Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Работы по проекту направлены на разработку технологии создания кремниевых наночастиц (КНЧ), обладающих высоким потенциалом для решения таких задач биофотоники, как контрастирование биологических тканей и их фантомов методом оптической когерентной томографии (ОКТ) и фотогипертермия. Новизна и актуальность проводимых исследований помимо высокой степени биодеградации и низкой токсичности КНЧ обеспечены применением метода импульсной лазерной абляции в жидкостях предварительно нано- и микроструктурированных мишеней в виде слоев пористого кремния (ПК), массивов кремниевых нанонитей и взвесей кремниевых микрочастиц (КМЧ). Данный подход в отличии от использования в качестве мишеней пластин монокристаллического кремния позволяет формировать ансамбли КНЧ с более высокой эффективностью светорассеяния в диагностическом окне прозрачности биотканей (700 – 1300 нм) и большим выходом продуктов абляции по массе. В ходе выполнения первого этапа работ по проекту были проведены исследования структурных и оптических свойств КНЧ, формируемых методом пико- и фемтосекундной лазерной абляции слоев ПК в воде, этаноле и жидком азоте; оценены возможности использования изготовленных КНЧ для визуализации биологических тканей и их фантомов методом ОКТ-контрастирования с проведением экспериментов на модельных объектах, представляющих собой агаровый гель с внедренными КНЧ различных типов; дополнительно к заявленному ранее плану начаты работы по лазерной фрагментации КМЧ в воде. К наиболее важным результатам, полученным в 2019 году, следует отнести следующие: 1. Отработана технология изготовления ансамблей КНЧ в результате последовательной обработки пластин монокристаллического кремния p-типа методами электрохимического травления (изготовление ПК) и пико- и фемтосекундной лазерной абляции сформированных слоев ПК в различных жидкостях (вода, этанол, жидкий азот). Показано, что в результате происходит формирование КНЧ, размеры которых варьируются от 5 до 200 нм в зависимости от используемой при абляции буферной среды и длительности лазерных импульсов. Так, при абляции ПК лазерными импульсами длительностью 160 фс размер формируемых КНЧ заметно больше, чем в случае использования импульсов длительностью 34 пс со сравнимыми значениями энергий и числа импульсов: например, для фемтосекундной лазерной абляции микропористого кремния в воде и жидком азоте средние размеры КНЧ составляют 89 и 74 нм соответственно, в то время как при пикосекундной абляции в тех же жидкостях – 61 и 25 нм соответственно. 2. Показано, что величина порога абляции в воде и этаноле пористого кремния, полученного электрохимическим травлением монокристаллического кремния, существенно зависит от уровня легирования последнего бором и соответственно морфологии слоев пористого кремния. Зарегистрировано уменьшение порога абляции мишени ПК по сравнению с кристаллическим кремнием более чем в 2 раза за счет худшей теплопроводности пористой матрицы относительно объемного материала и частичного разрушения Si-Si связей в кристаллической решетке в ходе электрохимического травления. При этом наблюдается уменьшение порога абляции микропористого кремния (низкий уровень легирования исходной подложки и размер пор менее 5 нм) по сравнению с мезопористым (высокий уровень легирования исходной подложки и размер пор 10 – 70 нм), связанное с более разветвленной сетью пор в первом случае и, соответственно, с более хрупким кремниевым каркасом ПК. С практической точки зрения наблюдаемая тенденция уменьшенного порога абляции ПК по сравнению с кристаллическим кремнием приводит к увеличению массовой концентрации КНЧ при абляции в жидкостях в несколько раз и подтверждается проведенными экспериментами. 