Аннотация результатов, полученных в 2019 году
1. В рамках первого года была разработана модель активации тромбоцитов молекулами фактора фон Виллебранда (VWF) в условиях нестационарных сдвиговых напряжений. Модель позволила получить условие динамической активации тромбоцитов. Условие заключается в том, что для активации тромбоцитов величина кумулятивного напряжения сдвига должна превышать определенное критическое значение. Для величины критического значения была получена явная асимптотическая зависимость от степени мультимерности молекулы VWF. Результаты, полученные с помощью разработанной модели активации, представлены в двух статьях. Первая статья уже принята к публикации в журнале «Физика твёрдого тела» (а также её английский перевод в журнале «Physics of the Solid State»), вторая статья направлена в журнал «Scientific Reports». На основании построенной модели произведена модификация расчетного модуля активации тромбоцитов, разработанного в рамках ранее выполненного проекта РНФ 14-14-00990. Расчетный модуль запущен в эксплуатацию и позволяет рассчитывать активацию тромбоцитов в трехмерных объектах сложной геометрии в условиях интенсивной гемодинамики, в том числе, в условиях нестационарных сдвиговых напряжений. В рамках выполнения данного проекта, расчетный модуль планируется использовать для определения параметров геометрии и кровотока, наиболее сильно влияющих на активацию тромбоцитов в крупных сосудах и в аппаратах вспомогательного кровообращения. 2. Была создана математическая модель, описывающая тромбирование капиллярных сетей и сосудистых сплетений (сосудистые узлы, мальформации). Возможные сценарии развития тромботических осложнений, развивающихся ниже по потоку от очага активации свёртывания крови, были исследованы в рамках модели численными методами. Проведены серии вычислительных экспериментов в ряде модельных геометрий капиллярного русла. Определены основные сценарии процессов централизации кровообращения при тромбировании периферических капиллярных сосудов. Найдены характерные времена падения объёмного потока ниже критического значения. Проведены серии вычислительных экспериментов для модельных сосудистых сплетений. Было показано, что характер динамики тромбирования сосудистых сплетений определяется степенью асимметрии их ветвления. Выявлена зависимость величины порогового уровня концентрации активированных тромбоцитов, способного спровоцировать локальное тромбообразование, от степени асимметрии геометрического строения сосудистого сплетения. Полученные результаты планируется опубликовать в рецензируемом журнале в следующем году работы по проекту. В процессах активации тромбоцитов и развития сосудистых мальформаций задействована система внутриклеточной сигнализации PI3K-Akt-mTOR [Li et al., 2010; Guidetti et al., 2015; Martinez-Lopez et al., 2019]. Имеются данные о подавлении адгезии тромбоцитов и образования тромба в результате ингибирования белков каскада [Später et al., 2018]. С учётом этого были проанализированы процессы внутриклеточной активации тромбоцитов, опосредованные сигнальным каскадом PI3K-Akt-mTOR, с точки зрения теории устойчивости и теории катастроф. Была построена феноменологическая модель активации сигнальной трансдукции в рассматриваемом каскаде. Проведённый анализ позволил понизить размерность задачи с семи до трёх. Установлено, что сигнальный каскад PI3K-Akt-mTOR способен активироваться пороговым образом. Показано, что триггерные явления в динамике данной системы внутриклеточной сигнализации описываются элементарной катастрофой типа «складка». В терминах истинных параметров задачи было получено выражение для величины уровня пороговой стимуляции. Найдены параметры рассматриваемой системы, изменения которых способны критически влиять на понижение порога активации тромбоцитов. Результаты были изложены в статье, которая принята к печати в рецензируемом журнале, входящем в базу данных Скопус. 3. Выполнена валидация математических моделей тромбообразования с помощью in vitro экспериментов по активации тромбоцитов в сдвиговом потоке. Исследовано влияние мультимерности фактора фон Виллебранда на активацию тромбоцитов в контролируемых сдвиговых течениях, обеспечиваемых вискозиметром Брукфильд CAP 2000+. В результате проведенных экспериментальных работ были построены параметрические диаграммы агрегации тромбоцитов от скорости сдвига и концентрации добавляемого VWF с фиксированным распределением по мультимерности, отделяющие зоны микро- и макроагрегации от жидкого состояния. Был создан алгоритм для обработки микроснимков методом кластеризации, с помощью которого была построена зависимость размеров тромбоцитарных агрегатов от скорости сдвига при гидродинамическом воздействии. 