Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Настоящий проект направлен на комплексное исследование изменений в системе Toll-подобных рецепторов врожденного иммунитета человека при действии моделируемых факторов космического полёта. В 2018 г., в соответствии с утвержденным по гранту планом, было проведено изучение на молекулярно-клеточном уровне влияния на клетки врождённого иммунитета организма человека моделируемых эффектов микрогравитации в длительной “сухой” иммерсии (СИ) без системы профилактики, а также сопоставление данных с психофизиологическим анализом. В ходе эксперимента испытатели подвергались длительному иммерсионному воздействию, основанному на принципе «сухого» погружения, создаваемого специальной водонепроницаемой и высокоэластичной тканью, в жидкую среду, равную по плотности тканям человеческого организма. Иммерсионное погружение моделирует основные эффекты микрогравитации, такие как: безопорность, снятие локальных весовых нагрузок, близость биомеханических условий организации двигательной деятельности к таковой в невесомости. В данной модели испытатель, одетый в майку и плавки, в положении лежа укладывается на гидроизолирующую ткань и погружается в иммерсионную среду до уровня шеи. Площадь поверхности используемой ткани значительно превышает площадь водной поверхности. При этом складки гидроизолирующего материала вместе с иммерсионной средой, заключенной в них, смыкаются по средней линии тела испытателя, свободно облегая его со всех сторон. Никаких ложементов, которые могли бы служить опорой для тела испытателя в иммерсионной среде, не применяется. Высокоэластичные свойства ткани искусственно повышают плотность жидкости, создавая практически условиях нулевой плавучести. Температура воды в ванне поддерживается постоянной на уровне 33оС. В настоящее время такая форма иммерсии, в которой раскрыты все критические острые влияния сниженной гравитации в различных системах организма, в том числе, и системы иммунитета, получила широкое международное признание. Работы в модели «сухой» иммерсии уже разворачиваются в Европе (Медес, Франция), а по результатам этих исследований опубликовано более 500 научных работ в отечественных и зарубежных рецензируемых изданиях. В проведённом нами исследовании добровольцы-испытатели находились в горизонтальном положении без физических упражнений с умеренным ограничением движений в иммерсионной ванне в течение 21-х суток. Распорядок дня испытуемые был близок к распорядку дня на космической станции и включал 8-часовой сон, трёхразовое питание, по специально разработанному сбалансированному рациону, программу медицинского контроля и экспериментальные исследования. Для проведения санитарно-гигиенических мероприятий 1 раз в сутки испытателей извлекали из иммерсионной ванны не более чем на 15 минут с помощью специального электромеханического подъёмника. Во время проведения санитарно-гигиенических процедур испытатель практически всё время находился в положении лёжа. Эксперимент был полностью проведен в штатном режиме, что позволило получить запланированные на 2018-2019 год научные результаты. В ходе эксперимента был выявлен ряд статистически значимых изменений, затрагивающих абсолютное и относительное содержание моноцитов периферической крови, экспрессирующих TLRs c внутриклеточной и поверхностной локализацией, а также их экспрессию, причем экспрессия внутриклеточных TLRs менялась сильнее, чем поверхностных. Уровень цитокинов в сыворотке крови имел выраженный индивидуальный характер, однако следует отметить, что на 14 сутки происходило значимое повышение содержания всех изученных цитокинов, кроме IL-12 бета и GM-CSF. В остальные сутки наблюдались разнонаправленные изменения, преимущественно с тенденцией к увеличению концентрации цитокинов на протяжении всего иммерсионного воздействия. Анализ цитокин-продуцирующей функции CD14+-моноцитов показал, что спонтанный синтез цитокинов на протяжении СИ достоверно не менялся, однако прослеживается общая тенденция к его снижению на 21 сутки СИ с сохранением тренда до 7 суток после завершения воздействия. При стимулировании клеточных культур моноцитов соответствующими лигандами TLRs на