КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-75-10039

НазваниеИсследование влияния мутаций в генах, ассоциированных с наследственной гипертрофической кардиомиопатией, на развитие данного заболевания с помощью пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток

РуководительДементьева Елена Вячеславовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук", Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2021 

Конкурс№30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словаНаследственная гипертрофическая кардиомиопатия, мутации, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, кардиомиоциты, саркомер

Код ГРНТИ34.23.27


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Гипертрофическая кардиомиопатия (ГКМП) – заболевание, которое характеризуется нарушением структуры саркомеров кардиомиоцитов, дезорганизацией миофибрилл, утолщением стенки левого желудочка, а также прогрессирующей сердечной недостаточностью, аритмиями и внезапной сердечной смертью. Данное заболевание является одной из наиболее распространенных сердечно-сосудистых патологий (1 случай на 500 человек). Около половины всех случаев ГКМП приходится на наследственную форму, вызываемую мутациями в генах, кодирующих, в основном, саркомерные белки. Ассоциация ряда мутаций с ГКМП была показана благодаря популяционным исследованиям. Однако проведение функционального анализа мутаций и выяснение молекулярного механизма их действия до недавнего времени были затруднены. Исследования мутаций в генах, ассоциированных с наследственной ГКМП, с использованием биопсии сердечной мышцы человека ограничены малой доступностью материала и неспособностью кардиомиоцитов к пролиферации и долговременному поддержанию в культуре. Животные модели (главным образом грызуны) также не являются эффективными для исследования вызывающих ГКМП мутаций из-за различий в саркомерной структуре и электрофизиологических свойствах между кардиомиоцитами человека и животных. Развитие клеточных технологий: получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток и их направленная дифференцировка - позволило получать пациент-специфичные кардиомиоциты в любой момент времени и в необходимых для исследования количествах. Это открыло новые возможности для изучения влияния мутаций в генах, ассоциированных с наследственной ГКМП, на развитие данного сердечно-сосудистого заболевания. Целью данного проекта является изучение влияния мутаций в генах, ассоциированных с наследственной ГКМП, на саркомерную структуру и электрическую стабильность кардиомиоцитов. Выполнение проекта включает следующие этапы: секвенирование клинических экзомов (5300 генов) 15 пациентов с ГКМП; поиск мутаций в генах, ассоциированных с наследственной ГКМП; получение пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, несущих различные типы мутаций (патогенные, нейтральные, с неизвестным статусом); дифференцировку индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты; анализ паттерна распределения саркомерных белков и электрофизиологических свойств пациент-специфичных кардиомиоцитов.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будет проведено секвенирование клинических экзомов (5300 генов) 15 пациентов с гипертрофической кардиомиопатией (ГКМП), проходящих лечение в Национальном медицинском исследовательском центре им. акад. Е.Н. Мешалкина Минздрава России. У пациентов будут выявлены различные варианты мутаций (патогенные, нейтральные, с неизвестным статусом) в генах, ассоциированных с наследственной ГКМП. Будет создана коллекция линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от пациентов с различными типами мутаций, а также будут отработаны методы их направленной дифференцировки в кардиомиоциты. Будет изучена саркомерная структура и динамика концентрации внутриклеточных ионов кальция в пациент-специфичных кардиомиоцитах в сравнении с кардиомиоцитами, полученными аналогичным способом от здоровых доноров. На основании полученных данных будет проверен статус известных мутаций (патогенных и нейтральных), а также установлен статус мутаций, которые ранее не описывались. Пациент-специфичные кардиомиоциты с нарушениями в саркомерной структуре и динамике концентрации внутриклеточных ионов кальция станут платформой для изучения молекулярных процессов, имеющих место при наследственной ГКМП: изменение профиля экспрессии генов, нарушение кальциевого тока L-типа и калиевых токов задержанного выпрямления, удлинение потенциала действия, нарушения в работе саркоплазматического ретикулума.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
С использованием массового параллельного секвенирования клинического экзома (5300 генов) и последующего подтверждения выявленных мутаций методом секвенирования по Сэнгеру проведен генетический анализ 15 пациентов с диагнозом гипертрофическая кардиомиопатия. У 10 пациентов обнаружено 13 мутаций в 4 генах, ассоциированных с данным заболеванием (MYBPC3, MYH7, MYL2, TTR). У двух пациентов были выявлены патогенные мутации: p.Q1233X и p.N515del в гене MYBPC3. Пять пациентов являлись носителями нейтральных мутаций: p.V158M, p.V189I, p.S236G, p.R326Q в гене MYBPC3 и p.G26S в гене TTR. Три пациента имели мутации с неизвестной ролью в развитии гипертрофической кардиомиопатии (p.M659I в гене MYH7, p.S478W в гене MYBPC3 и p.R40K в гене MYL2). Мононуклеарные клетки пациентов с мутациями p.M659I в гене MYH7 (статус не известен) и p.R326Q в гене MYBPC3 (нейтральная мутация) были репрограммированы к плюрипотентному состоянию с помощью нуклеофекции эписомными векторами, экспрессирующими гены OCT4, SOX2, KLF4, L-MYC и LIN28. Полученные клеточные линии имели характерную для плюрипотентных стволовых клеток человека морфологию, экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния (щелочную фосфатазу, транскрипционные факторы OCT4 и NANOG и поверхностные антигены SSEA-4 и TRA-1-60) и были способны дифференцироваться в производные различных зародышевых листков. В полученных клеточных линиях было подтверждено наличие мутаций p.M659I в гене MYH7 и p.R326Q в гене MYBPC3. Таким образом, были получены линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток двух пациентов с гипертрофической кардиомиопатией, являющихся носителями мутаций различного типа.

