Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Начато изучение морфофункциональных особенностей мельчайших Hexapoda в нескольких направлениях, соответствующих группам задач проекта: расширение круга изучаемых миниатюрных Hexapoda за счет детального изучения мельчайших коллембол; вовлечение в работу новейших методов, в первую очередь трехмерной электронной микроскопии на примере реконструкций органов чувств мельчайших насекомых на клеточном и субклеточном уровнях; экспериментальная функциональная морфология в направлении изучения свойств крыльев различных групп микронасекомых. Впервые детально изучено внутреннее строение миниатюрных коллембол, на примере Mesaphorura sylvatica (Collembola: Tullbergiidae), с помощью гистологических методов и трехмерного компьютерного моделирования. Впервые выделены эффекты миниатюризации в строении коллембол, а также проведено сравнение последствиями миниатюризации у микронасекомых. Показано, что несмотря на малые размеры, некоторые системы у M. sylvatica остались без значительных изменений. Как и у крупных родственных представителей, у M. sylvatica имеются хорошо развитый эндоскелет и сложно устроенная мускулатура. Пищеварительная система также напоминает таковую у более крупных коллембол. Обнаружены эффекты миниатюризации в строении анатомии M. sylvatica, встречающихся также у микронасекомых: полное отсутствие органов кровеносной системы, редукция органов выделительной и пищеварительной систем, непарность половой системы, редукция отдельных мышц. Уникальный эффект миниатюризации в анатомии M. sylvatica – наличие двух пар отверстий в мозгу, через которые проходят три пары мышц. Проведенное исследование имеет важное значение для понимания анатомии и эволюции коллембол. Более того, описанные у M. sylvatica эффекты миниатюризации, включая уникальные черты, расширяют наше понимание миниатюризации Hexapoda. Исследовано строение и ультраструктура педицеллума миниатюрного наездника Megaphragma amalphitanum (Hymenoptera: Trichogrammatidae) на клеточном и субклеточном уровне. Проведена реконструкция всех основных структур педицеллума, в том числе были созданы 3D-модели сенсилл, Джонстонова и центрального органов. Выполнен волюметрический анализ клеток, входящих в состав сколопидиев Джонстонова и центрального органов. Объемы клеток составили от 4 до 43 мкм3. Наиболее крупными оказались обкладочные клетки центрального органа (35±6 мкм3), наиболее мелкими – шапочковые клетки Джонстонова органа (10±1 мкм3). Проведена 3D-реконструкция органелл, продемонстрировавшая наличие расположенных центрально и окруженных множеством митохондрий ядер у нейронов и периферически расположенных, окруженных меньшим количеством мелких митохондрий ядер у обкладочной и шапочковой клетках. Сравнение клеточного и внутриклеточного строения чувствительных органов педицеллума M. amalphitanum с литературными данными по более крупным перепончатокрылым позволило выявить ряд связанных с экстремальной миниатюризацией адаптаций: исчезновение эпителиальной выстилки кутикулы, уменьшение числа сколопидиев до 24, значительное уменьшение количества глиальных клеток. Однако, при этом клеточный состав сколопидиев и ультраструктура клеток Джонстонова органа соответствуют наблюдаемым у крупных перепончатокрылых. По всей видимости, в ходе миниатюризации были редуцированы компоненты, менее критичные для сохранения высокой чувствительности антенны, в то же время, необходимые для функционирования антенны клетки не претерпели значительных изменений. Таким образом, исследование педицеллума антенн M. amalphitanum позволило выявить ряд связанных с миниатюризацией редукций и продемонстрировало отсутствие адаптаций в основном плане строения чувствительных органов педицеллума. Наши результаты обозначают предел миниатюризации, возможный при условии сохранения высокой чувствительности и функциональности антенны паразитического наездника. На основе трехмерной электронной микроскопии головы наездника-яйцееда Megaphragma amalphitanum (Trichogrammatidae) выполнена уникальная трехмерная реконструкция фоторецепторного аппарата сложного глаза насекомого. Реконструкция фоторецепторов всех 29 омматидиев сложного глаза предоставила первые уникальные данные о трехмерной организации и расположении клеток и субклеточных элементов в ретине миниатюрного сложного глаза. Полученные данные о размерных показателях клеток и форме органелл, помогли определить морфологические и функциональные