КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-14-00013

НазваниеНеравномерность эволюционно-эпидемической траектории парадоксального древнего субтипа Восточно-Азиатской линии Mycobacterium tuberculosis: стохастические флуктуации или каузативные корреляции?

РуководительМокроусов Игорь Владиславович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное бюджетное учреждение науки "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, г Санкт-Петербург

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021  , продлен на 2022 - 2023. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-201 - Структурная, функциональная и эволюционная геномика

Ключевые словаMycobacterium tuberculosis, туберкулез, лекарственная устойчивость, вирулентность, молекулярная эволюция, молекулярная эпидемиология, филогегорафия, полногеномное секвенирование, миграции населения, история человечества

Код ГРНТИ34.27.00


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Проект является мультидисциплинарным, на пересечении популяционной и системной биологии, геномной биоинформатики, фундаментальной и персонализированной медицины. Взаимоотношения Mycobacterium tuberculosis и Homo sapiens непредсказуемы, драматичны и многогранны. Несмотря на усилия по борьбе с туберкулезом (ТБ), известные эпидемические и мультирезистентные штаммы продолжают циркулировать и демонстрируют свою повышенную адаптивность, остаются высокотрансмиссивными и эволюционируют в сторону развития широкой лекарственной устойчивости. Кроме того, в рамках недооцененных и малоизученных сублиний возбудителя могут возникать совершенно новые устойчивые и/или трансмиссивные клональные кластеры. Предметом исследования будут необычные клональные кластеры актуального микроорганизма Mycobacterium tuberculosis с парадоксальным сочетанием эволюционных, эпидемиологических и филогеографических особенностей: входящие в Восточно-Азиатскую филогенетическую линию (генотип Beijing), эндемичные для Японии и Кореи, до последнего времени они были незначительно распространены в большинстве регионов России, тем не менее наблюдается нарастание их циркуляции в западной и восточной Сибири. При этом все штаммы этих кластеров независимо от региона происхождения, отличаются сильной ассоциацией с лекарственной устойчивостью, причем не только множественной (MDR) но и широкой (XDR). Данная ситуация может коррелировать с возникновением определенного субтипа (в рамках общего пула этих штаммов), который в результате определенных геномных перестроек дополнил способность быстрого развития мультирезистентности, повышенной трансмиссивностью. Направленное на конкретный потенциально пандемический геновариант в рамках генетического семейства Beijing M. tuberculosis, исследование поможет приблизиться к пониманию более общих единых предпосылок возникновения эмерджентных резистентных кластеров, движущих сил их распространения в мире, в особенности в уязвимых популяциях и группах риска. Это станет базой для лучшего понимания других подобных патогенов и развития превентивных мер как для диагностики, так и для эпидемиологии и выбора адекватного лечения. 1. ОСНОВНАЯ ЗАДАЧА: на основе полногеномного и биологического анализа штаммов M. tuberculosis из различных регионов России, Европы, Восточной Азии выявить биологически значимый геномный полиморфизм и патобиологические свойства, определяющие причины скачкообразной циркуляции импортированных геновариантов древних сублиний Mycobacterium tuberculosis в российской популяции в контексте возникновения широко-лекарственно устойчивых клонов (XDR-TB) и их нарастающего распространения в Азиатской части России, и более широко – в Северной Евразии и Европе. 2. В частности, через исследование патобиологических и геномных особенностей, мы ставим задачу оценить роль факторов, определяющих структуру популяции со стороны микроорганизма: - функционально значимые геномные детерминанты - значимые различия в динамике скорости роста и вирулентности в модели in vivo для штаммов, представляющих различные группы (эпидемические, эндемические, эмерджентные чувствительные и эмерджентные резистентные) 3. В контексте данных по демографии, истории и миграционным потокам мы ставим задачу дать оценку филогеографического градиента популяции высокорезистентных кластеров микобактерий, факторов их формирования в пределах Евразии и патобиологически значимых свойств, определивших их низкое распространение до недавнего времени и резкий рост в последние годы, в т.ч. тотальное развитие резистентности при сохранении жизнеспособности. Будет дана оценка влияния миграции и ее объема на градиент распространения ранних древних сублиний микобактерий туберкулеза генотипа Beijing в различных регионах России. 4. Мы ставим задачу провести реконструкцию эволюционной истории и дать оценку времени происхождения данных кластеров, включая разрешение гипотезы об их японском, северо-китайском или ином происхождении (в частности, с целью проверки нашей гипотезы об их заносе в процессе интернирования японских военнопленных в СССР в 1945-1950 гг. после Второй мировой войны). АКТУАЛЬНОСТЬ исследования определяется контекстом глобализации и опасности широкого распространения таких высокорезистентных штаммов M. tuberculosis, в т.ч и с крупными потоками мигрантов. Это же определяет и социально-экономический аспект т.е. проблему потерь мировой экономики. Разработка метода детекции высокорезистентных и потенциально эпидемических геновариантов составит один, но значимый шаг на пути персонализированной медицины. НОВИЗНА. Впервые, будут получены данные, связывающие геномные детерминанты и их эволюцию и фенотипические особенности опасных геновариантов древней сублинии M. tuberculosis генотипа Beijing, представляющих потенциально эпидемические клоны в России. Впервые будет проведен масштабный полногеномный и филогеографический анализ всех наличных штаммов данных геногрупп из России, Северной Евразии и Европы. Впервые будет дана оценка филогеографического распространения данных высокорезистентных клонов в России и соседних странах. На основании анализа полногеномных данных крупной коллекции будет проведена реконструкция их недавней истории в контексте миграционных потоков, демографии и состояния системы здравоохранения, определено время их происхождения (заноса в Россию) и дана датировка возникновения резистентных субтипов в гетерогенной популяции микобактерий туберкулеза на основе применения разных моделей скорости эволюции. Будет дана оценка релевантности моделей эволюции (частоты мутаций) благодаря анализу геномных данных лонгютидных коллекций. Будет разработан метод быстрой детекции основных резистентных субтипов для внедрения в практику в регионах России, в частности для проспективного скрининга в новых коллекциях Европейской части России, Урала, Западной и Восточной Сибири и динамического слежения.