 

Публикации

1. Дементьева Е.В., Медведев С.П., Коваленко В.Р., Вяткин Ю.В., Кретов Е.И., Слотвицкий М.М., Штокало Д.Н., Покушалов Е.А., Закиян С.М. Applying patient-specific induced pluripotent stem cells to create a model of hypertrophic cardiomyopathy Biochemistry (Moscow), Vol. 84. № 3. P. 291-298 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1134/S0006297919030118

2. Дементьева Е.В., Медведев С.П., Коваленко В.Р., Вяткин Ю.В., Кретов Е.И., Слотвицкий М.М., Штокало Д.Н., Покушалов Е.А., Закиян С.М. Исследование влияния мутаций в генах, ассоциированных с наследственной гипертрофической кардиомиопатией, с помощью пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток Гены и клетки, Т. XIII. № 2-2. С. 65-66. (год публикации - 2018)

3. - Сибирские ученые с помощью стволовых клеток исследуют болезнь сердца Наука в Сибири, № 38 (4 октября 2018 г.), с. 6 (год публикации - )


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Из мононуклеарных клеток пациента с мутацией p.N515del в гене MYBPC3 (потенциальная патогенная мутация) и пациента с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 (роль в развитии гипертрофической кардиомиопатии не ясна) были получены индуцированные плюрипотентные стволовые клетки. Полученные клеточные линии имели характерную для плюрипотентных стволовых клеток человека морфологию, экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния (транскрипционные факторы OCT4 и NANOG и поверхностные антигены TRA-1-60 и SSEA-4) и были способны к спонтанной дифференцировке в производные трех зародышевых листков. Отработан протокол направленной дифференцировки в кардиомиоциты линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с мутациями p.M659I в гене MYH7; p.R326Q в гене MYBPC3; p.N515del в гене MYBPC3; p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1. Полученные в результате направленной дифференцировки клетки были способны спонтанно сокращаться и экспрессировали специфичные для кардиомиоцитов маркеры: кардиальный тропонин Т, саркомерный альфа-актинин, вентрикулярную форму регуляторной легкой цепи бета-миозина. Эффективность направленной дифференцировки пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в кардиомиоциты составила около 40%. Все типы пациент-специфичных кардиомиоцитов имели больший размер по сравнению с кардиомиоцитами здорового донора. Наибольшая степень гипертрофии была характерна для кардиомиоцитов с нейтральной мутацией p.R326Q в гене MYBPC3, наименьшая степень гипертрофии ‒ для кардиомиоцитов с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1, роль которых в развитии гипертрофической кардиомиопатии не известна. Различий в размерах между кардиомиоцитами с потенциальными патогенными мутациями p.M659I в гене MYH7 и p.N515del в гене MYBPC3 обнаружено не было. По сравнению с кардиомиоцитами здорового донора пациент-специфичные кардиомиоциты с мутациями p.M659I в гене MYH7 и p.R326Q в гене MYBPC3 демонстрировали нарушения в динамике потоков ионов кальция.

