Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В результате выполнения проекта найдено, что трифторметилзамещенные антипирины могут быть модифицированы в реакциях нитрования, при этом только пиразолоны с электроноакцепторным заместителем в фенильном остатке претерпевают моно-замещение по положению 4 пиразольного цикла. Аминозамещенные антипирины получены с хорошим выходом путем восстановления нитро-функций в пиразолах в результате каталитического гидрирования в присутствии Pd/C. В тестах ‘hot plate” in vivo нитропроизводные показали ярко-выраженную анальгетическую активность. Другим подходом для модификации трифторметилсодержащих антипиринов была разработка способов химических трансформаций их 4-бромпроизводных, полученных через реакции с бромсукцинимидом, которые введены в реакции кросс-сочетания по Сузуки с (гет)арилбороновыми кислотами и по Бухвальду-Хартвигу с арилтиолом. Для предшественников RF-антипиринов, 1-арил-3-полифторалкилпиразол-5-олов, опробовано два подхода для получения 4- и 5-галогенпроизводных как перспективных реагентов для модификаций. Однако попытки введения галогена в положение 4 1-фенил-3-трифторметилпиразол-5-ола независимо от варьируемых условий приводили к образованию продукта сшивки двух пиразолов по положению 4. Замещение гидрокси-группы в положении 5 в 1-арил-3-полифторалкилпиразол-5-олов на галоген оказалось малоэффективным по сравнению с введением трифлатного заместителя по гидроксигруппе. Трифлатное производное было введено в реакции кросс-сочетания с (гет)арилбороновыми кислотами. На первых этапах Проекта были разработаны подходы к получению трифторметилсодержащих 4-аминопиразолов, для которых выполнена теоретическая оценка их физико-химических и фармакокинетических параметров, которые могли бы предсказать их эффективность как лекарственных средств. Установлено, что соединения данного ряда могут рассматриваться как “drug-like”, так как по расчетам они будут иметь приемлемый ADME профиль. Расчет ADME-параметров выполнен с помощью QSAR подхода в подпрограмме QikProp, реализованной в программном обеспечении Schrodinger Small-Molecule Drug Discovery Suite. Для поиска новых анальгетически активных и малотоксичных производных реализована модификации 4-аминопиразолов в реакциях алкилирования, ацилирования, а также с альдегидами и с фенилизоцианатом. В результате чего получены новые метилированные, ацилированные пиразолы, а также производные содержащие азометиновые и тиомочевинные фрагменты. Биологическое тестирование показало, что острая токсичность таких соединений снижается, но и уменьшается их анальгетическое действие. Синтезирована большая серия 4-арилгидразилиден-5-полифторалкилпиразол-3-онов, в которых варьировались полифторалкильная группа, арилгидразонный фрагмент и заместитель при циклическом атоме азота. Найдено, что наиболее эффективным способом синтеза этих соединений является введение арилгидразонного фрагмента в пиразол за счет реакции азосочетания с солями (гет)арилдиазония. Обнаружен новый метод получения пиразолов данного ряда в результате самоконденсации 2-арилгидразоно-3-оксоэфиров. Установлено, что эти реакции протекают хемоселективно с образованием только одного 5-RF-региоизомера. Анализ результатов биологического скрининга показал, что 4-арилгидразонопиразол-3-оны являются наиболее перспективным классом для создания эффективных анальгетиков, поскольку большинство из них проявили выраженную анальгетическую активность, а более трети выявили перспективное высокое анальгезирующее действие, превышающее активность диклофенака. 