Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках выполнения Проекта в 2018 году было проведено полногеномное секвенирование двенадцати штаммов Bacillus thuringiensis, относящихся к трем разным серотипам: var. thuringiensis, var. darmstadiensis и var. israeliensis. Секвенирование было осуществлено с использованием двух разных технологий: Illumina HiSeqX, которая позволяет получить большое количество коротких точных прочтений, и Oxford Nanopore, которая позволяет получить очень длинные прочтения, но с большим количеством ошибок, чем Illumina. Полученые длинные прочтения были использованы для получения de novo предварительных сборок геномов. После нескольких этапов коррекций ошибок с применением как длинных прочтений, так и коротких, были получены сборки геномов с низкой частотой ошибок. Для некоторых штаммов удалось получить полную сборку генома, при которой один контиг соответствует одному репликону. Так, полученная в ходе выполнения работы по проекту сборка генома B. thuringiensis var. darmstadiensis является лучшей и наиболее полной из публично доступных сборок для данного серотипа. Кодирующие белок последовательности в геномах исследуемых штаммов были аннотированы, и в них осуществлен поиск генов, кодирующих токсины Cry. Поскольку токсины отличаются высокой вариабельностью, для поиска кодирующих их генов в рамках Проекта была разработана специальная программа, основанная на использовании скрытых марковских моделей (Hidden Markov Model, HMM). Данная программа позволяет проводить поиск токсинов Cry в массиве белковых последовательностей и осуществлять аннотацию их доменной структуры. Точность предсказания и скорость работы данной программы превосходит имеющиеся мировые аналоги. С ее помощью удалось выявить репертуар токсинов Cry, которые могут продуцировать исследуемые бактерии B. thuringiensis. Было установлено, что штаммы, относящиеся к серотипам var. thuringiensis и var. israeliensis, содержали в своем геноме несколько генов, кодирующих токсины Cry, в то время как штаммы var. darmstadiensis несли только один ген, кодирующий токсин Cry, который по литературным данным обладает в основном нематоцидной активностью. Таким образом, можно сделать вывод, что инсектицидная активность B. thuringiensis var. darmstadiensis связана с другими токсинами, не относящимися к группе Cry. Последовательности токсинов были сравнены между собой, и было установлено, что между штаммами одного серотипа они полностью идентичны, в том числе нуклеотидном уровне, что может говорить о происхождении этих штаммов из одного источника. В то же время токсины из разных серотипов различались на более чем 30%, что может говорить о том, что адаптация к разным хозяевам затрагивает большое количество позиций в аминокислотной последовательности токсинов. Также нами было установлено, что утрата штаммами серотипа var. israeliensis способности формировать кристаллы при спорообразовании, связана с утратой ими плазмиды, на которой локализованы гены, кодирующие все три токсина Cry у этих штаммов. Таким образом, в 2018 году нами было проведено полногеномное секвенирование 12 штаммов B. thuringiensis, получены de novo сборки их геномов, в некоторых случаях, превосходяющие по своему качеству имеющиеся в публично доступных базах данных, и определен репертуар токсинов Cry, которые определяют видоспецифичность действия данных штаммов в отношении насекомых. Также была разработана новая программа для поиска и аннотации токсинов Cry, которая по точности предсказания и скорости работы превосходит имеющиеся мировые аналоги. Идентификация генов, кодирующих токсины Cry в исследуемых штаммах, позволила перейти к экспериментальному изучению видоспецифичности их действия. Публикация по результатам выполнения Проекта в 2018 году: 1. Malovichko Y.V., Afonin A.A., Belousova M.E., Ermolova V.P., Grishechkina S.D., Nizhnikov A.A., Antonetz K.S. Comparative genomics of the insecticidal bacterium Bacillus thuringiensis using Oxford Nanopore sequencing // Mol. Biol. Cell, 2018, V.28, P611 (Abstract P3470) (Abstracts of ASCB/EMBO Meeting 2018, San Diego, USA)