4. Отработана методика изготовления силиконовых отливок, моделирующих сложные анатомические особенности артериовенозных фистул (с помощью 3D печати). Выполнены пробные валидационные in vitro эксперименты по активации тромбоцитов в экспериментальной системе с силиконовыми отливками. В рамках работы по проекту была отработана методика, позволяющая изготавливать силиконовые отливки, с высокой точностью моделирующие персонализированные особенности сосудистого русла, в том числе артериовенозные фистулы. Благодаря использованию технологии 3D-печати удалось произвести реконструкцию внутренней поверхности сосудов с точностью порядка 100 микрометров. Полученные в результате реконструкции мастер-модели были использованы для отливки блоков из высококачественного силикона, пригодных для экспериментов in vitro. Такие блоки модульным образом были включены в систему, описанную в работе [Ivlev et al. 2019]. Были проведены пробные эксперименты по активации тромбоцитов в условиях интенсивной гемодинамики, показавшие пригодность экспериментальной системы для решения такого рода задач. На следующих этапах работы по проекту развитая методика будет использована для валидации широкого спектра гидродинамических расчетов, благодаря вариативности отлитых в силиконе геометрий сосудов. Достигнутые в ходе исследований научные результаты были широко представлены на всероссийских и международных научных мероприятиях. Список цитируемых источников Li Z, Delaney MK, O'Brien KA, Du X. Signaling during platelet adhesion and activation. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology. 2010 Dec 1;30(12):2341-9. Guidetti GF, Canobbio I, Torti M. PI3K/Akt in platelet integrin signaling and implications in thrombosis. Advances in biological regulation. 2015 Sep 1;59:36-52. Martinez-Lopez A, Salvador-Rodriguez L, Montero-Vilchez T, Molina-Leyva A, Tercedor-Sanchez J, Arias-Santiago S. Vascular malformations syndromes: an update. Current opinion in pediatrics. 2019 Dec 1;31(6):747-53. Später T, Müller I, Eichler H, Menger MD, Laschke MW, Ampofo E. Dual inhibition of PI3K and mTOR by VS-5584 suppresses thrombus formation. Platelets. 2018 Apr 3;29(3):277-87. Ivlev DA, Shirinli SN, Guria KG, Uzlova SG, Guria GT. Control of fibrinolytic drug injection via real-time ultrasonic monitoring of blood coagulation. PloS one. 2019 Feb 27;14(2):e0211646. Информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: http://in-silico.ru http://guria-lab.ru

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Было проведено численное моделирование гидродинамической активации тромбообразования в контактирующих с кровью устройствах, работающих в условиях интенсивной гемодинамики. В качестве исследуемых объектов выступали модели аппаратов вспомогательного кровообращения и входных канюль, разработанных Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (Food and Drug Administration, FDA) для научных целей. Геометрии этих моделей находятся в открытом доступе [Malinauskas et al., Asaio Journal, 2017]. Результаты моделирования активации тромбообразования позволили выявить конкретные особенности указанных устройств, в наибольшей степени определяющие их вклад в повышение тромбогенности. Так, оказалось, что объектах типа входных канюль гидродинамическая активация тромбообразования обусловлена, главным образом, наличием зон повышенных напряжений сдвига вблизи стенок, в то время как в аппаратах вспомогательного кровообращения основной вклад в активацию тромбоцитов обуславливается наличием зон объемной активации тромбоцитов в кровотоке. Кроме того, была исследована зависимость степени активации тромбоцитов от интенсивности кровотока (числа Рейнольдса). Было показано, что во всём диапазоне чисел Рейнольдса, интересующем разработчиков подобных аппаратов должна иметь место значительная степень активации тромбоцитов. Это означает, что уменьшение интенсивности кровотока в пределах рабочего диапазона не является эффективным способом борьбы с развитием тромботических осложнений в изученных устройствах. Результаты по данному направлению исследований были изложены в принятой к печати публикации, готовящейся к выходу в следующем году [Пушин и др., в печати]. 