протяжении иммерсии были обнаружены достоверные изменения концентрации TNF-alpha, IL-1 beta, IL-8 и IL-10. В то же время значимых изменений синтеза IL-12 beta, GM-CSF, IL-6 показано не было, а концентрации IFN alpha, IFN gamma достоверно не отличались от концентраций, полученных при спонтанном синтезе цитокинов, взятых в качестве контрольных значений. Интересно, что значимое снижения способности синтезировать цитокины при стимулировании культуры моноцитов коктейлем лигандов TLRs наблюдался за 2 суток до начала эксперимента и затем постепенно повышается на протяжении экспериментального воздействия. Скриниговый анализ экспрессии функциональных групп генов выявил общую тенденцию к увеличению экспрессии изучаемых генов на протяжении эксперимента, эта тенденция наблюдается и при стимуляция моноцитов лигандами TLRs. Представляет интерес наблюдение, что многообразные процедуры, тестирующие состояние здоровья, выполняемые в предэкспериментальном периоде, оказали существенное влияние на систему TLRs, причем изменения иммунологических показателей на 2 сутки до начала СИ коррелировали с уровень тревожности. Кроме того, в ходе проведенного исследования в начале иммерсионного воздействия было отмечено повышение концентрации кортизола в слюне и сыворотке крови, а также содержания норадреналина в плазме крови. Следует отметить, что уже к 7 суткам СИ наблюдалась выраженная тенденция к снижению уровня этих гормонов до фоновых значений. Примечательно, что наибольшая флуктуация иммунологических показателей наблюдается также в данный период. На основании этого можно сделать осторожный вывод о том, что изменения в системе TLR в начальный период СИ и за 2 суток до начала воздействия во многом обусловлены психологическим стрессом, в то время, как начиная с 7 суток СИ полученные изменения вызываются преобладанием эффектов моделирования микрогравитации. Данное предположение планируется проверить во второй год проведения исследований с использованием искусственной силы тяжести в качестве средства профилактики действия моделируемых эффектов микрогравитации. В целом, проведённый эксперимент показал гетерогенную реакцию различных звеньев системы сигнальных образраспознающих рецепторов семейства Toll-like во время пребывания добровольцев-испытателей в условиях 21-суточной “сухой” иммерсии c преобладанием процессов активации, проявляющимися в повышении синтеза цитокинов, экспрессии функциональных групп генов моноцитов периферической крови, и в стимулированных культурах, увеличению экспрессии TLRs моноцитов c поверхностной и внутриклеточной локализацией.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Данный проект направлен на комплексное исследование изменений в системе Toll-подобных рецепторов клеток врожденного иммунитета человека при действии моделируемых факторов космического полёта. В 2019-2020 гг., согласно утвержденному плану, было проведено изучение на молекулярно-клеточном уровне влияния на клетки врождённого иммунитета организма человека моделируемых эффектов микрогравитации в длительной “сухой” иммерсии (СИ) с применением искусственной силой тяжести (ИСТ), создаваемой центрифугой короткого радиуса (ЦКР), а также сопоставление данных с психофизиологическим анализом и результатами полученных в ходе реализации предыдущего эксперимента. В ходе эксперимента испытатели подвергались длительному иммерсионному воздействию, разработанному в 1970-х годах сотрудниками ГНЦ РФ-ИМБП РАН Е.Б. Шульженко и И.Ф. Виль-Вильямс, основанному на принципе «сухого» погружения, а также вращению на ЦКР. Вкратце, можно сказать, что данная модель воспроизводит основные эффекты микрогравитации, включающие в себя безопорность, снятие локальных весовых нагрузок, близость биомеханических условий организации двигательной деятельности к таковой в реальной невесомости. В данной модели испытатель, одетый в майку и плавки, в положении лежа укладывается на гидроизолирующую ткань и погружается в иммерсионную среду до уровня шеи. Никаких ложементов, которые могли бы служить опорой для тела испытателя в иммерсионной среде, не применяется. Высокоэластичные свойства ткани искусственно повышают плотность жидкости, создавая практически