Ожидаемые результаты
Все полученные результаты будут иметь мировой приоритет и значимость. В широком геномном и филогеографическом контексте будет реконструирована сложная эволюционная история недооцененного и парадоксального генетического кластера микобактерий туберкулеза и определены патобиологические причины его стартующего эпидемического подъема, в привязке как к фенотипическим проявлениям в биологической модели, так и геномным детерминантам. По причине ограниченной циркуляции штаммов древних сублиний генотипа Beijing за пределами Японии и Кореи и относительно «неопасного» патогенетического профиля, крупные и углубленные исследования этих штаммов до недавнего времени не проводились ни в России, ни в мире. Но ситуация меняется и требует внимания и действия до того, как она достигнет неконтролируемого масштаба. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ. - Оценка филогеографического градиента, факторов его формирования и связанных с ним патобиологически значимых свойств штаммов Mycobacterium tuberculosis кластеров древних сублиний Beijing в России, определивших их ограниченное распространение до недавнего времени и резкий рост в последние годы, в т.ч. тотальное развитие резистентности. - Оценка филодинамики данных штаммов на основе анализа лонгитюдных коллекций. - Особенности проявления вирулентности и жизнеспособности штаммов древних и современных сублиний генотипа Beijing. - Информация о геномном полиморфизме резистентных кластеров древних сублиний Beijing, обуславливающем (1) лекарственную устойчивость к большинству антибиотиков в т.ч. к новым препаратам и (2) возможно повышенную вирулентность и адаптивность. - Сборка и аннотация полных геномов репрезентативных штаммов двух резистентных кластеров древней сублинии генотипа Beijing. - Реконструкция эволюционной истории и времени и места их происхождения и корреляция с историей, в частности, разрешение гипотезы о японском, северо-китайском или ином происхождении. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ (2 заявки на ПАТЕНТ). Разработка методов детекции высокорезистентных геновариантов в образцах ДНК из чистой культуры для ретроспективной оценки коллекций, проспективного мониторинга и раннего предупреждения. Разработка методов детекции в клиническом материале, и внедрение в практику референс-лабораторий институтов фтизиопульмонологии (СПбНИИФ и УрНИИФ). 12 СТАТЕЙ в WEB OF SCIENCE, в том числе в журналах первого дециля. Обоснование достижимости. Гарантия успеха – участники проекта: (1) ядро научной группы -представители ведущих лабораторий России из СПб и Иркутска, имеющие европейское и мировое признание в области молекулярной эволюции, эпидемиологии и геномной биоинформатики возбудителя туберкулеза, (2) члены группы из СПб, Урала и Сибири, что обеспечит географическую репрезентативность и широту, (3) наличие широкой сети международных коллабораторов (Япония, Китай, Казахстан, Нидерланды/ECDC, Албания, Греция) что является критическим и уникальным условием успеха проекта: это создаст возможность получения широкой пространственной геногеографической перспективы.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
СОКРАЩЕНИЯ. ПТП-противотуберкулезные препараты, МИК – минимальная ингибирующая концентрация, МЛУ-множественная лекарственная устойчивость, ШЛУ – широкая лекарственная устойчивость, SNP-single nucleotide polymorphism (ОНП-однонуклеотидный полиморфизм), NGS-next generation sequencing, WGS-whole genome sequencing. Геномный анализ штаммов ранней древней сублинии генотипа Beijing и определение кластер-специфических мутаций. Первоначальная коллекция геномов (fastq) извлеченных из GenBank, Broad Institute, GMTV включала 3089 образцов, в том числе - 521 геном из Восточной и Юго-Восточной Азии (Япония, Китай, Корея, Вьетнам, Таиланд), и 1067 российских образцов. Из них, 117 геномов были отнесены к ранней древней сублинии с кодоном mutT4-48 дикого типа. Они представляли следующие страны и регионы: 27 – Корея, 20 - Россия, 28 - Китай, 36 - Япония, 1 - США, 5 - неизвестного происхождения. Филогенетический анализ SNP, охватывающих весь геном, подразделил все геномы ранней древней сублинии Beijing на 10 монофилетических клад: 5 клад принадлежали к подгруппе с интактным RD181, а другие 5 клад - к ветви с делетированным RD181. Профили 24-VNTR и сполиготипирования были получены для российских штаммов, и эта информация служила для корреляции ранее идентифицированных кластеров VNTR ранней древней сублинии Beijing с кладами на основе NGS, Кроме того, in silico сполиготипирование было сделано для всех геномов, включенных в древо. Это показало, что большинство изолятов имело профиль Beijing SIT1 (сигналы с 35 по 43), в то время как 4 изолята имели сполигопрофиль SIT269 (сигналы с 37 по 43). Для крупной ветви на древе, включающей только российские множественно-лекарственно устойчивые штаммы 1071-32-кластера были определены кластер-специфические ОНП (без учета генов резистентности). Суммируя, в межгенных участках было – 15 ОНП, в генах PE_PGRS и PPE – 10 (1 нонсенс, 6 миссенс в т.ч. две –со значимой заменой аминокислоты, и 3 сиинонимичные мутации), в других генах – 96, в том числе– синонимичных – 40, несинонимичных – 54, нонсенс – 2. Согласно функциональной категории, 96 мутаций выявлены в кодирующих участках. Их них, для мутаций, приводящих к значимым заменам аминокислот (индекс значимости 3 и 4), гены были в следующих категориях: Промежуточный метаболизм и дыхание – 6, Процессы, связанные с клеткой и клеточной стенкой - 4, Консервативные гипотетические белки - 2, Липидный метаболизм - 1. Метод детекции высокорезистентного кластера (1071-32-cluster ранних древних Beijing) в формате ПЦР в реальном времени. (эта часть плана выполнена раньше, чем запланировано) Выбор был сделан среди синонимичных мутаций с нулевым индексом значимости, представляющихся наиболее филогенетически нейтральными. На основе выявленных SNP, специфических для высокорезистентного кластера разработан метод детекции данного кластера в формате ПЦР в реальном времени с использованием LNA-модифицированных зондов. Метод находится в процессе оценки трех таких SNP, для выбора наиболее оптимального и последующей валидации на локальных коллекциях. Подача Заявки на патент запланирована на 1-й квартал 2020 года. Характеристика российских и зарубежных популяций Mycobacterium tuberculosis для выявления штаммов древней сублинии генотипа Beijing. Характеристика уральской коллекции M. tuberculosis Генотипирование выявило преобладание изолятов генотипа Beijing как среди впервые выявленных больных 75,8% (50/66), так и ранее пролеченных пациентов 83,7% (36/43). Генотип Beijing также доминировал в группах ВИЧ-положительных и ВИЧ-отрицательных больных туберкулезом. Beijing B0/W148 и Beijing 94-32 были преобладающими кластерами и были выделены у 50,0% (33/66) и 22,7% (15/66) впервые выявленных пациентов соответственно. Генотипирование изолятов Beijing по двум MIRU-VNTR локусам: MIRU26 и QUB26, позволило идентифицировать девять групп. Самая большая из них включала 39 изолятов группы Beijing B0/W148 и характеризовалась семью повторами в обоих локусах. Интересно, что 11 изолятов Beijing B0/W148 характеризовались необычными (для этого кластера) двумя повторами в локусе QUB26 (обозначены для краткости как «QUB26/2»). Большинство изолятов кластера Beijing94-32 характеризовались пятью повторами в MIRU26 и восемью повторами в QUB26. Сполиготипирование изолятов non-Beijing подразделило их на девять SIT принадлежащих четырем генетическим семействам. Из них SIT35/Ural был самым крупным кластером и включал 9 (8,3%) изолятов. Сполиготипы SIT 262/Урал; SIT 42, SIT252, SIT254 / LAM; SIT334/Т1; SIT182/Haarlem; SIT402/Unknown были представлены одним или двумя изолятами. Среди ВИЧ-положительных пациентов только SIT35/Ural был обнаружен в 4 (9,5%) случаях. Кластер Beijing B0/W148 объединял только МЛУ, ШЛУ и полирезистентные изоляты. Все 11 изолятов B0/W148 QUB26/2 имели сходный профиль мутаций, связанных с резистентностью к изониазиду (katGS315T), рифампицину (rpoBS531L), этамбутолу (embBM306V) и аминогликозидам (eis-g10a). У трех изолятов также были обнаружены мутации устойчивости к фторхинолонам, а именно: gyrAD94G, gyrAA90V и gyrBI525L. Изоляты non-Beijing были в основном чувствительны к противотуберкулезным препаратам. Изоляты МЛУ были обнаружены только в семействе Ural у SIT35 и SIT262, но SIT35 включал также и чувствительные изоляты. Только один изолят c ШЛУ (SIT252 / LAM) был обнаружен среди изолятов non-Beijing. Выводы. В настоящем исследовании мы охарактеризовали популяционную структуру M. tuberculosis на территории Новоуральска. Генотипирование позволило выявить доминирование изолятов наиболее известного в России варианта M. tuberculosis, кластера Beijing B0/W148, на долю которого приходится высокий процент случаев МЛУ-ТБ среди новых случаев туберкулеза. Характеристика популяции M. tuberculosis в Бурятии: необычная структура с присутствием раннего древнего кластера Beijing ДНК 381 штамма M. tuberculosis генотипировали по 24 локусам MIRU-VNTR согласно протоколу сайта MIRU-VNTRplus http://www.miru-vntrplus.org/ и областям RD 105, 207 и181. Генотип Beijing составлял большинство штаммов (64,1% 216/337 в 2010-2014 и 75% в выборке из 44 изолятов 2019 г.). Штаммы без делеций в RD 105/207 были идентифицированы как LAM – 16,9% (57/337); Ural – 7,4% (25/337); T-3,9 % (13/337). Общая доля наиболее распространенных субтипов Beijing – CC1 и CC2/W148, была ниже, чем в Иркутской