3. На основании анализа данных спектроскопии комбинационного рассеяния света показано, что КНЧ, формируемые методом пикосекундной лазерной абляции микро- и мезопористого кремния в воде, обладают высокой степенью кристалличности: доля аморфной фазы составляет 10.8% и 12.0% соответственно. При этом в случае лазерной фрагментации КМЧ размером 1 – 6 мкм в кювете с водой зарегистрировано формирование практически полностью кристаллических КНЧ с размерами 50 – 170 нм. Наблюдаемое различие может быть объяснено относительно плавным распределением температурного поля в жидкости с продуктами абляции в окрестности сфокусированного лазерного пучка для случая лазерной фрагментации микропорошка в воде по сравнению с абляцией плоских мишеней, где в области воздействия лазерного излучения на границе ПК – вода возникают существенные градиенты температуры и давления, препятствующие плавному остыванию и, соответственно, формированию структур с характерным для кристаллической фазы дальним порядком. 4. На основании анализа данных спектрофотометрии с применением инверсного метода Монте-Карло в диапазонах длин волн 400 – 1000 нм получены значения коэффициентов рассеяния и поглощения, а также фактора анизотропии для КНЧ, сформированных методом фемтосекундной лазерной абляции мезопористого кремния в воде, этаноле и жидком азоте. Величина коэффициента поглощения для рассматриваемых КНЧ монотонно спадает в интервале 400 – 600 нм от значений порядка 0,1 мм-1 до значений, близких к нулю. Данное убывание хорошо согласуется со спектральной зависимостью поглощения кристаллического кремния и способствует эффективному применению в основанных на методах светорассеяния методах визуализации биологических объектов и их фантомов в диагностическом окне прозрачности биотканей 700 – 1300 нм. Анализ спектров приведенного коэффициента рассеяния (произведения коэффициента рассеяния на разность единицы и фактора анизотропии) показывает, что значения данного коэффициента для случая взвесей КНЧ, изготовленных методом лазерной абляции ПК в жидкостях, могут превышать 0,1 мм^-1 в рассматриваемом спектральном диапазоне. При этом максимальным является значение для частиц, полученных в результате абляции ПК в жидком азоте, минимальным – в воде. Последний результат хорошо согласуется с самым малым средним размером 87 нм КНЧ, изготовленных в воде, по сравнению с остальными частицами: чем меньше размер, тем меньше коэффициент рассеяния. Дополнительно проведенный сравнительный анализ показывает превышение значения приведенного коэффициента рассеяния для взвесей КНЧ, сформированных методом лазерной абляции мишеней ПК, в несколько раз по сравнению с данным параметром светорассеяния для взвесей КНЧ, формируемых при аналогичных условиях абляции кристаллического кремния. Поэтому первый тип частиц представляется в рамках проводимого исследования более перспективным для использования в качестве контрастирующих агентов в ОКТ. С точки зрения выбора используемой среды при приготовлении взвеси для проведения экспериментов с биологическими тканями и их фантомами предпочтение на данном этапе исследования следует отдавать все же воде не только благодаря ее высокой степени биосовместимости, но и относительно высокому значению дзета-потенциала по сравнению с этанолом: для аблированного мезопористого кремния значение данной величины для взвеси КНЧ-вода составляет 25 мВ, для взвеси КНЧ-этанол – всего лишь 8 мВ, что требует разбиения в ультразвуковой ванне возникающих агломераций КНЧ для проведения дальнейших экспериментов. 5. Показано, что внедрение взвесей КНЧ, сформированных методом лазерной абляции ПК в жидкостях, в фантом биологической ткани в виде 0.2%-ного агарового геля обеспечивает эффективное контрастирование его неоднородностей методом ОКТ при зондировании излучением с центральной длиной волны 1300 нм в отличии от случая получения ОКТ-изображений без наночастиц. Анализ полученных изображений показывает, что повышение их контраста, обеспечиваемого нанесением КНЧ, качественно согласуется с результатами спектрофотометрических измерений – наибольший контраст 10,9 дБ обеспечивают КНЧ, изготовленные методом абляции ПК в жидком азоте, наименьший 2,2 дБ – КНЧ, изготовленные в воде.