3-Трифторметил-1-фенил-5-алкоксипиразолы, синтезированные в результате О-алкилирования 3-трифторметил-1-фенилпиразол-5-ола, показали в экспериментах “hot plate” in vivo высокую анальгезирующую активность в сочетании с низкой токсичностью, что свидетельствует о правильность выбора данного хемотипа для дизайна эффективного анальгетика. На данном этапе нами синтезированы новые пиразоло[1,5-a]пиримидиноны, функционализированные толилгидразонным фрагментом по положению 6. При этом найдено, что метил- и трифторметилсодержащие 2-толилгидразилиден-3-оксоэфиры с 3-аминопиразолами циклизуются региоселективно в пиразоло[1,5-a]пиримидин-7-оны, тогда как циклизация полифторалкил-замещенных аналогов может проходить конкурентным путем, давая дигидропиразоло[1,5-a]пиримидин-5-оны, для которых в растворе характерна кольчато-цепная изомерия. Биологическое тестирование позволило установить, что 6-толилгидразилиденпиразоло[1,5-a]пиримидин-7-оны обладают ярко выраженной анальгетической активностью. Соединения проявляют невысокую радикал-связывающую активность. Кроме того, трифторметил-содержащий аналог выявил способность селективно ингибировать карбоксилэстеразу в микромолярной концентрации. Все эти данные свидетельствуют о перспективности дальнейшего изучения 6-толилгидразилиденпиразоло[1,5-a]пиримидинонов. При исследовании кислотных свойств полифторсалициловых кислот обнаружено, что кислотность их карбоксильных групп сопоставима с кислотностью этой функции салициловой кислоты, тогда как кислотность фенольного гидроксила фторированных производных оказалась больше, чем у нефторированного аналога. Это оказало влияние на строение солей полифторсалицилатов, формирующихся за счет образования дианиона. На основе солей полифторсалицилатов синтезированы смешанные металлокомплексы с использованием в качестве солигандов трифенилфосфина, пиридина, 2,2’-бипиридина и фенантролина. Найдено, что в этих комплексах возможна реализация различного соотношения салицилата и солиганда в зависимости от природы катиона металла и строения исходной соли. В медных комплексах полифторсалицилат связан с одной молекулой 2,2’-бипиридина или фенантролина, тогда как в кобальтовых комплексах тетрафторсалицилат координируется с двумя молекулами солиганда. В комплексах, полученных из марганцевых солей, катион металла связывает два тетрафтосалицилатных аниона с двумя молекулами солиганда. В рядах синтезированных полифторсалилатных металлокомплексов обнаружены соединения с высокой антимикотической и анти-гонококковой активностями. Полученные данные запатентованы. Ранее нами CF3-антипирин выбран как соединение-лидер для более глубоких дальнейших исследований. Однако эксперименты in vitro и in silico показали его неэффективность как ингибитора циклооксигеназы. В связи с этим мы решили исследовать другие биомишени, а именно анкириновый TRPA-1 рецептор из семейства TRP-рецепторов, отвечающих за проявление боли. С помощью методов молекулярного докинга мы нашли предположительные сайты связывания известных антагонистов TRPA-1, а также установили, что исследуемый CF3-антипирин может эффективно связываться с этими сайтами TRPA-1 рецептора. Определен показатель полутоксической дозы (ЛД50) соединения-лидера, CF3-антипирина, который согласно расчетам по Беренсу составил 439 мг/кг. Эксперименты по определению средней эффективной дозы для его анальгезирующего действия свидетельствуют о том, что ЕД50 находится в узком интервале доз 5мг/кг – 10 мг/кг.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения Проекта разработан подход к синтезу трифторметилсодержащего аналога известного нестероидного противовоспалительного препарата (НПВП) пропифеназон, перспективного для поиска новых анальгетиков. Предложенный метод основан на циклизации 4,4,4-трифтор-3-оксо-2-(пропан-2-ил)бутаноата с гидразинами с последующим селективным N-метилированием полученных пиразолов в избытке диметилсульфата. Найдено, что конденсация Кляйзена коммерчески доступных эфиров трифторуксусной и изовалериановой кислот является эффективным методом получения 4,4,4-трифтор-3-оксо-2-(пропан-2-ил)бутаноата. Разработаны методы синтеза полифторалкилпиразолов, содержащих фрагменты карбоновых и уксусных кислот, которые присутствуют во многих классах НПВП. Для синтеза (3-полифторалкилпиразол-5-ил)-карбоновых кислот использован гидролиз 5-этоксикарбонилпиразолов, полученных циклоконденсацией 4-полифторалкил-2,4-диоксобутаноатов с гидразинами. Для синтеза полифторалкилпиразолов, имеющих фрагменты эфиров уксусных кислот в положении 4, использована реакция Кнёвенагеля 1,2-дифенилпиразолидин-3,5-диона с этил 3,3,3-трифтор-2-оксопропаноатом в присутствии основания. При этом образовывались