области и Саха (Якутии) (Жданова С., и др., 2017). Эти два субтипа составили суммарно 56,0% штаммов Beijing (121/216), что не является характерным для структуры популяции МБТ, циркулирующих на территории России (Mokrousov I. et al., 2012; 2015). Описанная структура штаммов Beijing носит отличный от других территорий вид в связи со значимым присутствием других, характерных для Бурятии вариантов возбудителя. В исследуемой выборке субтип Beijing MIT642 (ранняя древняя сублиния Beijing), обнаружен в 15,4% (52/337), Этот субтип встречался среди изолятов, полученных от впервые выявленных больных ТБ (3,4% - 24/186), так и у пациентов с повторными случаями лечения (7,0% - 28/147). При этом частота его выявления среди больных с первичным и хроническим ТБ, значимо не отличалась (χ2=0,2,35; р=0,125). Национальная принадлежность больных туберкулезом, вызванным субтипом Beijing MIT 642, не имела значения: значимые различия в частоте обнаружения в группе славян (20/159) и бурят (8/70) отсутствовали (χ2= 0,001 с поправкой Иейтса, р>0,05). Такое равномерное распределение штаммов субтипа Beijing MIT 642, может говорить о его давней циркуляции, что позволившей распространиться ему в обеих этногруппах. Профили Beijing MIT 642, которые присутствовали только в единичных случаях в коллекциях из других регионов России (Mokrousov I. et al., 2015), можно рассматривать как эндемичные для Забайкалья (Бурятия и Забайкальский край). Наличие единого для разных этнических групп резервуара инфекции определяют и общие кластеры MIRU-VNTR-24 профилей штаммов Beijing MIT 642. Высокий уровень кластеризации (CR=0,73) выявлен наряду с обнаружением двух крупных групп с идентичными профилями 224233342644425173343732 (24 штамма) и 224233342644425173343832 (13 штаммов). При этом все профили по 24 MIRU-VNTR локусам были отнесены к клональному комплексу BL7 (Merker M. et al., 2015), включающему предковые (=древние) формы генотипа Beijing. Характеристика коллекции M. tuberculosis в Эстонии Выборку для исследования составили штаммы M. tuberculosis полученные от 161 впервые выявленного больного туберкулезом в 1999 г. Анализ коллекции 1999 года был проведен для анализа динамических изменений и будет дополнен анализом новой коллекции. В результате генотипирования 28,6% (46 из 161) штаммов M. tuberculosis были отнесены к генотипу Beijing. Кластеры Beijing B0/W148 и 94-32 были идентифицированы в 13,7% (22/161) и 8,7% (14/161) случаях; соответственно. Из 161 штамма M. tuberculosis лекарственной чувствительностью обладали 106 (65,8%), МЛУ была выявлена у 23 (14,8%) штаммов. Множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) выявлена у 78,3% (18/23) штаммов генотипа Beijing и соответственно у 21,7% (5/23) штаммов других генетических семейств. МЛУ чаще обладали штаммы кластера В0/W148 (68,2%, 15/22), чем другие штаммы Beijing (13,0%, 3/23, P = 0,0006). У 115 штаммов non-Beijing идентифицирован 31 сполиготип (SIT) разных генетических линий: T (24,2%), Haarlem (17,4%), Ural (14,3%), LAM (11,8%), X (0,6%). Четыре изолята имели новые сполиготипы, не найденные в SITVIT_WEB. Один изолят (SIT11) был отнесен к EAI3-IND. Структура популяции M. tuberculosis в Албании: место и роль российских эпидемических генотипов Албания является балканской страной с умеренной/низкой заболеваемостью туберкулезом (ТБ) и очень низкой распространенностью лекарственно-устойчивого ТБ. Мы проанализировали общенациональную многолетнюю коллекцию Mycobacterium tuberculosis, чтобы выявить возможные динамические тенденции развития туберкулеза в Албании с акцентом на лекарственную устойчивость и эндемичные / эпидемические клоны в т.ч. происходящие из стран бывшего СССР. После Второй мировой войны Албания тесно взаимодействовала с Советским Союзом в 1948–1960 годах и с Китаем в 1960–1970-х годах и имела ограниченные связи с другими странами до 1990-х годов. Мы предположили, что такая демографическая история могла повлиять на популяционную структуру M. tuberculosis в Албании. 745 изолятов, собранных в 2007–2011 гг., были разделены на 107 сполиготипов и 353 MIRU-типа. На основании филогенетического анализа MIRU-VNTR изоляты были отнесены к следующим линиям / семействам: Lineage 2 (5 изолятов Beijing), Lineage 3 (1 CAS-Delhi) изолят) и, Lineage 4 (Cameroon, Uganda, Ghana; NEW-1-related; Ural, Haarlem, LAM, S, TUR; и неклассифицированные изоляты). Большинство изолятов (454/745) были промежуточно расположены на глобальном дереве VNTR и не группировались с каким-либо референтным профилем; они были отдаленно связаны с семействами Lineage 4, и мы определили их как «неклассифицированные изоляты L4». Значительно более высокая доля лекарственной устойчивости наблюдалась для (i) генотипа Beijing по сравнению со всеми другими изолятами (60%, P=0,008), (ii) «неклассифицированных L4» по сравнению со всеми другими изолятами (13,9%, P=0,04) и (iii) SIT2936 по сравнению с другими «неклассифицированными L4» (34,3%, P=0,0006). Большинство изолятов LAM (33/49) и Beijing (3/5) принадлежали к типам VNTR, характерным для России и стран бывшего Советского Союз На основании кластеризации 24-MIRU-VNTR 5 изолятов были отнесены к генотипу Beijing. Три штамма имели особые профили Mlva, которые привлекли внимание в последние годы. Один восприимчивый штамм имел тип Mlva 94-32 и, таким образом, принадлежал к среднеазиатско-русской кладе, которая широко распространена в странах бывшего СССР и связана с МЛУ в Центральной Азии. Два других штамма Beijing принадлежали к кластеру Mlva 1071-32, который недавно был описан как высокоустойчивый генотип в России в пределах ранней древней сублинии Beijing (Мокроусов и др., 2019). Этот тип также был описан в предыдущем албанском исследовании (Tafaj et al., 2009), в Греции (Ioannidis et al., 2017), и в Сербии (Merker et al., 2015). Однако два из трех албанских штаммов были лекарственно-чувствительные. Учитывая специфичность типов Mlva 94-32 и 1071-32 для России и бывшего СССР, эти изоляты могли попасть в Албанию или недавно с мигрантами из стран бывшего СССР или из Советского Союза в более ранний период. Албанские изоляты были в основном чувствительны и, следовательно, не могли произойти из МЛУ-ассоциированных изолятов, циркулирующих в настоящее время в странах бывшего СССР и среди мигрантов бывшего СССР в Греции. Напротив, в 1948-1960 гг. имело место тесное взаимодействие и обмен между Албанией и Советским Союзом, когда тысячи албанцев учились в Советском Союзе (Krisafi, 2015). Соответственно, представляется правдоподобным, что эти штаммы были завезены в Албанию 70-80 лет назад, в дальнейшем распространялись в тех же условиях общественного здравоохранения, что и местный пул штаммов, и, как местные штаммы, в основном остались чувствительными к антибиотикам. Наши результаты подчеркивают специфическую природу популяции M. tuberculosis в Албании, в которой преобладают местные и неклассифицированные генотипы в Lineage 4, а также характерны европейские генотипы и эпидемически значимые клоны, происходящие из стран бывшего Советского Союза. В то же время эти импортированные клоны остаются лекарственно-чувствительными. Анализ генотипа Beijing в центральной Америке: возможная связь со странами бывшего СССР или Восточной Азии Целью исследования было охарактеризовать наиболее распространенный кластер генотипа Beijing в провинции Колон (Панама). ДНК 42 изолятов M. tuberculosis (г. Колон, Панама, 2018 г.) была подвергнута генотипированию по 24 локусам MIRU-VNTR (плюс 4 гипервариабельных локуса) и полногеномному секвенированию на платформе MiSeq. Для сравнения использовали глобальную коллекцию NGS (> 9000 загруженных геномов) и базы данных MIRU-VNTR (> 8000 изолятов [Mokrousov, 2015; Merker et al., 2015]). Доминирующий в Панаме кластер внутри генотипа Beijing принадлежал современной сублинии генотипа Beijing (NTF::IS6110, мутация в ogt12) и ее ветви Asian African 3, эндемическому и мало распространенному генотипу в Восточной Азии, также описанному в южной части Африки. На основании 24-MIRU-VNTR типирования и сравнения с базами данных, панамские штаммы генотипа Beijing были отнесены к трем близкородственным типам Mlva (MIRU-VNTRplus): 19 изолятов – тип 1048-33, 2 изолята - тип 1048-32, 1 изолят – тип 342-33. При сравнении с глобальной выборкой 24-MIRU Beijing (4987 изолятов) (Merker et al., 2015, Mokrousov, 2015) эти три типа были представлены в странах Восточной Азии, и в южной части Африки. УЧАСТИЕ В КОНФЕРЕНЦИЯХ: 2 пленарных доклада: 5th International congress of Moroccan Association of Microbiology (Ifrane, Morocco); VIII Конгресс Национальной Ассоциации Фтизиатров (Санкт-Петербург). 1 устный доклад: International Workshop "Next generation sequencing and bioinformatics tools for Mycobacterium tuberculosis drug resistance detection and epidemiological analysis" (Санкт-Петербург). 2 стендовых доклада: 40th Annual Congress of European Society of Mycobacteriology (Valencia, Spain); 50th World Conference on Lung Health (Hyderabad, India). СТАТЬИ Umpeleva T, Belousova K, Golubeva L, Boteva T, Morozova I, Vyazovaya A, Mokrousov I, Eremeeva N, Vakhrusheva D. Molecular characteristics of Mycobacterium tuberculosis in the “closed” Russian town with limited population migration // Infection Genetics and Evolution. Under Minor revision. Tafaj S, Mokrousov I, Borroni E, Trovato A et al. Peculiar features of the Mycobacterium tuberculosis population structure in Albania // Infection Genetics and Evolution. https://doi.org/10.1016/j.meegid.2019.104136 In press.