2. Была выполнена верификация одномерных моделей гидродинамической активации тромбообразования в сосудах, содержащих стенозированные участки. Верификация проводилась путем сравнения результатов расчета степени активации тромбоцитов, полученных с помощью одномерных и трехмерных моделей. Оказалось, что расхождения малы, если стеноз имеет осесимметричную форму, а режим течения является ламинарным. В ситуации, когда указанные условия выполнены, использование 1D подхода позволяет значительно сократить времена, требуемые для проведения численных экспериментов по исследованию активации тромбообразования в больших сегментах сосудистого русла (включающих десятки и сотни сосудов). 3_1. Методами теории динамических систем и вычислительной математики была построена параметрическая диаграмма активации тромбоцитов молекулами фактора фон Виллебранда (VWF) в условиях нестационарных сдвиговых напряжений. Данная диаграмма позволяет определять вероятность активации тромбоцита молекулами VWF заданной длины, если известны характеристики сдвигового импульса (амплитуда, длительность). По результатам работы опубликована статья в журнале PLOS ONE [Pushin et al. 2020]. 3_2. Использовался насос Bio-Medicus 550 системы Medtronic, работающий по принципу создания завихрения потока при помощи серии вращающихся конусов с гладкой поверхностью. Конусы приводятся в движение внешним магнитом. Данная модель насоса может вызывать гематологические осложнения такие, как гемолиз и тромбоэмболия [Yu et al., 2011]. Методами численного моделирования были рассчитаны напряжения сдвига и распределение активированных тромбоцитов в аппаратах вспомогательного кровообращения. Выяснилось, что в аппаратах типа Bio-Medicus 550 должны возникать области с высоким напряжением сдвига на выходе из области завихрения. По нашим расчетам активированные в головке насоса тромбоциты должны запускать процессы тромбообразования в системе ниже по потоку. В тех случаях, когда система свертывания дополнительно предактивирована, должно иметь место сокращение времени ожидания свертывания, что и было показано экспериментально. 3_3. Были изготовлены модели артериовенозной фистулы, а затем включены в экспериментальный стенд: в замкнутом контуре из силиконовых трубок посредством перистальтического насоса создавалось интенсивное течение жидкости. В экспериментах применялись трассирующие частицы, скорость которых измерялась посредством ультразвукового допплеровского метода на разных участках течения (непосредственно область анастомоза, пристеночная область “артерии” напротив сшивки, участок “вены” сразу за сшивкой). Натурные эксперименты подтвердили результаты гидродинамических расчетов. Также были проведены эксперименты по валидации математической модели ДВС, запускаемого гидродинамической активацией тромбоцитов. Получено, что добавление в экспериментальную систему стенозированного участка приводит к появлению макроскопических тромбов ниже по потоку в канале-ловушке. Данный факт свидетельствует о вкладе гидродинамической активации тромбоцитов в развитие свертывание крови в каналах, расположенных дистальнее области патологии (стенозированного участка). По результатам экспериментов подготовлена работа, отправка которой запланирована на начало 2021 года. 4. Был разработан быстрый алгоритм и программа на языке Python, позволяющие на основании допплеровского ультразвукового сканирования (одномерный D-режим) получать сведения о геометрии сосуда. В основе работы алгоритма - анализ спектральных компонент допплеровского сдвига. Проведены тестовые испытания алгоритма на экспериментальном стенде, состоящем из замкнутой силиконовой трубки (тестового сосуда), в которой за счет перистальтического насоса создавался ток жидкости, и роботизированного манипулятора, который под управлением алгоритма перемещал ультразвуковой датчик по тестовому сосуду. Испытания показали, что алгоритм принципиально позволяет восстанавливать геометрию цилиндрического сосуда, аналогичного по размерам артерии человека (внутренний диаметр 3-4 мм). Кроме того, была разработана и отлажена технология изготовления