стабильные гидратированные аддукты присоединения оксоэфира по активированному метиленовому фрагменту. В отличие от 3,3,3-трифтор-2-оксопропаноата, полифторалкил-3-оксоэфиры конденсируются с 1,2-дифенилпиразолидин-3,5-дионом, образуя этил 3-(3,5-диоксо-1,2-дифенилпиразолидин-4-ил)-3-полифторалкилпроп-2-еноаты. Полученные гетероциклы являются аналогами фенилбутазона, трибузона и кетазона, модифицированными фрагментами полифторалкилсодержащих ацетатов и пропионатов, поэтому они имеют большие перспективы для биологического тестирования как потенциальные НПВП. Нами синтезирован ONO2-модифицированный 3-трифторметилпиразол как перспективное CINODs (NO-NSAID) средство. Синтез основан на галогенировании 5-гидроксибутоксил-3-трифторметил-1-фенилпиразола и последующем взаимодействии галогенпроизводного с нитратом серебра. На основе 4-арилгидразонопиразолин-3-онов создана серия анальгетически активных соединений. Для синтеза большого ряда 4-арилгидразонопиразолин-3-онов, в которых варьировались полифторалкильная группа, арилгидразонный фрагмент и заместитель при атоме азота, использовалось три подхода. Первый способ заключался в конденсации этил-2-(гет)арилгидразоно-3-полифторалкил-3-оксопропионатов с гидразинами, второй метод был основан на азосочетании 3-полифторалкилпиразол-3-онов с хлоридами (гет)арилдиазония. Следует отметить предпочтительность второго метода из-за меньшего числа побочных процессов. В качестве третьего метода предложено использовать найденную нами самоконденсацию 2-толилгидразинилиден-3-оксоэфиров в спиртах при кислотном катализе. Для циклизации эфиров с гидразинами характерно хемоселективное протекание с образованием только 5-RF-региоизомеров. Согласно in silico расчетам все синтезированные 4-арилгидразинилиденпиразолоны должны иметь приемлемый ADME профиль для дизайна лекарственных препаратов. Оценка токсичности изученных соединений в опытах in vivo показала, что их ожидаемые значения ЛД50 будут около 300 и более мг/кг. Исследование анальгетической активности соединений в тесте «горячая пластина» in vivo показало эффективность большинства исследованных соединений как анальгетиков, из которых наиболее активными по сравнению с препаратами диклофенак и анальгин оказались 2-фенилпиразолоны, сочетающие толилгидразинилиденовый фрагмент с полифторалкильным заместителем. При этом для пентафторэтил- и гептафторпропил-замещенных пиразолонов характерно повышенное обезболивающее действие на 1 ч после введения, а для нонафторбутил-содержащего аналога – на 2 ч. Нефторированный 5-метил-4-толилгидразинилиден-2-фенилпиразол-3-он проявляет сильное анальгезирующее действие на 2 ч после введения. Для увеличения анальгетической активности трифторметил-содержащих 4-толилгидразинилиденпиразолонов перспективным оказалось введение метилсульфогруппы в положение 4 N-фенильного заместителя, а также замена толильного фрагмента на 4-метилсулфонилфенильный или 4-этоксикарбонилфенильный фрагмент. Дополнительные эксперименты по изучению анальгезирующего действия активных 4-арилгидразинилиденпиразолонов в тесте отдергивания хвоста от теплового излучения показало их эффективность. При этом наибольшую активность, превышающую действие диклофенака, показал 5-нонафторбутил-4-толилгидразинилиден-2-фенилпиразол-3-он. Это соединение и 5-трифторметил-4-толилгидразинилиден-2-(4-метилсульфонилфенил)пиразол-3-он не изменили ни один из исследуемых показателей поведения животных в тесте «открытое поле», следовательно, применение этих соединений не влияет на ориентировочно-исследовательскую активность животных. Разработаны подходы к синтезу биоактивных пиразолоазинов на основе циклизаций 2-толилгидразинилиден-1,3-дикетонов с аминопиразолами. При этом найдено, что введение толилгидразинилиденового заместителя в положение 2 полифторалкил-1,3-дикетонов изменяет их реакционную способность по отношению к 3-аминопиразолам, так как их реакции с этими динуклеофилами приводили не только к региоизомерным пиразоло[1,5-а]пиримидинам в результате N,N-циклизаций, но и к 4-полифторалкилпиразоло[3,4-b] пиридинам как продуктов C,N-циклизаций. Образование 5-RF- и 