 

Публикации

1. Вязовая А., Мокроусов И., Герасимова А., Соловьева Н., Авадений И., Куликова О., Журавлев В., Нарвская О. Prevalence and drug resistance of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in northwestern Russia International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, Vol. 23, №10, Suppl. 2, P. S398 (год публикации - 2019).

2. Тафай С., Мокроусов И., Боррони Е., Тровато А., Каписизи П., Барди Д., Хафизи Х., Бала С., Було А., Бино С., Растоги Н., Чирилло Д. Peculiar features of the Mycobacterium tuberculosis population structure in Albania Infection, Genetics and Evolution, 2020; 78: 104136 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Целью исследования является комплексный анализ биологических свойств новых высокорезистентных и потенциально эпидемических генотипов Mycobacterium tuberculosis для оценки их вирулентности, устойчивости, эволюционной истории и прогноза на будущее. Мы бы хотели подчеркнуть многовекторность проекта при логической взаимосвязи всех его компонентов. В 2020 году исследования велись по следующим крупным направлениям. - первичная характеристика новых региональных коллекций методами генотипирования (VNTR, сполиготипирование) для определения структуры всей популяции на уровне семейств, сублиний генотипов и субтипов в т.ч. для выявления российских кластеров ранних древних сублиний Beijing 1071-32 и 14717-15. - Полногеномный и филогенетический анализ штаммов древних сублиний Beijing (1) для выявления филогенетических нейтральных SNP-маркеров крупного резистентного российского кластера 1071-32 и (2) для определения SNP, приводящих к значимым аминокислотным заменам на основе анализа in silico, прежде всего в генах вирулентности, адаптации, синтеза клеточной стенки. Сборка и аннотация геномов штаммов двух кластеров и их депонирование. - Разработка метода РТ-ПЦР детекции Beijing 1071-32 и скрининг ретроспективных коллекций ДНК и анализ глобальной базы геномных данных генотипа Beijing для выявления Beijing 1071-32. Включение новых геномных данных в более полный филогенетический анализ для оценки времени возникновения кластера 1071-32. - Изучение скорости роста штаммов Beijing 1071-32 и 14717-15 в модели in vitro - Изучение вирулентности и летальности штаммов Beijing 1071-32 и 14717-15 в мышиной модели. Филогенетический анализ глобальной выборки штаммов ранней древней сублинии генотипа Beijing из России, Восточной и Юго-Восточной Азии локализовал российские изоляты в два монофилетических кластера со 100% бутстрап-поддержкой, которые соответствовали кластерам на основании VNTR-типирования, обозначаемым как Mlva 1071-32 и 14717-15, согласно международной номенклатуре MIRU-VNTRplus.org. Эти кластеры относились к сублиниям ранних древних Beijing 1 (интактный локус RD181) и 2 (del_RD181), соответственно. Все российские изоляты были множественно- или широко лекарственно-устойчивыми (МЛУ/ШЛУ) и имели определенный филогеографический аффинитет: кластер 1071-32 был выявлен в штаммах Европейской части России и Западной Сибири, тогда как кластер 14717-15 – в штаммах из Западной и, преимущественно, Восточной Сибири. Для более крупного российского кластера Beijing 1071-32 были определены кластер-специфические SNP, из которых 96 было в кодирующих последовательностях. На основе оценки индексов значимости замен, было выявлено 14 мутаций, приводящих к гипотетически значимым аминокислотным заменам. Далее влияние наиболее значимых мутаций на белковые структуры оценивали с помощью структурного анализа in silico и на основе оценки электростатического потенциала вокруг мутировавших аминокислот. В результате, значительного влияния на структуру и функцию для большинства исследованных аминокислотных замен выявлено не было. Помимо генетических полиморфизмов, приводящих к функционально значимым мутациям, описанным выше, для кластера Beijing 1071-32 также были выявлены филогенетические SNP, т.е нейтральные мутации с нулевой значимостью аминокислотной замены. На основе двух таких SNP был разработан метод детекции штаммов beijing 1071-32 в формате ПЦР в реальном времени с использованием LNA-зондов. Метод был оптимизирован на ДНК штаммов с имеющимися геномными данными и известными аллелями в таргетных генах/позициях. Далее метод был использован для скрининга ретроспективных и новых коллекций ДНК из различных регионов РФ и ряда стран Восточной Европы, Азии, Африки и Южной Америки для возможного выявления штаммов данного кластера. Запланирована подготовка заявки на патент поэтому мы не приводим подробностей о точных позициях данных SNP и структуре праймеров и зондов. Проведен скрининг выявленных филогенетических SNP кластера Beijing 1071-32 в глобальной базе геномов Beijing, включающей более 6000 геномов (файлов fastq). В результате проведенного анализа, были выявлены дополнительные геномы (номера доступа) штаммов кластера 1071-32 – штаммы из стран бывшего СССР (Азербайджана, Грузии, Таджикистана), а также из Китая, которые могут быть предковыми по отношению к данному кластеру. Эти геномы были включены в дополнительный анализ для оценки времени происхождения резистентного кластера 1071-32. Выявлена значительно большая, чем ожидалась, дивергенция штаммов из стран б. СССР. Этот результат будет перепроверен и мы планируем повторить все этапы биоинформационной обработки файлов начиная с файлов fastq/vcf и вплоть до построения минимальной сети. Разработанный метод РТ-ПЦР для детекции кластера Beijing 1071-32 на основе 2 снипов (см выше) был использован для скрининга новых и архивных коллекций ДНК из разных регионов России (Урал, Сибирь, Северо-Запад) и зарубежных. Предварительные результаты показывают российскую специфичность данного кластера, в то время как его выявление в единичных изолятах в Албании и Греции вероятнее всего связано с иммигрантами из стран бывшего СССР (изоляты в Греции) и возможно, перемещениями между соседними балканскими странами (между северной Грецией и Албанией). Также была подтверждена 100% специфичность и чувствительность данного метода для детекции кластера Beijing 1071-32. Проведены сборка геномов 2 штаммов кластера 1071-32, их аннотация и депонирование в GenBank. Короткие прочтения штаммов были собраны de novo, сборщиком Bandage v. 0.8.1. Покрытие генома составляло 31,9 x. Полученные контиги были аннотированы с помощью Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP). Для штамма 2044 общая длина генома составила 4,339,788 п.н. Геном содержит 4088 генов, из которых 4037 являются кодирующими (CDSs), 3898 -белок-кодирующими генами, 51 генами РНК, 139 — псевдогенами. Среди 51 гена РНК - 45 генов тРНК, 3 -некодирующих РНК (ncRNAs). Параллельно с вышеописанным анализом, члены научной группы в Екатеринбурге, Омске и Иркутске провели сбор новых коллекций изолятов M. tuberculosis и их базовую характеристику для дальнейшего анализа и выявления штаммов генотипа Beijing, его древних сублиний и резистентных кластеров 1071-32 и 14717-15. Одновременно с геномным и филогенетическим анализом, описанным выше, были проведены исследования по изучению биологических свойств двух российских резистентных кластеров в моделях in vivo и in vitro. Исследование вирулентности клинических изолятов при моделировании туберкулезной инфекции у мышей C57BL/6. По итогам оценки вирулентности клинических МЛУ изолятов 396y (Beijing 14717-15-кластер, Бурятия) и 6691 (1071-32-кластер, Омск) в сравнении с референс-штаммом M. tuberculosis H37Rv можно утверждать, что оба исследованных клинических штамма способны вызывать при внутривенном инфицировании мышей туберкулезный процесс с преимущественным поражением легких. Показано наличие корреляции между показателями летальности зараженных мышей тем или иным штаммом МБТ и тяжестью патологических изменений в легочной ткани, а также бактериальной нагрузкой в легких и селезенке. По совокупности показателей тяжести течения туберкулезного процесса (выживаемости, динамики массы тела, биометрических показателей, степени распространенности в легких очагов специфического воспаления и уровню обсемененности легких и селезенки МБТ) вирулентность клинического штамма M. tuberculosis 6691 была существенно ниже вирулентности стандартизованного штамма M. tuberculosis H37Rv. Вирулентные свойства клинического штамма 396y были выражены сильнее, чем у M. tuberculosis щтамма H37Rv. Прежде всего, это зафиксировано по динамике летальности мышей, согласно которой массовая гибель мышей, как и 100% летальность зафиксированы раньше именно в группе животных, зараженных штаммом 396y. Согласуются с этими данными и результаты оценки обсемененности легких M. tuberculosis, считающейся интегральным показателем тяжести течения инфекции, поскольку уровень бактериальной нагрузки легких МБТ практически на всех сроках наблюдения уже развившегося заболевания (кроме последнего срока обследования), при использовании штамма 396y был значимо более высоким. Кроме того, при инфицировании мышей M. tuberculosis 396y максимальные значения биометрических показателей, как и практически все характеристики распространенности патологических изменений в легких, регистрировались раньше, чем в других группах Оценка различий в скорости роста штаммов двух резистентных кластеров древней сублинии генотипа Beijing. Результаты исследования параметров роста штаммов двух исследованных кластеров 1071-32 и 14717-15 показывают внутри каждой группы значительный разброс значений параметров роста. Сравнение исследуемых групп показало, что некоторые различия между ними были только лишь по двум параметрам роста – длительности lag-фазы и точке максимального прироста флуоресценции (р=0,05). Штаммы кластера 1071-32 медленнее выходили из lag-фаз и в более поздние сроки имели максимальный прирост флуоресценции. Однако по интегральному параметру роста – коэффициенту r, характеризующему особенности кривой роста МБТ в целом, по критерию U группы между собой не различались, при слабой тенденции штаммов кластера 1071-32 к замедлению роста. ТАКИМ ОБРАЗОМ, Beijing 1071-32 – менее вирулентный и летальный, чем высоколетальный Beijing 14717-15, который в основном циркулирует в Бурятии. При этом на примере 1071-32 мы видим, что наличие многочисленных мутаций устойчивости действительно может привести к снижению выживаемости (fitness) и трансмиссивности штамма в целом т.к. этот кластер составляет незначительную долю популяции в большинстве регионов (кроме Омской области) хотя и достаточно широко распространен. Например, можно отметить его выявление в других странах, причем не только в странах бывшего СССР, но (вероятнее всего за счет мигрантов из б. СССР) – в Албании и Греции. Сравнение моделей прямого и непрямого анализа вирулентности in vivo и in vitro показывает, что показатель скорости роста для оценки патогенности и траснмиссивности не является достаточно информативным. Напротив, мышиная модель вирулентности выявила значимые различия изучаемых кластеров и определила бурятский кластер 14717-15 как высоковирулентный и высоколетальный, причем более летальный, чем известные эпидемические в России и Средней Азии генотипы Beijing B0/W148 и Beijing CAO. Данные высокорезистентные генетические кластеры отражают две парадигмы эволюции и адаптации. Сравнение с имеющимися данными по другим генотипам позволяет нам формулировать гипотезу о соотношении вирулентности и лекарственной устойчивости как основном факторе распространения патогенных респираторных бактерий.

 

Публикации

1. Акоста Ф., Норман А., Самбрано Д., Батиста В., Мокроусов И., Шитиков Э., Хурадо Дж., Майрена М., Луке О., Гарай М., Солис Л., Муньос П., Фольквардсен Д.Б. , Лиллебек Т., Перес-Лаго Л., Гудридж А., Гарсиа де Вьедма Д. Probable long-term prevalence for a predominant Mycobacterium tuberculosis clone of a Beijing genotype in Colon, Panama Transboundary and Emerging Diseases, 2021; 68 (4) : 2229-2238 (год публикации - 2021).

2. Герасимова А., Вязовая А., Левина К., Кютт М., Мокроусов И. Tuberculosis in Estonia: a major impact of Russian MDR Mycobacterium tuberculosis Beijing B0/W148-cluster European Respiratory Journal, 56: 1602 (год публикации - 2020).