условиях нулевой плавучести. Температура воды в ванне поддерживается постоянной на уровне 33оС. В течение 21-х суток испытуемые находились в горизонтальном положении без физических упражнений с ограничением движений в иммерсионной ванне. Таким образом, данная форма иммерсии объединяет 3 эффекта космического полета: гиподинамию, снятие опорных нагрузок и отсутствие вертикального гидростатического градиента. Одним из перспективных средств профилактики влияния эффектов микрогравитации на организм человека может быть ИСТ, создаваемая при помощи ЦКР, которая нивелирует действие факторов невесомости. В настоящее время остаётся открытым вопрос о выборе оптимального режима вращения (время, перегрузка) с точки зрения максимального профилактического действия и минимизации побочных эффектов. В проведённом эксперименте в условиях СИ был использован режим воздействия перегрузок +Gz на уровне стоп до 2,0 ед. Ознакомительные вращения на ЦКР испытателей осуществлялись за -9 суток до начала эксперимента. В ходе эксперимента вращения осуществлялись на 1, 4, 7, 10, 14, 17 и 21 сутки СИ. В проведённом исследовании распорядок дня добровольцев-испытателей был таким же, как и в предыдущем эксперименте и включал 8-часовой сон, трёхразовое питание, по специально разработанному сбалансированному рациону, программу медицинского контроля и экспериментальные исследования. Для проведения санитарно-гигиенических мероприятий 1 раз в сутки испытателей извлекали из иммерсионной ванны, не более чем на 15 минут, с помощью специального электромеханического подъёмника. Во время проведения санитарно-гигиенических процедур испытатель практически всё время находился в положении лёжа. Суммарное время нахождения испытателя вне иммерсионных условий в дни вращения на ЦКР с учётом описанных выше гигиенических процедур составляло порядка 1 часа 25 минут. Кроме того, во время реализации Проекта были получены и опубликованы данные о содержании в периферической крови клеток врождённого иммунитета - моноцитов и гранулоцитов, экспрессирующих TLRs c внутриклеточной и поверхностной локализацией, у шести добровольцев-испытателей, участников эксперимента с 17-суточной изоляцией в гермообъекте, проведённом на базе Наземного экспериментального комплекса (НЭК) ГНЦ РФ-ИМБП РАН, представляющим собой четыре герметичных металлических цилиндра, объёмом 50, 100, 150 и 250 м3 расположенных горизонтально на опорах и соединенных между собой переходными тоннелями, снабженными герметичными люками. В НЭКе создается избыточное давление для исключения проникновения воздуха снаружи, атмосфера внутри комплекса циркулирует, проходя тонкую очистку специальными фильтрующими элементами. НЭК позволяет моделировать гиподинамию, искусственную среду обитания, идентичную по своим параметрам таковой на МКС, и, собственно, изоляцию от внешней среды. Говоря об эксперименте с СИ с применением ЦКР, можно отметить, что в ходе исследования, так же как и в СИ без профилактики, наблюдалось значительное различие между первым и вторым фоном практически по всем изученным параметрам (содержанию клеток, экспрессирующих TLRs с внутриклеточной и поверхностной локализацией, содержанию цитокинов в супернатантах клеточных культур, экспрессии генов сигнальных путей TLRs), причём ко второму фону (2 сутки до начала эксперимента) сильно нарастал уровень тревожности, что характерно не только для двух новых испытателей, но и для тех, кто уже принимал участие в 21-суточном исследовании. Как и в проведённом эксперименте с СИ без средств профилактики, в эксперименте с применением ЦКР не наблюдалось выраженного изменения абсолютного содержания моноцитов, при этом относительное содержание моноцитов периферической крови также имело тенденцию к снижению, за исключением 7 суток, когда их относительное число возрастало по сравнению с фоновым значением. Динамика изменения относительного и абсолютного содержания моноцитов, экспрессирующих TLRs с внутриклеточной и поверхностной локализацией, характеризовалась достаточно высокой индивидуальной вариабельностью, однако для всех изученных субпопуляций моноцитов, экспрессирующих TLRs, было показано, что ко второй фоновой точке происходит