микрофлюидити-чипов. Была проведена экспериментальная проверка тромбогенности изготовленных микрочипов на экспериментальном стенде с использованием тромбовзвеси. В качестве референсного метода контроля образования тромбоцитарных сгустков использовался агрегометрия, выполненная на приборе Chrono-log. Времена ожидания свертывания крови в агрегометре и в экспериментальной системе с микрочипом совпали в пределах погрешностей, что говорит о том, что изготовленные чипы сами по себе атробогенны и пригодны для использования в целях оценки гидродинамического влияния на активацию микротромбообразования. Информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: http://in-silico.ru http://guria-lab.ru Список использованных источников: • Malinauskas, R. A., Hariharan, P., Day, S. W., Herbertson, L. H., Buesen, M., Steinseifer, U., ... & Craven, B. A. (2017). FDA benchmark medical device flow models for CFD validation. Asaio Journal, 63(2), 150-160. • Пушин Д.М., Салихова Т.Ю., Бирюкова Л.С., Гурия Г.Т. Оценка рисков гидродинамической активации внутрисосудистого тромбообразования. Персонализированный подход. Известия вузов. Радиофизика, в печати. • Pushin, D. M., Salikhova, T. Y., Zlobina, K. E., & Guria, G. T. (2020). Platelet activation via dynamic conformational changes of von Willebrand factor under shear. PLOS ONE, 15(6), e0234501. • Yu, K., Long, C., Hei, F., Li, J., et al. (2011). Clinical evaluation of two different extracorporeal membrane oxygenation systems: a single center report. Artificial organs, 35(7), 733-737.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Было проведено численное моделирование активации тромбоцитов в персонализированных артериовенозных фистулах (АВФ), используемых для гемодиализа. Изучалось влияние объемного потока через фистульную вену и размера VWF на уровень гидродинамической активации в двух АВФ. Получены степенные зависимости, связывающие объемный поток через фистульную вену и уровень гидродинамической активации тромбоцитов в исследуемых АВФ. При увеличении потока крови уровень активации тромбоцитов возрастал в АВФ. Величина показателя степени в зависимости активации тромбоцитов от объемного потока крови оказалась убывающей функцией размера макромолекулы VWF. Было показано существование критического потока, ниже которого тромбоциты не активируются. Было установлено, что величина критического потока убывает с ростом размера VWF. Это позволило выделить на параметрической диаграмме в осях объемный критический поток – размер VWF область параметров, при которых гидродинамическая активация тромбоцитов в исследуемых АВФ не должна иметь места. Построение таких диаграмм позволяет оценить вероятность гидродинамической активации тромбоцитов в АВФ для конкретного пациента. Оказалось, что в исследуемых АВФ значения критического потока отличались в несколько раз. Это означает, что особенности геометрии АВФ влияют на уровень гидродинамической активации тромбоцитов существенным образом. 2. Были проведены численные эксперименты по изучению перераспределения кровоснабжения различных ответвлений сосудистой сети в результате поступления тромбоцитов, активированных выше по течению. В качестве очага активации тромбоцитов рассматривалась артериовенозная фистула. Зависимость процента активированных тромбоцитов от времени бралась из расчётов гидродинамической активации тромбоцитов в артериовенозной фистуле, проведенных в рамках настоящего проекта. В отчетном году изучались сценарии, описывающие попадание нескольких последовательных “порций” активированных тромбоцитов в сосудистую сеть. Были найдены пороги по активации тромбообразования в разветвленной сети сосудов, как по амплитуде импульсов, так и по их длительности. Оказалось, что увеличение длительности импульса в два раза способно пятикратно снижать порог активации тромбообразования в сосудистых сетях. Было изучено влияние симметрии разветвленных сетей каналов на локализацию тромбообразования. В результате расчетов выяснилась, что асимметрия ветвления сосудов в сети существенно повышает шансы сохранить перфузию ткани в случае запуска процесса тромбообразования. 