3. Герасимова А.А., Вязовая А.А., Левина К., Кютт М., Мокроусов И.В. Молекулярно-генетические особенности штаммов Mycobacterium tuberculosis генотипа Beijing, циркулирующих на территории Эстонии Инфекционные болезни в современном мире: диагностика, лечение и профилактика: сборник трудов XII Ежегодного Всероссийского интернет-конгресса по инфекционным болезням с международным участием – Москва: Медицинское маркетинговое агентство, С. 55 (год публикации - 2020).

4. Мокроусов И., А. Вязовая, К. Левина, В. Журавлев, П. Вийклепп, М. Кютт Trends in molecular epidemiology of drug resistant tuberculosis in Estonia International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, 24 (10), Suppl. 2, S268-269 (год публикации - 2020).

5. Мокроусов И., Вязовая А., Левина К., Герасимова А., Журавлев В., Вийклепп П., Кютт М. Spatiotemporal dynamics of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis: Contrasting trends and implications for tuberculosis control in EU high-priority country Transboundary and Emerging Diseases, 2021; 68 (2): 896-906 (год публикации - 2021).

6. Мокроусов И., Синьков В., Хромова П., Герасимова А., Черняева Е., Соловьева Н. Genomic analysis of new pre-XDR/XDR cluster of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype emerging in Russia European Respiratory Journal, 56: 4593 (год публикации - 2020).

7. Пердигау Ж., Силва С., Малтез Ф., Мачаду Д., Миранда А., Коуту И., Рабна П., Флорес де Сессионс П., Фелан Д., Пайн А., Макнирни Р., Хибберд М.Л., Мокроусов И., Кларк Т.Г., Вивейруш М., Португал И. Emergence of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis of the Beijing lineage in Portugal and Guinea-Bissau: a snapshot of moving clones by whole-genome sequencing Emerging Microbes and Infections, 9(1):1342-1353 (год публикации - 2020).