7-RF-пиразоло[1,5-a]пиримидинов за счет первичной атаки NH2-группы диамина на различные карбонильные группы наблюдалось только для дикетона, имеющего трифторметил- и метильные заместители. При этом 7-полифторалкильный изомер был выделен в стабильной форме 7-гидрокси-6,7-дигидропиразоло[1,5-а]пиримидина. Реакции 2-толилгидразинилиден-1,3-дикетонов, содержащих другую комбинацию заместителей, с аминопиразолами приводили к образованию 4-RF-пиразоло[3,4-b]пиридинов и/или нефторированных пиразоло[1,5-a]пиримидин-7(6Н)-онов за счет первичной атаки NH2-группы диамина на карбонильную группу при нефторированном заместителе. Очевидно, что пиразоло[1,5-а]пиримидин-7(6Н)-оны образовались в результате галоформного расщепления нестабильных 7-гидрокси-7-RF-дигидропиразоло[1,5-а]пиримидинов. В отличие от полифторалкилсодержащих аналогов, 3-толилгидразинилиденпентан-2,4-дион реагировал с 3-аминопиразолами с образованием только пиразоло[1,5-а]пиримидинов. В серии синтезированных пиразолоазинов обнаружены вещества с анальгетической активностью на уровне диклофенака, причем с меньшей острой токсичностью. Разработаны подходы к синтезу полифторсодержащих аналогов салициламида и ПАСК на основе метил полифторсалицилатов. Синтез полифторсалициламидов реализован реакцией с водным аммиаком, а 4-аминополифторсалициловых кислот - восстановлением предварительно полученных 7-азидозамещенных производных. 3,4,5-Трифторсалициламид в тесте «горячая пластина» in vivo показал ярко выраженную анальгезирующую активность, а 4-амино-3,5-дифторсалициловая кислота проявила высокую туберкулостатическую активность. Интерес к гетеролигандным металлокомплексам полифторсалициловых кислот обусловлен их перспективной антимикробной активностью. На данном этапе синтезированы смешанные металлокомплексы на основе метил трифторсалицилата, который образует бис(салицилатные) комплексы переходных металлов Cu(II) и Co(II) в присутствии основания. Дальнейшее взаимодействие этих комплексов с лигандами бипириднового типа при кипячении в метаноле приводит к комплексам смешанного типа, в котором соотношение метил трифторсалицилата и bipy или phen равно 2:1. Замена растворителя на этанол в случае кобальтового комплекса приводит к переэтерефикации сложноэфирной группы с сохранением соотношения лигандов, а в случае медного хелата наблюдается гидролиз сложноэфирной группы с образованием гетеролигандных комплексов трифторсалициловой кислоты. Строение полученных смешанных металлокомплексов подтверждено РСА, элементным анализом и ИК спектроскопией. Изучение антимикробной активности смешанных комплексов трифторсалициловых эфиров показало, что они менее активны по сравнению с ранее нами полученными комплексами полифторсалициловых кислот. Хотя все они проявили умеренную активность в отношении C. albicans. Из новой серии комплексов наибольшую активность показали смешанные металлокомплексы трифторсалицилатов с phen, проявив более широкий спектр действия относительно патогенных грибов и бактерий. Для синтезированных нами при выполнении Проекта полифторалкилсодержащих метил-, фенил-пиразолов и антипиринов в качестве потенциальной биомишени нами выбран рецептор TRPA-1, который может отвечать за возникновение боли. Молекулярный докинг в активный сайт этого рецептора показал, что соединения-лидеры (по результатам молекулярного докинга) характеризуются значениями docking score ниже -7.8 ккал/моль по аналогии с ранее описанными антагонистами A967079 и HC-030031. Выполненный регрессионный анализ показал корреляцию молекулярного докинга с результатами биологического тестирования. Поскольку активация TRPA1 канала рассматривается в качестве компоненты ноцигенного действия формалина, выраженная активность 1-метил-5-трифторметил-2-(2-метилфенил)-пиразол-3-она (лидера в тестах in silico и in vivo «горячая пластина») в формалиновом тесте позволяет рассматривать TRPA1 в качестве его возможных биологических мишеней. Таким образом, согласно совокупности in silico и in vivo скрининга мы можем рассматривать TRPA-1 в качестве потенциальной биологической мишени для синтезированных в Проекте фенил-пиразолов и антипиринов.