3.1. Был проведен сравнительный анализ качественной структуры течения в артериовенозной фистуле, полученной с помощью методов численного моделирования и по регистрации трассеров в экспериментах in vitro. Сравнительный анализ показал совпадение траекторий течения жидкости, полученных обоими методами. Таким образом, построенный программный комплекс для расчета особенностей гемодинамики в персонализированных геометриях АВФ позволяет получать картину течения, качественно совпадающую с наблюдаемой в экспериментах. 3.2. Для валидации модели тромбообразования в фистуле, были проведены натурные эксперименты по свертыванию плазмы крови, протекающей через специально созданную и подключенную к экспериментальному стенду модель фистулы. Сравнительный анализ натурных экспериментов и математического моделирования показал качественное согласие. В численных экспериментах увеличение потока крови приводило к росту уровня гидродинамической активации, в то время как в in vitro экспериментах с использованием силиконовых модулей при увеличении скорости потока наблюдалось уменьшение времени ожидания свертывания. Таким образом, результаты математического моделирования свертывания крови в персонализированных сосудах были провалидированы с помощью имеющихся в лаборатории экспериментальных методов. 4.1. В 2021 году был доработан созданный на предыдущем этапе работы по настоящему гранту алгоритм, позволяющий на основании допплеровского ультразвукового сканирования (одномерный D-режим) получать сведения о геометрии сосуда. Это позволило повысить скорость в два раза, а точность работы более чем в три раза. Был написан дополнительный модуль, позволяющий разрешать случаи, когда исследуемый объем содержит два сосуда. Проведен ряд экспериментов с изогнутыми сосудами, а также с близко расположенными сосудами. Доработанный алгоритм показал свою эффективность для автоматизированного сканирования данных, необходимых для восстановления персонализированных 3D-геометрий сосудов. 4.2. В 2021 году были изготовлены microfluidity чипы, воспроизводящие как одиночный стенозированный канал, так и разветвленные капиллярные сети. Созданные чипы использовались в экспериментах по валидации математических моделей расчета особенностей гидродинамики в геометриях одиночных микроканалов и разветвленных капиллярных сетей. Увеличение потока в математической модели приводило к повышению уровня гидродинамической активации. При этом рост сгустка наблюдался с “подветренной” стороны потока (из проксимальной области) и распространялся против потока медленнее, чем в его направлении. Модель показала, что с “подветренной” стороны сгустки плотнее и содержат больше фибрина. Процесс тромбирования начинался с периферических сосудов при слабой активации, и с центральных сосудов у самого входа в разветвленную сосудистую сеть в случае сильной активации. В натурных экспериментах с использованием чипов наблюдалось тромбирование центральных сосудов и боковых сосудов, расположенных в проксимальной части чипа. При увеличении скорости потока наблюдалось уменьшение времени ожидания (lag-phase) свертывания со стремительным уплотнением сгустка и полным перекрытием потока. Тромбирование каналов в численных экспериментах происходило аналогичным образом. Результаты математического моделирования свертывания крови в сетях микроканалов были провалидированы с помощью имеющихся в лаборатории экспериментальных методов. 5. Разработан и запущен в эксплуатацию web-сервис по оценке рисков гидродинамической активации тромбообразования в персонализированных геометриях артериовенозных фистул для гемодиализа [https://in-silico.ru/blood-service]. Пользователь регистрируется в системе и загружает серию DICOM изображений, содержащих информацию о строении сосудов фистулы. В настоящий момент сервис позволяет обрабатывать данные магнитно-резонансного исследования. В качестве дополнительной информации возможно указание гематокрита, величины среднего объемного потока через интересующие сосуды, мультимерности фактора фон Виллебранда (VWF), общее содержание мономеров VWF, а также константы ассоциации между VWF и его рецепторами GPIb на поверхности тромбоцита. По загруженным данным в полуавтоматическом режиме рассчитывается величина уровня гидродинамической активации тромбоцитов и распределение ключевых рассчитываемых переменных в систолу и диастолу у конкретного пациента. Пример демонстрационных материалов представлен на сайте сервиса. Информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: http://in-silico.ru; http://guria-lab.ru