8. Умпелева Т., Белоусова К., Голубева Л., Ботева Т., Морозова И., Вязовая А., Мокроусов И., Еремеева Н., Вахрушева Д. Molecular characteristics of Mycobacterium tuberculosis in the "closed" Russian town with limited population migration Infection, Genetics and Evolution, 79:104174 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году подана 1 заявка и подготовлена еще 1 заявка на патент на методы детекции резистентных кластеров. Результаты представлены на 4 международных конгрессах. Две статьи 2021 года отражены в Новостях РНФ https://www.rscf.ru/news/biology/shtamm-vozbuditelya-tuberkuleza-obnaruzhennyy-na-dalnem-vostoke-okazalsya-vysokoletalnym/ ; https://rscf.ru/news/biology/lekarstvenno-ustoychivyy-shtamm/ Целью исследования является комплексный анализ биологических свойств новых высокорезистентных и потенциально эпидемических генотипов Mycobacterium tuberculosis для оценки их вирулентности, устойчивости, эволюционной истории и прогноза на будущее. Мы бы хотели подчеркнуть многовекторность проекта при логической взаимосвязи всех его компонентов. В 2021 году (3-й заключительный год проекта) исследования велись одновременно по нескольким взаимосвязанным направлениям (филогеографический, филогенетический, биоинформационный анализ, моделирование ин силико, анализ патобиологических свойств в мышиной модели штаммов разных генотипов и сравнение с клинической значимостью применительно к человеческой популяции), объединение результатов которых позволило получить целостную картину эволюции и эпидемиологии значимых генотипов M. tuberculosis и сформулировать новые задачи для заявки на продоление проекта. В 2021 году исследования велись по следующим направлениям, по которым были получены результаты, имеющие мировой приоритет. - Полногеномный и филогенетический анализ штаммов древних сублиний Beijing для выявления филогенетических нейтральных SNP-маркеров резистентного российского кластера 14717-15 и для определения SNP, приводящих к значимым аминокислотным заменам на основе анализа in silico, прежде всего в генах вирулентности, адаптации, синтеза клеточной стенки. Сборка и аннотация геномов двух штаммов этого кластера и их депонирование. - Разработка метода быстрой ПЦР детекции Beijing 14717-15, скрининг ретроспективных и новых коллекций ДНК и анализ глобальной базы геномных данных генотипа Beijing для их выявления. - Изучение вирулентности и летальности в мышиной модели взятых в качестве сравнения штаммов другого значимого генетического семейства LAM (Latin American Mediterranean). - Оценка клинической значимости эпидемических и эндемических генотипов применительно к человеческой популяции на основе анализа исхода заболевания (диагноз и летальность). ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КЛАСТЕРОВ 1071-32 И 14717-15 В РАМКАХ ГЛОБАЛЬНОЙ ФИЛОГЕНИИ НА ОСНОВЕ АНАЛИЗА ДОПОЛНИТЕЛЬНЫХ ГЕНОМОВ В результате секвенирования в 2021 году дополнительной выборки 19 штаммов древних сублиний Beijing построена новая дендрограмма российской и глобальной выборки штаммов ранней древней сублинии Beijing (224 генома) из России, Китая, Японии, Кореи, Вьетнама и Таиланда. Штаммы из России попали в два обособленных кластера в разных ветвях дерева (РИС 2). Все российские штаммы были генотипически мультирезистентными (как минимум), а за счет дополнительных мутаций устойчивости многие (особенно в кластере 1071-32) были пред-ШЛУ (широко лекарственно устойчивые). Самый крупный из этих кластеров 1071–32 включал только российские изоляты из европейской и азиатской России. Все обладали устойчивостью к INH, RIF, STR, EMB из-за 6 мутаций в KatG315/335, RpoB450, RpoC485, EmbB497, RpsL43. Большинстве имело мутации в pncA, gyrA, rrs, eis, то есть были пред-ШЛУ. Исходя из количества SNP, разделяющих наиболее удаленные изоляты это кластера и основываясь на оценке скорости мутаций в геноме M. tuberculois (0.5 SNP/геном/год) мы предполагаем его возникновение в 1970-х годах. Относительно ближайшими соседями этих штаммов были штаммы из Таиланда. С учетом обособленности Омской области (где наибольший процент этого кластера в России) такое родство выглядит странным и требует дополнительного исследования. Российские изоляты меньшего кластера 14717-15 были из азиатской России. У них было две общие мутации устойчивости rpsL Lys88Arg katG Srr315Thr. Филогенетически ближайшими соседями были изоляты из Кореи, при этом российски изоляты как из Омска так и из Бурятии и один из корейских изолятов имели характерный сполигопрофиль SIT269 (производный от классического сполигопрофиля Beijing - SIT1). Это делает правдоподобной гипотезу о корейском происхождении этого кластера, или скорее его российского штамма – основателя. ПОДБОР SNP-МАРКЕРОВ НА ГЕНОТИП BEIJING 14717-15, РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДА ЕГО ДЕТЕКЦИИ, И СКРИНИНГ КОЛЛЕКЦИЙ Анализ геномной варианбельности уникальной для отдельных изолятов и их кластеров выявил 40 специфических однонуклеотидных замен (SNP) специфических для высоколетального и высоковирулентного кластера штаммов Beijing 14717-15. Среди этих SNP мы выбрали нейтральную замену в гене Rv1293 101 Ala/Ala. Нейтральная мутация не подвержена риску естественного отбора и с учетом невероятности реверсии такая мутация особенно пригодна для испольтзования в качестве специфического маркера для генодиагностики. Анализ генного участка в котором расположена данная мутация выявил что в результате ее возникает сайт распознавания для эндонуклеазы рестрикции HhaI GCGC. Это создает возможность выявления данной мутации на основе ПЦР-амплификации фрагмента гена с последующей обработкой рестриктазой HhaI и разделением продуктов рестрикции в агарозном геле. ПОДГОТОВЛЕНА ЗАЯВКА НА ПАТЕНТ, которая будет направлена в Роспатент в декабре 2021 г. Дополнительно мы проверили c с использованием метода ПЦР-ПДРФ еще один SNP (Rv2161c Val(s)33Ala), также имеющий исключительно высокое значение PAM1, т.