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения работ по проекту в 2020 году было продолжено проведение комплексного исследования кремниевых наночастиц (КНЧ), формируемых под воздействием лазерных импульсов с плотностью энергии, превышающей пороговые значения абляционного режима, на микро- и наноструктурированные кремниевые мишени в жидкостях, с целью последующего использования таких частиц для решения задач оптической когерентной томографии (ОКТ) и фотогипертермии живых организмов. В технологическом плане были отработаны 2 технологии формирования КНЧ: метод лазерной абляции массивов кремниевых нанонитей (КНН), изготовленных с помощью металл-стимулированного химического травления, и метод лазерной фрагментации механически помолотого кристаллического кремния в виде взвеси микрочастиц. В обоих случаях использовалось излучение пикосекундного лазера (1064 нм, 34 пс, 10 мДж) и такие буферные жидкости, как дистиллированная вода и этанол. Структурные свойства изготовленных КНЧ были охарактеризованы с помощью методов растровой электронной и атомно-силовой микроскопии, динамического и комбинационного рассеяния света. Показано, что средний размер КНЧ, сформированных методом пикосекундной лазерной абляции массивов КНН, варьируется от 24 до 45 нм в зависимости от используемых буферных жидкостей и уровня легирования кремниевых подложек, использованных при изготовлении КНН. Влияние первого фактора является доминирующим: при абляции в воде размеры частиц почти в 2 раза больше по сравнению со случаем абляции в этаноле. Наблюдаемое различие можно объяснить разницей температур кипения воды (100 °C) и этанола (78 °C) при атмосферном давлении. Поскольку импульсной лазерной абляции в жидкостях сопутствует возникновение кавитационных пузырьков, увеличивающих разлет продуктов абляции от облучаемой мишени, то при меньших температурах кипения концентрация продуктов абляции на некотором удалении от мишени должна быть меньше, что в итоге приводит к понижению эффективности их агломерации в наночастицы и, следовательно, уменьшению размеров последних. Показано, что метод лазерной фрагментации взвесей кремниевых микрочастиц (КМЧ) в дистиллированной воде и этаноле позволяет формировать КНЧ со средними размерами 110 – 340 нм. Размер формируемых частиц зависит от следующих факторов: - используемой буферной жидкости, влияющей на гидродинамический разлет кремниевых фрагментов и экстинкцию падающего лазерного излучения во взвеси; - начальной массовой концентрации КМЧ в жидкостях – с уменьшением ее значения уменьшается экстинкция падающего лазерного излучения, увеличивается эффективность фрагментации и, следовательно, уменьшается размер формируемых КНЧ; - времени экспонирования (числа лазерных импульсов) – чем дольше происходит фрагментация, тем меньше размер формируемых наночастиц. Оба типа исследуемых частиц согласно данным спектроскопии комбинационного рассеяния света продемонстрировали практически полную кристалличность. Для использования в приложениях биофотоники КНЧ, сформированные методом лазерной абляции массивов КНН в жидкостях, являются более предпочтительными с точки зрения меньших размеров по сравнению с частицами, изготовленными методом лазерной фрагментации взвесей КМЧ. Однако последний тип частиц в ряде случаев является более стабильным и менее склонным к агломерации: их дзета-потенциал в использованных буферных жидкостях может превышать по модулю 30 мВ, тогда как дзета-потенциал для взвесей КНЧ, изготовленных посредством абляции массивов КНН, не превосходит величины 30 мВ. Для выбранных в итоге взвесей КНЧ, сформированных методом лазерной абляции массивов КНН в воде и этаноле, проведен анализ спектров коллимированного и диффузного пропускания, диффузного отражения. По оригинальной теоретической модели на основе метода Монте-Карло, восстановлены такие оптические параметры, как коэффициенты поглощения и рассеяния света в диапазоне длин волн 400 – 1000 нм. Полученные значения данных коэффициентов обосновывают принципиальную возможность использования исследуемых КНЧ в качестве контрастирующих агентов в ОКТ и в качестве агентов для фотогипертермии. Возможность эффективного контрастирования