значительное изменение числа клеток, а также экспрессии ими соответствующих маркёров, причём изменения для подавляющего большинства рецепторов отмечены в сторону снижения изученных показателей. Сравнивая результаты СИ без средств профилактики и СИ с применением ИСТ в качестве профилактической меры, можно сделать предварительный вывод о том, что среди изученных параметров набольшее количество совпадений в динамике было характерно для уровня экспрессии TLRs как с поверхностной, так и внутриклеточной локализацией. Совпадение динамики по относительному и абсолютному содержанию клеток в двух проведённых экспериментах не наблюдалось. Уровень всех цитокинов - IL-1-бета, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-альфа, IFN-гамма, IFN-альфа, GM-CSF в сыворотке крови, менялся на протяжении эксперимента, причём для всех измеряемых цитокинов характерно снижение за двое суток до начала воздействия. Кроме того следует отметить тенденцию к снижению уровня практически всех цитокинов в условиях 21-суточного пребывания в условиях СИ с применением ЦКР в качестве средства профилактики, кроме IL-6 и IL-8, концентрация которых во время эксперимента повышалась по сравнению с седьмыми сутками до начала СИ. Спонтанный синтез цитокинов клеточными культурами на протяжении всего эксперимента отличался тенденцией к увеличению почти для всех изученных цитокинов, за исключением Il-8, уровень которого снижался по сравнению с фоновым значением. Полученные в эксперименте с СИ с применением ИСТ данные отличаются от того, что было получено в предыдущем эксперименте, в котором в клеточных культурах спонтанный синтез имел тенденцию к снижению во время экспериментального воздействия. При стимулировании клеточных культур моноцитов соответствующими лигандами TLRs индуцированный синтез цитокинов носил ярко выраженный индивидуальный характер на протяжении всего эксперимента, что не позволяет в настоящее время сделать какой-либо однозначный вывод относительно намечающихся тенденций. Проведённый анализ скрининга функциональных групп генов, ассоциированных с возбуждением TLRs, выявил общую тенденцию к увеличению экспрессии изучаемых генов на протяжении эксперимента, эта тенденция наблюдалась и при стимуляции моноцитов лигандами TLRs. По данным анализа акустических характеристик речи, применение ЦКР, предположительно, повлияло на выраженность (в сторону уменьшения) и продолжительность (в сторону увеличения) острого периода адаптации к иммерсии. В те дни эксперимента, когда осуществлялись вращения на ЦКР, отмечалось повышение уровня тревожности перед воздействием (с нормализацией после), а также снижение ряда когнитивных функций (зрительно-моторные реакции, счёт) после вращения тревожность значительно повышалась ко второму фону (за 2 суток до начала эксперимента) и постепенно снижалась, выходя на плато к 14 суткам, но не достигая фонового значения до начала эксперимента. Динамика электрокожного сопротивления была сопоставима с таковой в эксперименте с 21-суточной СИ без использования средств профилактики, указывая на развитие повышенного уровня возбуждения и тревожности перед началом иммерсионного воздействия и сведение данных показателей к минимуму в период последействия.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Данный проект направлен на комплексное исследование изменений в системе Toll-подобных рецепторов клеток врожденного иммунитета человека при действии моделируемых факторов космического полёта. В проекте использовалось такие модели как “сухая” иммерсия и изоляция в гермообъекте с искусственной средой обитания. В отчётном периоде было проведено изучение влияния длительной и кратковременной изоляции на состоянии TLRs клеток врождённого иммунитета. Эксперимент со 120-суточной изоляций был проведён в Наземном экспериментальном комплексе (НЭК), являющегося частью уникальной научной установки (УНУ) Медико-технический комплекс для отработки инновационных технологий космической биомедицины в интересах обеспечения орбитальных и межпланетных полётов, а также развития практического здравоохранения. НЭК предназначен для проведения научных экспериментов с участием человека в условиях искусственно регулируемой