 

Публикации

1. Дементьева Е.В., Вяткин Ю.В., Кретов Е.И., Елисафенко Е.А., Медведев С.П., Закиян С.М. Генетический анализ пациентов с гипертрофической кардиомиопатией Гены & Клетки, - (год публикации - 2020)

2. Дементьева Е.В., Коваленко В.Р., Живень М.К., Устьянцева Е.И., Кретов Е.И., Вяткин Ю.В., Закиян С.М. Generation of two clonal iPSC lines, ICGi019-A and ICGi019-B, by reprogramming peripheral blood mononuclear cells of a patient suffering from hypertrophic cardiomyopathy and carrying a heterozygous p.M659I mutation in MYH7 Stem Cell Research, - (год публикации - 2020)

3. Дементьева Е.В., Слотвицкий М.М., Вяткин Ю.В., Кретов Е.И., Коваленко В.Р., Медведев С.П., Штокало Д.Н., Закиян С.М. Исследование динамики потоков ионов кальция в кардиомиоцитах, полученных при дифференцировке индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с гипертрофической кардиомиопатией Гены & Клетки, Том XIV, Приложение, С. 74-75 (год публикации - 2019)


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Анализ кардиомиоцитов, полученных при направленной дифференцировке индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с гипертрофической кардиомиопатией (ГКМП) и здорового донора (контроль) показал, что все типы пациент-специфичных кардиомиоцитов имели большую площадь по сравнению с контрольными кардиомиоцитами как на 45-й, так и на 60-й дни дифференцировки. Пациент-специфичные кардиомиоциты были гетерогенны по размеру. Наименьшая степень гипертрофии была выявлена у кардиомиоцитов с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 с неясной ролью в развитии ГКМП. Кардиомиоциты с потенциальными патогенными мутациями p.M659I в гене MYH7 и p.N515del в гене MYBPC3 и нейтральной мутацией p.R326Q в гене MYBPC3 не имели значимых различий в размере и характеризовались большей площадью по сравнению с кардиомиоцитами с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1. Исследование динамики потоков ионов кальция в кардиомиоцитах с потенциально патогенной мутацией p.N515del в гене MYBPC3 и мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 с неясной ролью в развитии ГКМП выявило нарушения в регулярности чередования выбросов ионов кальция из саркоплазматического ретикулума и их обратного захвата. Данные нарушения были впервые обнаружены на 40-45-й дни дифференцировки кардиомиоцитов и наблюдались на последующих этапах дифференцировки. На 40-й день дифференцировки кардиомиоциты с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1, p.R326Q в гене MYBPC3 и p.N515del в гене MYBPC3 характеризовались более высокой внутриклеточной концентрацией ионов кальция на стадии покоя. Наиболее высокая внутриклеточная концентрация ионов кальция в состоянии покоя была обнаружена в кардиомиоцитах с нейтральной мутацией p.R326Q в гене MYBPC3, а наименьшая внутриклеточная концентрация ионов кальция в состоянии покоя – в кардиомиоцитах с мутациями p.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 с неясной ролью в развитии ГКМП. В пациент-специфичных кардиомиоцитах был повышен уровень экспрессии генов, ассоциированных с ГКМП (гены GATA4, MEF2C, NPPA), и генов саркомерных белков (гены MYH7, MYL2, TNNT2) по сравнению с кардиомиоцитами здорового донора. Однако был выявлен ряд различий в паттерне экспрессии этих генов между различными типами пациент-специфичных кардиомиоцитов. Между пациент-специфичными и контрольными кардиомиоцитами не было выявлено значимых различий по уровню экспрессии генов, участвующих в регуляции гомеостаза ионов кальция (гены RYR2, SERCA2, PLN), за исключением снижения уровня экспрессии гена PLN в кардиомиоцитах с потенциально патогенной мутацией p.N515del в гене MYBPC3.

 

Публикации

1. Дементьева Е.В., Вяткин Ю.В., Чернявский А.М., Закиян С.М. Generation of an induced pluripotent stem cell line, ICGi028-A, by reprogramming peripheral blood mononuclear cells of a patient suffering from hypertrophic cardiomyopathy and carrying a heterozygous p.E510Q mutation in HADHA Stem Cell Research, Vol. 53, 102348 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.scr.2021.102348

2. Дементьева Е.В., Павлова С.В., Чернявский А.М., Закиян С.М. Generation of an induced pluripotent stem cell line, ICGi029-A, by reprogramming peripheral blood mononuclear cells of a patient suffering from hypertrophic cardiomyopathy and carrying a heterozygous p.N515del mutation in MYBPC3 Stem Cell Research, Vol. 53, 102344 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.scr.2021.102344


Возможность практического использования результатов
Полученные с помощью дифференцировки пациент-специфичных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток кардиомиоциты с мутациями p.M659I в гене MYH7, p.N515del и p.R326Q в гене MYBPC3, а также р.E510Q в гене HADHA и c.477+1G>A в гене KCNQ1 могут стать основой для дальнейшего изучения молекулярных механизмов развития гипертрофической кардиомиопатии и поиска мишеней для разработки и тестирования лекарственных препаратов и новых подходов к терапии этого заболевания.