХ Сибирский онкологический журнал, - (год публикации - 2020)
5. - Ученые вычислили самое эффективное время работы химиотерапии ТАСС, Опубликовано 13.05.2020 (год публикации - )
6. - Найдено «временное окно» – период, когда химиотерапия эффективнее уничтожает злокачественные опухоли Сайт ФГБУ "НМИЦ онкологии им. Н.Н.Петрова", Опубликовано 12.05.2020 (год публикации - )
7. - Коллектив молодых ученых НМИЦ онкологии стал победителем конкурса на получение гранта РНФ Информационный ресурс ONCOLOGY.ru, http://www.oncology.ru/news/2018/07/13/ (год публикации - )
Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе реализации работ третьего года были проведены все запланированные исследования in vitro и in vivo, а также дополнительное исследование влияния хронобиотика (дексаметазона) на ритмы пролиферации опухолевых клеток и экспрессии в них изучаемых генов in vivo.
Исследования на клеточных культурах показало разнонаправленное действие мелатонина и ингибитора мелатониновых рецепторов лузиндола при их комбинации с цитостатиком (цисплатином) на пролиферацию клеток. Установлено, что мелатонин, также как и дексаметазон в более ранних опытах, способствует повышению чувствительности опухолевых клеток к цитостатику, в то время как лузиндол оказывает протекторное действие. Собственный антипролиферативный эффект у препаратов при их использовании in vitro отсутствовал.
Исследование in vivo было проведено на модели канцероматоза с использованием 90 крыс-самок линии Вистар. Были сформированы контрольные группы с опухолью, а также группы животных, получавших системную или локорегиональную терапию цисплатином. Каждая группа была разделена на варианты, получавшие мелатонин или плацебо.
Исследования показали, что использование мелатонина в качестве хронобиотика при локорегиональной или системной терапии обеспечивает некоторые преимущества в выживаемости экспериментальных животных, которые могут быть отнесены за счет наблюдаемого снижения пролиферативной активности опухолевых клеток, а также снижения повреждающего воздействия цитостатика на кишечный эпителий и почки. Дополнительно, использование хронобиотика полностью нивелировало различи между терапией, проводимой в утренние или вечерние часы, что будет способствовать улучшению результатов лечения в клинической практике.
Молекулярно-генетические исследования третьего года подтвердили ранее наблюдаемый феномен снижения уровня экспрессии часовых генов Per2 и Bmal1 в опухолевых тканях животных по сравнению с нормальными, а также сниженную экспрессию онкогена c-Myc в используемой опухоли яичника, что, по-видимому, связано с ее особенностями. Также выявлено, что применение цисплатина приводило к некоторому увеличению экспрессии p21 (Cdkn1a), который кодирует ингибитор циклин-зависимых киназ и часто рассматривается как ген-супрессор опухолевого роста, а также к снижению уровня экспрессии в яичниках Xpa, одного из ключевых генов репарации ДНК.
Дополнительно проведенные молекулярно-генетические исследования динамики часовых генов in vivo у животных, получавших хронобиотик дексаметазон, показали, что используемая опухоль яичника не восстанавливает суточные ритмы даже при воздействии синхронизирующих агентов, что свидетельствует о глубине нарушений осцилляции системы часовых генов в опухолевых тканях.
По результатам работ третьего года реализации проекта были опубликованы или приняты в печать 5 работ, в том числе 2 – в журналах 1 квартиля (всего 7). Таким образом, проект завершен с превышением заявленного плана работ и достигнутых результатов.
Публикации
1. Губарева Е.А., Панченко А.В., Майдин М.А., Федорос Е.И., Тындык М.Л., Янус Г.А., Анисимов В.Н., Киреева Г.С. НАРУШЕНИЕ СУТОЧНЫХ КОЛЕБАНИЙ ЭКСПРЕССИИ ЧАСОВЫХ ГЕНОВ И СОДЕРЖАНИЯ ЧАСОВЫХ БЕЛКОВ В ОПУХОЛЯХ И ДИСТАНТНЫХ ТКАНЯХ У МЫШЕЙ, ТРАНСГЕННЫХ ПО HER2/NEU Вопросы онкологии, Номер 5, Том 66, с. 572-577 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.37469/0507-3758-2020-66-5-572-577
2. Губарева Е.А., Юрова М.Н., Тындык М.Л., Майдин М.А., Янус Г. А., Егормин П.А., Панченко А.В., Анисимов В.Н. Влияние постоянного освещения и мелатонина на канцерогенез легких, индуцированный уретаном у мышей, и экспрессию часовых генов и белков Вопросы онкологии, - (год публикации - 2021)
3. Киреева Г., Круглов С., Майдин М., Губарева Е., Федорос Е., Зубакина Е., Иваненко Н., Безручко М., Соловьев Н. Modeling of Chemoperfusion vs. Intravenous Administration of Cisplatin in Wistar Rats: Adsorption and Tissue Distribution Molecules, 25(20):4733 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/molecules25204733
4. Киреева Г.С., Губарева Е.А., Майдин М.А., Осетник В.К., Круглов С.А., Панченко А.В., Дорофеева А.А., Тындык М.Л., Федорос Е.И., Анисимов В.Н. Efficacy and safety of systemic and locoregional cisplatin chronotherapy in rats with ovarian carcinoma OncoTargets and Therapy, - (год публикации - 2021)
5. Киреева Г.С., Майдин М.А., Круглов С.С., Губарева Е.А., Зубакина Е.А., Безручко М.М., Иваненко Н.Б., Осетник В.К., Федорос Е.И. Pharmacokinetic advantage of HIPEC with cisplatin over systemic administration of cisplatin Annals of Oncology, - (год публикации - 2021)
6. - Наука против рака: прорывные разработки петербургских ученых ТАСС Информационное Агентство России, Пресс-конференция в ОНЛАЙН-формате, посвященная современным достижениям и исследованиям в области лечения онкологических заболеваний. 09.09.2020 (год публикации - )
7. - Российские ученые определили время суток, когда химиотерапия эффективнее уничтожает опухоли ТАСС, 13 мая (год публикации - )
Возможность практического использования результатов
Практические результаты работы будут использованы для расширения содержания образовательных курсов и лекций для клинических ординаторов – онкологов; методические разработки будут использованы в новых направлениях НИР студентов и молодежи.