среды обитания. Он проектировался и создавался в 1964-1970 гг., как макет тяжелого межпланетного корабля и предназначался для максимально реалистичного моделирования полета на Марс и других сверхдлительных пилотируемых космических миссий. На протяжении 30 лет комплекс использовался в экспериментах с участием человека, а также в испытаниях систем обеспечения жизнедеятельности (СОЖ) для орбитальных станций и других космических летательных аппаратов. Уникальность НЭК ГНЦ РФ-ИМБП РАН заключается в том, что в каждом модуле имеется возможность создавать свои условия среды обитания, включая давление, температуру, влажность, освещенность, газовый состав. Полных аналогов НЭК не существует как в России, так и за рубежом. В эксперименте приняло участие шесть здоровых добровольцев-испытателей в возрасте от 28 до 44 лет, сформировавших экипаж корабля моделируемой космической миссии. В состав экипажа входили командир, врач, бортинженер и исследователи. Все принимавшие участие в эксперименте добровольцы-испытатели имели допуск врачебно-экспертной комиссии (ВЭК) и подписали Информированное согласие на участие в эксперименте в соответствии с Хельсинкской декларацией. Испытуемые не имели каких-либо хронических и острых заболеваний, в том числе, инфекционного генеза, которые могли бы повлиять на результаты исследования. Все участники эксперимента проходили обследование до и после эксперимента на базе клинической больницы №1 Управления делами Президента РФ (Волынская больница). Во время проведения эксперимента добровольцы-испытатели находились под круглосуточным наблюдением специалистов дежурной бригады, состоящей из врача, лаборанта, инженера и техника. Главная задача дежурной бригады заключалась в обеспечении нормального функционирования НЭК, мониторинг состояния здоровья испытателей, а также отслеживание параметров среды и соблюдение испытуемыми распорядка дня. Во время проведения эксперимента обеспечивались следующие условия: - значение температуры воздуха в от 22 до 25 градусов С; - значение содержания кислорода от 18 до 21%; - значение содержание углекислого газа в ЭУ-50 от 0 до 0,2%; - уровень освещённости в рабочей зоне не менее 400 лк; - содержание микроорганизмов в атмосфере не превышало 500 микробных клеток (мк) в 1 м3, а содержание микроорганизмов на поверхностях – 100 мк в 1 м3. - скорость движения газовой среды было не более 0,3 м/с. В ходе реализации Проекта были получены и опубликованы данные, характеризующие состояние системы врождённого иммунитета у шести добровольцев-испытателей в возрасте от 28 до 44 лет, участников эксперимента со 120-суточной изоляцией в гермообъекте с искусственной средой обитания. В ходе эксперимента в периферической крови определяли содержание моноцитов и гранулоцитов, экспрессирующих TLR с внутриклеточной (TLR3, TLR8, TLR9) и поверхностной (TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6) локализацией, а также содержание лимфоцитов-естественных киллеров с фенотипом CD3-CD16+CD56+. Была выявлена гетерогенная реакция системы образ-распознающих рецепторов клеток врождённого иммунитета на условия изоляции с преимущественной активацией на протяжении всего экспериментального воздействия. Выявленные изменения, по-видимому, являются отражением комплексного адаптационного процесса, происходящего в системе иммунитета человека во время установления динамического равновесия с экстремальными факторами среды обитания, включающие реакции на эндогенные и экзогенные иммунные стимулы. В ходе эксперимента определялась концентрация цитокинов (IL-1-бета, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-альфа, IFN-гамма, IFN-альфа, GM-CSF) в сыворотке крови. Было показано, что концентрация цитокинов меняется на протяжении всего эксперимента, причём изменения отмечались как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения их концентрации. Интересно, что динамика изменения концентрации IFN-гамма, IFN-альфа, GM-CSF и IL-10 совпадала, в то время как изменение концентрации других изучаемых цитокинов носила индивидуальный характер. На 7 сутки эксперимента было показано достоверное снижение всех изучаемых цитокинов за исключением IL-12 и IL-8. Для последних