методом ОКТ была подтверждена экспериментально на примере внедрения выбранных КНЧ в фантом агарового геля. Показана возможность контрастирования структурных неоднородностей на глубинах до нескольких миллиметров. Величина контраста получаемых ОКТ-изображений может достигать величин порядка 20 – 30 дБ. Показано, что контраст получаемых ОКТ-изображений находится в хорошей корреляции с экспериментально определенными значениями коэффициентов рассеяния суспензий изучаемых КНЧ. Для оценки возможности использования КНЧ в фотогипертермии было проведено численное моделирование процесса нагрева модельной двухслойной среды, состоящей из слоя кожи толщиной 0.2 мм и примыкающей к ней опухоли. Моделирование проведено с использованием методов Монте-Карло и конечных элементов для расчета карт поглощения и решения нестационарного уравнения теплопроводности соответственно. Для расчетов были использованы реальные параметры КНЧ, полученных на первом этапе выполнения проекта путем пикосекундной лазерной абляции микро- и мезопористого кремния в воде и этаноле, а также известные характеристики кожи и базальноклеточной карциномы человека. Показано, что присутствие КНЧ в биоткани увеличивает эффективность поглощения непрерывного лазерного излучения с длинами волн 633 и 800 нм на глубинах до 1 мм. Продемонстрирована возможность роста максимальной температуры в опухоли на 0.2 – 4 ̊С по сравнению с опухолью без КНЧ в зависимости как от длины волны и интенсивности лазерного излучения, так и типов мишеней, используемых при производстве частиц методом лазерной абляции. Численное моделирование показало, что температуры, при которых реализуется гипертермия (не менее 42°C), могут быть достигнуты при использовании непрерывного лазерного излучения с относительно умеренными интенсивностями 200 и 250 мВт/см2 для длин волн излучения 633 и 800 нм соответственно. Таким образом, показаны все предпосылки для дальнейшего применения исследуемых в проекте КНЧ в качестве агентов фотогипертермии на практике. По результатам статьи “Структурные и оптические свойства наночастиц, формируемых методом лазерной абляции пористого кремния в жидкостях; перспективы применения в биофотонике”, опубликованной с благодарностью данному гранту РНФ в журнале Квантовая электроника, 2020, т. 50, № 1, с. 69–75, сделано 2 пресс-релиза на интернет-портале Russia Today и сайте Физического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова: https://russian.rt.com/science/article/762124-kremnii-biomarker-nanochasticy-nauka-rossiya https://phys.msu.ru/rus/news/archive_news/27816/

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
1. Методами спектрофотометрии проведены измерения оптических характеристик взвесей кремниевых наночастиц, сформированных в результате лазерной абляции в воде и этаноле слоев пористого кремния, кремниевых нанонитей и лазерной фрагментации кремниевого микропорошка. С использованием распределений сформированных кремниевых наночастиц по размеру, полученных из анализа данных электронной микроскопии, на основе теории Ми проведены расчеты спектров коэффициентов поглощения и рассеяния света взвесями полученных кремниевых наночастиц. Достигнуто хорошее согласие рассчитанных и экспериментально определенных спектров. Сравнение экспериментально измеренных и рассчитанных спектров указывает на необходимость учета как малой фракции частиц большого размера, так и отличия формы полученных в результате лазерной абляции и фрагментирования наночастиц от сферической. 