адаптации, связанные с миниатюризацией сложных глаз. Показано, что наибольший вклад в формирование рабдома принадлежит фоторецепторам с длинными зрительными волокнами, которые также, вероятно, специализированы на восприятии УФ. Реконструкция проекций фоторецепторов позволила разделить оптические картриджи на две группы исходя из характера синаптических паттернов, которые совпали с функционально-морфологическими группами омматидиев. Экстремальная экономия места при миниатюризации приводит к исключительной компактизации всех клеточных элементов и достижению оптимального баланса структурных параметров. Уменьшение размера и длины рабдома компенсируется увеличением кривизны линзы и относительного диаметра рабдома. Уменьшение объема клеток приводит к уменьшению места для ключевых органелл, которое отражается на снижении энергетического потенциала клетки. Однако, рецепторные клетки глаза микронасекомого не только не утрачивают функциональности и сохраняют ядра, при том что 95% клеток нервной системы Megaphragma безъядерны, но и находят способ увеличить относительный объем органелл за счет усложнения их структуры. Проведенный комплексный морфологический анализ проекций фоторецепторов, а также рабдомерной организации фоторецепторов показал наличие специализированных областей глаза (группы омматидиев чувствительных к поляризационному свету). Результаты проекта вносят фундаментальный вклад в изучение морфологии сложных глаз насекомых и являются необходимым этапом для изучения биоэнергетических процессов фоторецепторов, которые несомненно найдут свое применение в современной бионике. Сконструирована новая установка для синхронной скоростной макровидеосъемки, которая позволяет записывать свободный полет микронасекомых одновременно с четырех ракурсов в инфракрасном свете. Получены видеозаписи полета мельчайших двукрылых Corynoneura sp. (Diptera: Chironomidae) и Leptocera sp. (Diptera: Sphaeroceridae), на основе которых была изучена деформация крыльев в полете. Деформация крыльев Paratuposa sp. (Coleoptera: Ptiliidae) также была измерена по уже имеющимся скоростным видеозаписям. Изгиб крыла изученных миниатюрных двукрылых равномерный, продольный профиль крыла имеет вогнутую форму. Амплитуда деформаций у Corynoneura sp. составил 16,7°, а у Leptocera sp. 13,8°. Крыло Paratuposa sp., состоящее из черешка, пластины и прикрепленных к ней щетинок, при взмахе вниз имеет S-образный профиль и вогнутый при взмахе вверх за счет того, что черешок всегда изогнут в направлении дорсальной поверхности крыла. Амплитуда деформации черешка 3,5°, пластинчатой части с щетинками 7,6°, а амплитуда деформации крыла в целом 16,5°. Изгиб щетинок сопоставим с изгибом пластинчатой части, несмотря на их малое сечение. Методом конфокальной микроскопии изучено распределение резилина в крыльях выбранных видов. В крыльях Corynoneura sp. и Leptocera sp. резилин равномерно распределен в мембране в малом количестве, наиболее высока его концентрация в элементах жилкования. Такое распределение резилина обуславливает равномерность деформации крыла у данных видов. У Paratuposa sp. он присутствует в большом количестве в черешке, а также в крыловой пластине в местах ее сложения в покое и в местах крепления щетинок, но отсутствует в самих щетинках. Это объясняет относительную жесткость и низкую степень деформации тонких щетинок, в то время как черешок и пластина заметно изгибаются под воздействием набегающего потока воздуха. Таким образом, мембранозные и перистые крылья микронасекомых различных отрядов имеют сходный уровень деформаций при принципиально различной морфологии, и эти деформации не значительно выше, чем у крупных насекомых, не смотря на значительное увеличение относительно вязкости воздуха при таких мелких размерах тела. Результаты первого года проекта являются большим шагом в изучении функционально и эволюционной морфологии миниатюрных Hexapoda и значительно дополняют наши представления о явлении миниатюризации в животном мире.