е. филогенетически нейтральный. Для его детекции была использована рестрикция с той же рестриктазой HhaI. Применение двух SNP усиливает надежность детекции именного данного кластера. Обе схемы ПЦР-ПДРФ были отработаны и оптимизированы в отношении условий ПЦР на изолятах с известными полногеномными секвенсами и профилями VNTR. Обе мутации были выявлены только у штаммов кластера Beijing 14717-15. Далее мы провели скрининг географических коллекций изолятов из различных российских регионов на наличие штаммов данного кластера. Метод детекции штаммов кластера Beijing 14717-15 на основании ПЦР-ПДРФ анализа двух специфических SNP был применен к коллекции ДНК изолятов из различных регионов Сибири и Дальнего Востока. Дополнительно проведен скрининг выявленных филогенетических SNP кластера Beijing 14717-15 в глобальной базе геномов Beijing, включающей более 6000 геномов (файлов fastq). Данная база была составлена из геномных данных, извлеченных из GenBank/ENA, в рамках нашей коллаборации с д-ром Joao Perdigao, Research Institute for Medicines, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa (Португалия). СРАВНИТЕЛЬНАЯ ФИЛОГЕОГРАФИЯ. Сравнение географии субтипа 14717-15 с распространением другого изученного субтипа Beijing 1071-32 показывает большее распространение последнего, но в малой доле, за исключением Омской области. Подробный анализ филогеографии кластера Beijing 1071-32 был представлен в отчете за 2020 год. В целом, согласно анализу VNTR, изоляты из кластера Beijing 1071-32 в основном выявлялись в России с явно возрастающей распространенностью в Омске, Сибирь, но эти изоляты также присутствовали в других регионах России и странах бывшего Советского Союза в Средней Азии и Закавказье. За пределами бывшего Советского Союза изоляты Beijing 1071-32 были описаны в Сербии (Merker et al., 2015), Албании (Tafaj et al., 2020) и Греции (Ioannidis et al., 2017). Это балканские страны, но неизвестно, отражает ли этот факт уже местную циркуляцию этого штамма, а не независимый импорт из бывшего СССР. ДНК из Албании и Греции были доступны для этого исследования, и мы подтвердили, что они содержат все 9 мутаций, то есть 3 нейтральных SNP и 6 мутаций устойчивости. Три изолята из Греции были получены от иммигрантов из бывшего СССР, а именно из Грузии, а два других - от пациентов из Греции. Пекинский генотип чрезвычайно редок в Албании, и ранее предполагалось, что эти изоляты в Албании могут быть связаны с соседней Грецией. Крупное европейское многоцентровое исследование лекарственно-устойчивого туберкулеза в ЕС десять лет назад выявило изоляты Beijing 1071-32 и обозначило их как европейский устойчивый кластер ECDC_10 (de Beer et al., 2014). Это дополнительно подчеркивает присутствие штамма Beijing 1071-32 MDR в ЕС и актуальность их отслеживания в более глобальном масштабе, не ограничиваясь Россией и другими странами бывшего Советского Союза. ОЦЕНКА ВИРУЛЕНТНОСТИ ШТАММОВ ГЕНОТИПА LATIN AMERICAN MEDITERRANEAN (LAM) В МЫШИНОЙ МОДЕЛИ. Сравнение с данными для эпидемических кластеров генотипа Beijing. Из 4 изученных штаммов (сполиготипов) ранее два были определены как эмерджентные, высокорезистетные и потенциально эпидемические, SIT266 – в Белоруссии и SIT252 – в Европейской части России. В то же время два других сполиготипа (SIT264, SIT254) не отмечены особыми патобиологическими свойствами. Ниже приведена таблица с информацией о штаммах и сполиготипах. При сравнении вирулентности клинических изолятов генетического семейства Latin American Mediterranean (LAM) 7074, 3929, 306 и 4542 и референтного оштамма M. tuberculosis H37Rv можно утверждать, что внутривенное введение всех исследованных клинических штаммов вызывает у инфицированых мышей генерализованный туберкулез с преимущественным поражением легких. По совокупности показателей тяжести течения туберкулезного процесса (выживаемости, динамики массы тела, биометрических показателей, степени распространенности в легких очагов специфического воспаления и уровню обсемененности легких и селезенки МБТ) вирулентность всех клинических штаммов M. tuberculosis (7074, 3929, 306 и 4542) была существенно ниже вирулентности референтного штамма M. tuberculosis H37Rv. Минимальная вирулентность при этом зафиксирована у трех низколетальных штаммов LAM 7074, 3929 и 4542 (все – МЛУ), умеренная - у штамма 306 (чувствительный). Сравнение результатов по штаммам LAM с ранее изученными нами штаммами древней и современной сублинии генотипа Beijing показывает четкую связь успешности эпидемических российских кластеров Beijing с их повышенной вирулентностью и летальностью. Для дальнейшего углубленного понимания полученных результатов на молекулярном уровне как организма-хозяина так и микроорганизма необходимо исследование методами системной биологии. Это запланировано в подаваемой нами заявке на продление гранта на 2 года. Влияние патобиологического разнообразия Mycobacterium tuberculosis на клинические проявления и летальный исход туберкулеза В популяции Mycobacterium tuberculosis в России преобладает печально известный генотип Beijing, основные эпидемические и эндемические варианты которого характеризуются противоположными свойствами лекарственной устойчивости и вирулентности. Мы изучили, как эти характеристики штамма могут повлиять на прогрессирование туберкулеза легких (ТБ) в отношении клинических проявлений и летального исхода. В коллекцию исследований вошли 548 изолятов M. tuberculosis, выделенных в 2013–2019 гг. от 548 пациентов с впервые выявленным туберкулезом легких в Омске, Западная Сибирь, Россия. Штаммы были подвергнуты тестированию на лекарственную чувствительность и генотипированию для выявления клонов, сублиний и подтипов (в пределах генотипа Beijing). Генотип Beijing выявлен у 370 (67,5%) изученных штаммов. Наиболее сильная связь с МЛУ была обнаружена для эпидемического кластера Beijing B0/W148 (современная сублиния) и двух недавно открытых нами кластеров 1071-32 и 14717-15 древней сублинии Beijing. Группа пациентов, инфицированных гипервирулентным и высоколетальным (на мышиной модели) кластером Beijing 14717-15, показала самый высокий уровень летального исхода (58,3%) по сравнению с Beijing B0/W148 (31,4%; P = 0,06), Beijing Central Asian/Russian (29,7%, P = 0,037) и штаммами non-Beijing (15,2%, P = 0,001). Кластер 14717-15 в основном включал изоляты от пациентов с инфильтративным, но не с фиброзно-кавернозным и диссеминированным туберкулезом. Напротив, группа, инфицированная кластером с низкой вирулентностью и МЛУ 1071-32, имела самый высокий уровень фиброзно-кавернозного ТБ, что, возможно, отражает способность этих штаммов к длительной выживаемости и хроническому течению процесса ТБ. В подгруппах пациентов, инфицированных современной сублинией Beijing и древним кластером 14717-15, преобладали пациенты в возрасте <44 лет, что, вероятно, коррелирует с активной продолжающейся передачей этих штаммов. В заключение, это исследование подчеркивает, что не только лекарственная устойчивость, но и вирулентность штаммов должны приниматься во внимание при внедрении персонализированной медицины и лечения туберкулеза.