2. Выполненное численное моделирование процесса гипертермии опухоли (узловой базальноклеточной карциномы) непрерывным лазерным излучением свидетельствует о возможности применения кремниевых наночастиц, полученных в результате лазерной абляции массивов кремниевых нанонитей, в качестве агентов гипертермии. Была рассмотрена модель, имитирующая реальную форму и размер карциномы в подкожном слое. Внедрение в карциному кремниевых наночастиц обеспечивало ее дополнительный нагрев за счет поглощения ими лазерного излучения. Были рассчитаны коэффициенты рассеяния и поглощения наночастиц, внедренных в биоткань, с использованием теории Ми, основанной на измеренных распределениях размеров двух типов используемых наночастиц: полученных абляцией низколегированных кремниевых нанонитей в воде и в этаноле. В рамках развитого нами для этой цели подхода с использованием метода Монте-Карло была рассчитана объемная плотность мощности поглощения излучения с длиной волны 633 нм в различных точках биоткани. Решение стационарного биотеплового уравнения позволило получить распределение температуры по объему биоткани. Показано, что наночастицы, полученные абляцией кремниевых нанонитей в этаноле, внедренные в опухоль с концентрацией не ниже 3 мг/мл, позволяют осуществить нагрев всего объема опухоли до температур свыше 42°С, при этом температура здоровых тканей по сторонам от опухоли и под ней на расстоянии свыше 1 мм от опухоли остается ниже 42°С. Наночастицы, полученные абляцией кремниевых нанонитей в воде, несмотря на большие величины коэффициента поглощения, не могут обеспечить полного прогрева опухоли до температуры 42°С при той же мощности лазерного излучения. 3. Была отработана технология формирования кремниевых наночастиц методом пикосекундной лазерной фрагментации кремниевых микрочастиц размером 1–8 мкм, полученных с помощью механического размола кристаллического кремния, которые находятся в виде взвеси в кювете с дистиллированной водой. В ходе экспериментов варьировались как начальные концентрации кремниевых микрочастиц, так и время их фрагментации. Формируемые кремниевые наночастицы отличаются высокой стабильностью, характеризующейся значением электрокинетического потенциала от – 35 мВ до 25 мВ при измерениях методом динамического рассеяния света в постоянном электрическом поле. Полученные ансамбли наночастиц характеризуются полидисперсным распределением по размерам и, как свидетельствуют результаты измерений спектров комбинационного рассеяния света, кристаллической структурой, как и исходные кремниевые микрочастицы. Обнаружено, что средний размер сформированных кремниевых наночастиц варьируется от 111 до 165 нм и зависит как от времени фрагментации, так и начальной концентрации взвеси микропорошка кремния. При этом стандартное среднеквадратичное отклонение размеров кремниевых наночастиц находилось в диапазоне от 48 нм до 76 нм, что обусловлено возникновением агломератов частиц различного размера на различных временных шкалах при высоких градиентах температур и давлений в облучаемой мощными лазерными импульсами среде. Заметное уменьшение как среднего размера со 165 нм до 111 нм, так и среднеквадратичного отклонения с 76 нм до 48 нм с увеличением времени облучения до 90 минут связано с вторичной фрагментацией уже сформированных кремниевых наночастиц. Для того чтобы оценить максимальные температуры, достигаемые микрочастицами кремния во взвеси при ее облучении пикосекундными лазерными импульсами с длиной волны 1064 нм, было выполнено численное моделирование распределения интенсивности фрагментирующего лазерного излучения в водных взвесях микрочастиц с различными концентрациями, а также соответствующего нагрева данных взвесей. Моделирование проводилось методом Монте-Карло, при этом учитывалась зависимость оптических и теплофизических характеристик кремния от температуры. Проведенное моделирование позволяет объяснить наблюдавшуюся немонотонную зависимость средних размеров кремниевых наночастиц от исходной концентрации частиц микропорошка кремния. Малая исходная концентрация микрочастиц порошка (0.5 мг/мл) сохраняет достаточно жесткую фокусировку излучения в среде и как следствие, достижение более высоких температур расплава кремния и даже его испарения, что, вероятно, приводит к малому размеру формируемых наночастиц. При увеличении концентрации микрочастиц до 5 мг/мл фокусировка излучения ослабевает за счет экстинкции, и вместе с этим растет поглощение рассеянного излучения вблизи поверхности. Это приводит к уменьшению температуры микрочастиц кремния и как следствие росту среднего размера кремниевых