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Выполнение работы по Проекту в 2019 году было посвящено экспериментальному изучению токсинов Cry, выявленных в геномах Bacillus thuringiensis в ходе выполнения первого года работы. Было опробовано несколько разных методов выделения и очистки рекомбинантных токсинов Cry и был выбран тот, который обеспечивал наработку достаточного количества белка для проведения экспериментов. Также был выбран оптимальный штамм-продуцент E.coli. В то же время, хотя метод выделения и очистки рекомбинантных белков обеспечивал необходимое количество рекомбинантных токсинов Cry, было показано, что в ходе получения белков происходит нарушение их пространственной структуры, что приводит к утрате их активности. Для оптимизации действия токсина Cry против нового вида насекомого была выбрана последовательность Cry1Ab12, токсина, который по литературным данным обладает специфичным действием в отношении насекомых отряда Lepidoptera, но не Diptera. Были предсказаны пространственные структуры токсинов Cry1Ab12 и Cry4Ba1 (последний был выбран, как токсин, активный в отношении Diptera) и потенциального рецептора аминопептидазы N APN1 A. aegypti. Затем были предсказаны структуры комплексов Cry1Ab12-APN1 и Cry4Ba1-APN1. Было установлено, что комплексы токсинов Cry1Ab12 и Cry4Ba1 с рецептором APN1 обладали существенным структурным сходством, несмотря на существенные различия в аминокислотной последовательности этих токсинов Cry. На основании структуры комплекса Cry1Ab12-APN1 были отобраны позиции белка Cry1Ab12, которые расположены на поверхности взаимодействия с рецептором APN1. С помощью перебора аминокислот в этих положениях был предсказан ряд замен в белке Cry1Ab12, которые приводили к стабилизации комплекса, и таким образом позволяли получить последовательность токсина Cry1Ab12, оптимизированию для взаимодействия с аминопептидазой N A. aegypti. Высокое сходство структур комплекса Cry1Ab12-APN1 и комплекса специфичного в отношении насекомых отряда Diptera токсина Cry4Ba1 и APN1 позволяет предполагать, что наличие ряда стабилизирующих замен на поверхности взаимодействия токсина с рецептором должно быть достаточно для повышения активности соответствующего токсина Cry в отношении требуемой группы насекомых. Полученный токсин обладал слабой активностью против личинок комара A. aegypti, позволяющей сделать заключение об изменении спектра хозяев после произведенной модификации первичной структуры данного белка. В целом, полученные в ходе второго года выполнения Проекта результаты позволяют сделать вывод о возможности применения программных средств для оптимизации последовательностей токсинов Cry с целью повышения их активности в отношении заданых групп насекомых, что открывает широкие перспективы для сельского хозяйства и биотехнологии в контексте создания биологических препаратов нового поколения с заданным диапазоном специфичности действия в отношении конкретных групп насекомых. Публикации по результатам выполнения второго этапа Проекта: 1. Malovichko Y.V., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Repertoire of the Bacillus thuringiensis virulence factors unrelated to major classes of protein toxins and its role in specificity of host-pathogen interactions // Toxins, 2019, V.11, e347. https://doi.org/10.3390/toxins11060347 (импакт-фактор 3,895, Q1) 2. Shikov A.E., Malovichko Yu.V., Skitchenko R.K., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. No More Tears: Mining Sequencing Data for Novel Bt Cry Toxins with CryProcessor // Toxins, 2020, V12(3), e204, https://doi.org/10.3390/toxins12030204 (импакт-фактор 3,895, Q1) 3. Белоусова М.Е., Гришечкина С.Д., Ермолова В.П., Антонец К.С., Марданов А.В., Ракитин А.Л., Белецкий А.В., Равин Н.В., Нижников А.А. Секвенирование генома штамма Bacillus thuringiensis var. darmstadiensis 56 и изучение инсектицитдной активности биологического препарата на его основе // Сельскохозяйственная биология, 2020, Т.55(1), с. 87-96, https://doi.org/10.15389/agrobiology.2020.1.87rus (импакт-фактор 0,47) 4. Malovichko Yu.V., Shikov A.E., Skitchenko R.K., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Revealing mechanisms of Bacillus thuringiensis host specificity via molecular modelling of the Cry toxin-receptor interactions // BMC Bioinformatics, 2019, V.20 (Suppl 17), 516, https://doi.org/10.1186/s12859-019-3122-9 (импакт-фактор 2,511, Q1) 5. Malovichko Yu.V., Afonin A.M., Belousova M.E., Nizhnikov A.A., Antonets K.S. Long-read sequencing of Bacillus thuringiensis strains reveals genome rearrangements affecting their virulence effectiveness // FEBS Open Bio, 2019, 9 (Suppl. 1), pp. 65-431, https://doi.org/10.1002/2211-5463.12675 (импакт-фактор 2,021).