двух интерлейкинов было отмечено снижение их концентрации при отсутствии достоверных изменений. На 14 сутки было также отмечено достоверное изменение концентрации цитокинов за исключением TNF-альфа, IL-8 и IL-12, причём в случае Il-12 было показано увеличение его концентрации. В период с 29 по 63 сутки не было показано достоверных изменений концентрации всех изучаемых цитокинов, однако начиная с 63 и вплоть до завершения эксперимента с сохранением тенденции и в период последействия было показано резкое увеличение концентрации всех цитокинов, за исключением IL-6 и IL-1 бета, содержание которых в этот период достоверно не изменялось. Спонтанный синтез цитокинов в культурах моноцитов, выделенных из периферической крови, достоверно не изменялся до 57 суток эксперимента, после которых было показано достоверное снижение содержания всех пептидов за исключением Il-1 бета. Говоря о синтезе цитокинов в клеточных культурах при стимулировании TLRs соответствующими лигандами (TLR1 Agonist: Pam3CSK4, TLR2 Agonist: HKLM TLR3 Agonist: Poly(I:C), TLR4 Agonist: LPS-EK, TLR5 Agonist: FLA-ST standard (Flagellin S. typhimurium), TLR6 Agonist: FSL1, TLR7 Agonist: Imiquimod, TLR8 Agonist: ssRNA40/LyoVec, TLR9 Agonist: ODN2006), можно отметить разнонаправленные изменения на разные сутки эксперимента, однако достоверные различия были выявлены только в случае снижения их продукции. Проведённый анализ скрининга функциональных групп генов, ассоциированных с возбуждением TLRs, выявил общую тенденцию к увеличению экспрессии изучаемых генов на протяжении эксперимента, эта тенденция наблюдалась и при стимуляции моноцитов лигандами TLRs. По данным анализа акустических характеристик речи отмечалось повышение уровня тревожности перед воздействием (с нормализацией к 14 суткам эксперимента). Выявлены особенности динамики параметров коммуникации (акустические параметры речи, выражение базовых эмоций в мимике) в ходе изоляции, предположительно отражающие процессы адаптации членов экипажа к экспериментальным условиям. Данные процессы, по имеющимся представлениям, включают в себя автономизацию экипажа и нарастание психической астенизации. Кроме того, выявлены различия по данным показателям между различными по гендерному признаку подгруппами экипажа, проявляющиеся несмотря на выраженность индивидуальных различий. Однако, по ряду изученных параметров отмечалось уменьшение различий между данными подгруппами экипажа, что может указывать на повышение его психологического единообразия и сплочённости в ходе автономизации. Динамика электрокожного сопротивления указывала на развитие повышенного уровня возбуждения и тревожности перед началом изоляционного воздействия. В ходе проведённого эксперимента не было отмечено влияния тренировочного цикла на систему TLRs клеток врождённого иммунитета. Также в отчётном периоде был проведён эксперимент с 14-суточной изоляцией в гермообъекте. В ходе эксперимента было отмечено достоверное увеличение относительного и абсолютного содержания CD14+ клеток врождённого иммунитета на 3, 7 и 14 сутки, а также на 7 сутки после завершения эксперимента. Количество моноцитов (в абсолютных и относительных значениях), экспрессирующих на своей мембране TLR1 значимо уменьшалось за двое суток до начала экспериментального воздействия, а затем достоверно увеличивалось к 3 суткам исследования. Количество моноцитов, экспрессирующих TLR4 также достоверно снижалось за 2 суток до начала эксперимента с постепенным повышением к его завершению. Такие же изменения характерны и для гранулоцитов, как в абсолютных, так и относительных величинах. Значимых изменений содержания, как моноцитов, так и гранулоцитов, экспрессирующих другие TLRs обнаружено не было, равно как и изменений экспрессии данных маркёров, однако прослеживалась чёткая тенденция к снижению за двое суток до начала эксперимента с постепенным возрастанием к 14 суткам экспериментального воздействия. Как и в других проведённых экспериментах, анализ функциональных групп генов выявил тренд к увеличению их экспрессии. Уровень тревожности повышался перед началом эксперимента, что следует из акустического анализа речи, а также психологических опросников.