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках проекта продолжено изучение функциональной морфологии миниатюрных шестиногих (Hexapoda) в нескольких направлениях, основные из них: изучение особенностей анатомии коллембол, связанных с миниатюризацией; изучение трехмерной ультраструктуры антенн и глаз одного из мельчайших насекомых Megaphragma (Hymenoptera: Trichogrammatidae); изучение реакции фотоадаптации в сложном глазу Megaphragma; исследование полетных характеристиках миниатюрных двукрылых и других микронасекомых. С использованием комплекса современных методов изучения анатомии микроскопических членистоногих детально исследовано строение мельчайших слитнобрюхих коллембол на примере вида Megalothorax minimus. Показано, что, несмотря на предельно малые размеры тела, характерно сохранение высокого уровня организации и комплексности многих систем органов (парные половые железы, полный набор головных желез, сложно устроенные эндоскелет). С другой стороны, внутреннее строение имеет ряд особенностей, связанных с миниатюризацией, общих с описанными нами ранее для миниатюрной членистобрюхой коллемболой Mesaphorura sylvatica (отсутствие органов кровообращения, отсутствие мышц средней кишки, редукция части мышц). Анатомия M. minimus имеет и уникальные черты – высокое число мышц груди, связанных с ногами, значительно превышающее таковое у других изученных коллембол; значительное сокращение числа брюшных мышц; крайне разнообразные впячивания кутикулы для крепления мышц, своеобразная камерная организация средней кишки. Многие эволюционные изменения, к которым приводила миниатюризация Megalothorax, сходны с таковыми, наблюдаемыми у ряда групп микронасекомых. Вместе с тем, полученные данные показывают, что реализованные пути анатомических изменений, связанных с миниатюризацией, приводят у Hexapoda не только к параллелизмам, но и к возникновению признаков уникальных для отдельных групп шестиногих. Изучена ультраструктура скапуса и флагеллума антенн миниатюрного наездника Megaphragma amalphitanum (Hymenoptera: Trichogrammatidae), детально исследована иннервация сенсилл восьми морфофункциональных типов, расположенных на данных сегментах. Реконструированы основные структуры, в том числе кутикулярная поверхность сегментов, кутикулярные волоски сенсилл и дендриты и тела иннервирующих их биполярных нейронов. Механосенсорные и проприоцептивные сенсиллы иннервированы единственным нейроном, содержащим трубчатое тело в дендрите, прилежащем к кутикулярному кратеру. Две однопоровые сенсиллы второго флагелломера иннервированы пятью нейронами, в то время как в однопоровой сенсилле третьего флагелломера расположены дендриты двух нейронов; по всей видимости, они являются контактными хеморецепторами. Было обнаружено, что дендриты 11/12 нейронов уникальных беспоровых плакоидных сенсилл и 19/22 нейронов мультипоровых плакоидных сенсилл разветвлены внутри сенсилл. Апикально на антенне расположены термо/гигрорецепторная стилоконическая сенсилла с отростками трех нейронов, и вкусовая базиконическая сенсилла с дендритами девяти нейронов. Иннервация и ультраструктура сенсилл оказались схожи с таковыми у более крупных паразитических наездников. Полученные данные говорят о сохранении сложной ультраструктуры в процессе масштабирования антеннальных сенсилл у паразитических наездников. Завершена первая полная клеточная трехмерная реконструкция целого сложного глаза одного из мельчайших летающих насекомых Megaphragma amalphitanum Viggiani, 1997 (Trichogrammatidae). В ходе данного этапа проекта построена модель светопреломляющего и светоизолирующего аппаратов. Получены уникальные данные о точном размере, количестве и объеме структурных элементов глаза. Отмечена редукция и с сокращение числа вторичных пигментных клеток в составе светоизолирующего аппарата. Проведён волюметрический анализ пигментных гранул и палисада ретинальных клеток, а также пигментных гранул вторичных и первичных пигментных клеток. Анализ морфологических и оптических параметров сложных глаз Megaphragma показал, что миниатюризация приводит к существенному сокращению разрешающей способности, но при этом не приводит к снижению чувствительности, которая сопоставима с чувствительностью сложных глаз крупных насекомых. Результаты проекта имеют фундаментальное значение в изучении морфологии сложных глаз и являются важным заделом для передовых направлений в изучении зрительного процессинга у животных. Полученные в результате работы реконструкции и измерения миниатюрных оптических аппаратов, могут стать основой для проектирования биомиметических моделей оптических систем. Детально изучена структура ретины при свето- и темновой адаптации глаза Megaphragma amalphitanum, показано отсутствие признаков ретиномоторных явлений в мельчайшем глазу аппозиционного типа. Ультраструктурный анализ фоторецепторов показал отсутствие значимых отличий в строении клеток, рабдома, а также положении пигментных