 

Публикации

1. - Наиболее смертоносный штамм туберкулёза найден в Бурятии Regnum, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704. (год публикации - ).

2. - Назван самый смертоносный штамм туберкулеза МИР 24, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704. (год публикации - ).

3. - Ученые обнаружили в Бурятии самый смертоносный в России штамм туберкулеза Независимое интернет-издание "Дни24", Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704. (год публикации - ).

4. - В Бурятии нашли самый смертоносный штамм туберкулеза Информационное агентство «Байкал Медиа Консалтинг», Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704. (год публикации - ).

5. - В России обнаружили смертельно опасный штамм туберкулеза Электронное периодическое издание «MK.ru», Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

6. - В России выявили самый смертоносный штамм туберкулеза Сетевое издание spbdnevnik.ru — городской информационный портал Правительства Санкт-Петербурга, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

7. - В Бурятии обнаружен самый смертоносный штамм туберкулеза среди известных в России Сетевое издание "Новая Бурятия", Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

8. - В Бурятии выявлен самый опасный штамм туберкулеза Вести-Бурятия https://www.facebook.com › bgtrktv, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

9. - В России выявлен самый смертоносный штамм туберкулеза Сетевое издание «Terrnews.com», Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

10. - Эпидемиолог оценил опасность самого смертоносного штамма туберкулеза Вечерняя Москва, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

11. - Самый смертоносный в России штамм туберкулёза обнаружили в Бурятии infopol.ru, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

12. - В России выявили наиболее опасный штамм туберкулеза Рамблер, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

13. - В России выявили наиболее опасный штамм туберкулеза VERIFIED NEWS EXPLORER CHANNEL, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

14. - В России выявили наиболее опасный штамм туберкулеза msn финансы, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

15. - Наиболее смертоносный штамм туберкулёза найден в Бурятии ARD: портал деловой информации, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

16. - В России нашли самый смертоносный штамм туберкулеза Общественная служба новостей, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

17. - В Бурятии обнаружили самый смертоносный штамм туберкулеза Буряад Унэн, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

18. - В России обнаружили смертельно опасный штамм туберкулеза News22, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

19. - Ученые обнаружили в Бурятии самый смертоносный в России штамм туберкулеза Profile Russia, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704 (год публикации - ).

20. - Лекарственно устойчивый штамм возбудителя туберкулеза из России найден в Албании и Греции Яндекс, Mokrousov I., et al.. Practical approach to detection and surveillance of emerging highly resistant Mycobacterium tuberculosis Beijing 1071-32-cluster. Sci Rep. 2021 Nov 1;11(1):21392. doi: 10.1038/s41598-021-00890-7. (год публикации - ).

21. - Лекарственно устойчивый штамм возбудителя туберкулеза из России найден в Албании и Греции PCR.NEWS, Mokrousov I., et al.. Practical approach to detection and surveillance of emerging highly resistant Mycobacterium tuberculosis Beijing 1071-32-cluster. Sci Rep. 2021 Nov 1;11(1):21392. doi: 10.1038/s41598-021-00890-7. (год публикации - ).

22. - Штамм возбудителя туберкулеза, обнаруженный на Дальнем Востоке, оказался высоколетальным PCR.NEWS, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704. (год публикации - ).

23. - В России нашли самый смертоносный штамм туберкулеза lenta.ru, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704. (год публикации - ).

24. - В Бурятии нашли штамм туберкулёза с высокой летальностью Байкал Daily, Vinogradova T., et al. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia. Emerg Microbes Infect. 2021 Dec;10(1):1691-1701. doi: 10.1080/22221751.2021.1967704. (год публикации - ).

25. Виноградова Т., Догонадзе М., Заболотных Н., Бадлеева М., Ярусова И., Вязовая А., Герасимова А., Жданова С., Витовская М., Соловьева Н., Пасечник О., Огарков О., Мокроусов И. Extremely lethal and hypervirulent Mycobacterium tuberculosis strain cluster emerging in Far East, Russia Emerging Microbes & Infections, V. 10, P. 1691-1701 (год публикации - 2021).

26. Герасимова А., Вязовая А., Мударисова Р., Терентьева Д., Соловьева Н., Журавлев В., Мокроусов И. Increasing proportion of strains of ancient sublineage of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype among patients with HIV-tuberculosis coinfection 41st Annual Congress of European Society of Mycobacteriology, Abstract book., P.40–41 (год публикации - 2021).

27. Мокроусов И., Виноградова Т., Догонадзе М., Бадлеева М., Ярусова И., Заболотных Н., Витовская М., Вязовая А., Герасимова А., Жданова С., Хромова П., Синьков В., Молчанов В. ., Черняева Е., Соловьева Н., Пасечник О., Огарков О. Highly lethal strain cluster of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype endemically prevalent in Buryatia, Russia European Respiratory Journal, 58 (suppl 65): PA2475 (год публикации - 2021).

28. Мокроусов И., Виноградова Т., Догонадзе М., Заболотных Н., Витовская М., Вязовая А., Соловьева Н., Бадлеева М., Пасечник О., Огарков О. Contrasting virulence properties of drug-resistant Mycobacterium tuberculosis strain clusters in Siberia, Russia International Journal of Tuberculosis and Lung Disease, V. 25 (10), Suppl. 2, P. S262-S263 (год публикации - 2021).

29. Мокроусов И., Виноградова Т., Хромова П., Догонадзе М., Заболотных Н., Бадлеева М., Ярусова И., Вязовая А., Пасечник О., Жданова С., Герасимова А., Синьков В., Витовская М. ., Соловьева Н., Журавлев В., Огарков О. New emerging highly-drug resistant clusters of Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype in Russia: phylogenomics and pathobiology The 15th International Conference on Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics of Infectious Diseases (MEEGID XV), 2-5.11.2021 online, 07.03 (год публикации - 2021).

30. Мокроусов И., Вязовая А., Жданова С., Умпелева Т., Бадлеева М., Ярусова И., Герасимова А., Мударисова Р., Соловьева Н., Еремеева Н., Вахрушева Д., Пасечник О., Огарков О., Журавлев В. Prevalence of the epidemic variants of the Mycobacterium tuberculosis Beijing genotype across Russian regions European Respiratory Journal, 58 (suppl 65) PA1723 (год публикации - 2021).

31. Мокроусов И., Вязовая А., Синьков В., Герасимова А., Иоаннидис П., Цзяо В., Хромова П., Папавенцис Д., Пасечник О., Пердигао Ж., Растоги Н., Шен А., Скиба Ю., Соловьева Н., Суффис Ф., Тафай С., Умпелева Т., Вахрушева Д., Ярусова И., Жданова С. Practical approach to detection and surveillance of emerging highly resistant Mycobacterium tuberculosis Beijing 1071-32-cluster Scientific Reports, 11(1): 21392 (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
Полученные данные о маркерных мутациях для эпидемических и клинически значимых кластеров штаммов микобактерий туберкулеза могут быть использованы для обновления существующих систем молекулярной диагностики эпидемиологически и клинически значимых генотипов Mycobacterium tuberculosis и слежения за их циркуляцией. Разработанные методы детекции кластеров M. tuberculosis (мультирезистентный Beijing 1071-32 и мультирезистентный, высоколетальный Beijing 14717-15) поданы в качестве заявок на патент и могут быть внедрены в практику эпиднадзора за туберкулезом в России и для совершенствования персонализированной медицины с учетом не только лекарственной устойчивости но и гипервирулентности штамма.