наночастиц до 165 нм, а за счет фрагментации в двух различных областях кюветы при различных условиях наблюдается рост стандартного среднеквадратичного отклонения по размерам до 76 нм. 4. Проведен отбор оптимальных для фотогипертермии и оптической когерентной томографии (ОКТ) кремниевых наночастиц, изготавливаемых методами лазерной абляции и фрагментации в рамках настоящего проекта на всех этапах его реализации. Отбор произведен с учетом одновременного выполнения следующих критериев: минимальный размер, максимальная степень кристалличности и высокие значения коэффициента рассеяния в диагностическом окне прозрачности биотканей. Для наиболее подходящих по этим критериям нанокристаллическим частицам кремния, формируемым методом пикосекундной лазерной абляции массивов кремниевых нанонитей в воде и этаноле, проведены эксперименты по нагреву агаровых фантомов биотканей излучением с длиной волны 660 нм и интенсивностью 411 мВт/см2. Эксперименты показали, что присутствие кремниевых наночастиц на поверхности приводит к увеличению нагрева примерно на 1°С, что и находится в согласии с результатами численных расчетов, проведенных в рамках настоящего проекта. 5. Показано, что внедрение кремниевых наночастиц, сформированных методом пикосекундной лазерной абляции массивов кремниевых нанонитей в воде и этаноле, в фантом агарового геля позволяет получать высококонтрастные ОКТ-изображения, как в стационарном режиме, так и в случае ОКТ-ангиографии изображений. Наблюдается корреляция между контрастом регистрируемых изображений со значениями коэффициента рассеяния света. Эксперименты in vivo с мышами при пероральном введении и кожном нанесении кремниевых наночастиц, полученных методом лазерной абляции массивов низколегированных кремниевых нанонитей в воде, позволили сделать вывод о низкой токсичности кремниевых наночастиц, а также о повышении уровня стресса в экспериментальных группах по отношению к контрольной группе. Полученные результаты могут свидетельствовать о прямом или опосредованном влиянии кремниевых наночастиц на центральную нервную систему. Для наиболее полного изучения влияния КНЧ на организм животных необходимы дальнейшие исследования, в том числе токсикологические и гистологические. 6. Выполнение трех этапов проекта позволяет сделать вывод о возможности формирования КНЧ методами как лазерной абляции слоев ПК и массивов КНН, так и лазерной фрагментации КМЧ в жидкостях. Все полученные частицы характеризуются округлой формой и высокой степенью кристалличности. Относительно простые и недорогие технологии электрохимического травления слоев ПК и металл-стимулированного химического травления массивов кремниевых нанонитей позволяют понизить порог абляции в воде и этаноле до 11 раз по сравнению с монокристаллическими пластинами кремния за счет уменьшения теплопроводности и разрыва монолитной связи между кремниевыми атомами. Таким образом удается увеличить выход продуктов абляции по массе до одного порядка без существенного удорожания применяемой технологии при использовании тех же самых лазерных источников. Изготовленные КНЧ слабо поглощают свет в диапазоне длин волн 700 – 1300 нм, соответствующему окну прозрачности биотканей. Одновременно коэффициент рассеяния света в указанной спектральной области достигает величин порядка 1 см–1, что открывает перспективы использования изготовленных КНЧ в качестве контрастирующих агентов в ОКТ. Сделанное предположение подтверждается экспериментами с фантомами биотканей, когда при внедрении наночастиц удается достигнуть значений контраста на ОКТ-изображениях до 30 дБ. Результаты численного моделирования показали возможность использования кремниевых наночастиц в качестве агентов для фотогипертермии на примере воздействия на базальноклеточную карциному излучения с длиной волны 633 нм, где поглощение кремния достаточно для эффективного нагрева. В перспективе эффективность может быть дополнительно увеличена за счет изготовления методом лазерной абляции в жидкостях гибридных наночастиц типа “кремний-серебро” или “кремний-золото.