гранул при разных условиях освещённости. Свободный полет миниатюрных двукрылых Hydrellia albolabris (Ephydridae), Leptocera sp. (Sphaeroceridae) и Corynoneura scutellata (Chironomidae) был заснят на синхронизированные скоростные камеры, по видеозаписям были реконструированы траектории полета и измерены скорости и ускорения. Длина тела исследованных объектов находится в диапазоне от 0,87 до 2,04 мм. Показано, что средняя скорость горизонтального полета изученных двукрылых составляет от 39,9 до 48,8 см/с, максимальная от 0,99 до 1,19 см/с, а максимальные ускорения от 13,5 до 16,5 см/с2. Полученные значения полетных характеристик выше, чем у жесткокрылых семейства Staphylinidae со сходной длиной тела и сравнимы со скоростями полета крупных Ptiliidae (Coleoptera) и Thripidae (Thysanoptera). Относительная скорость горизонтального полета Corynoneura scutellata в среднем составляет 495, а максимальная до 1370 длин тела в секунду. Эти значения выше, чем ранее описанные рекордные среди всех животных относительные скорости у Acrotrichis sericans (437 и 975 длин тела в секунду, соответственно). В то время как высокие значения скоростей и ускорений Ptiliidae и Thripidae связаны с перистым строением крыльев, у миниатюрных высших двукрылых они могут быть объяснены большой относительной массой мышц птероторакса и их физиологическими особенностями, обеспечивающими в том числе высокую частоту взмахов крыльев, что требует дополнительных исследований. Результаты второго года проекта значительно дополняют ниши представления о влиянии миниатюризации на функциональную морфологию шестиногих и приближают нас к формулировке общих принципов миниатюризации животных.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За третий год проекта завершена работа в нескольких направлениях изучения функциональной морфологии миниатюрных шестиногих (Hexapoda), основные из них: изучение особенностей анатомии коллембол, связанных с миниатюризацией; функциональное картирование глаза одного из мельчайших насекомых Megaphragma (Hymenoptera: Trichogrammatidae); исследование механики полета миниатюрных двукрылых и других микронасекомых; масштабный аллометрический анализ данных. Проведен сравнительно морфологический анализ особенностей, связанных с миниатюризацией, у миниатюрных коллембол из разных подклассов (Poduromorpha: Tullbergiidae и Neelipleona: Neelidae), который показал сходство ряда тенденций, но вместе с тем позволил выявить и ряд уникальных особенностей. У миниатюрных коллембол обеих изученных групп отсутствуют органы кровеносной и дыхательной систем. Центральная нервная система изученных видов данных классов не подвергается заметному упрощению, сохраняет симметрнию и высокий уровень дифференцировки цепочки ганглиев. У Mesaphorura sylvatica (Neelidae) через мозг проходят три пары мышц: особенность, до сих пор не отмеченная ни у каких других видов шестиногих. У M. sylvatica упрощена половая система: семенник и семяпровод самца, а также яичник и яйцевод самки непарные. У Megalothorax minimus (Tullbergiidae), напротив, сохраняется парность яичников. Набор мышц обоих изученных видов не сильно отличается от такового крупных коллембол. На основе уникальных данных трехмерной электронной микроскопиии (FIB-SEM) целой головы M. amalphitanum с разрешением 8 нм на пиксель по xyz измерениям, мы впервые провели функциональное картирование сложного глаза и сопоставили ее с коннектомом первого оптического нейропиля (ламины). Результаты этого комплексного анализа показали ретинотопную специализации дорзальной группы омматидиев, видимо специализированную на восприятии поляризационного света. Исследована кинематика полета двух видов миниатюрных двукрылых насекомых: Leptocera sp. (Brachycera: Sphaeroceridae и Corynoneura scutellata (Nematocera: Chironomidae) с длиной тела около 1 мм. Свободный полет насекомых записан на четыре синхронизированные скоростные видеокамеры, по полученным видеозаписям выполнена трехмерная реконструкция кинематики крыльев. Как и у других миниатюрных насекомых у исследованных Sphaeroceridae и Chironomidae происходит возрастание амплитуды и частоты взмахов. У Leptocera это приводит к появлению нижнего хлопка крыльями. У C. scutellata амплитуда взмахов остается достаточно низкой за счет крайне высокой (около 1 кГц) частоты взмахов. В то же время исследованные Chironomidae имеют высокие углы атаки (более 80°) при взмахе вниз, что говорит о преобладании лобового сопротивления крыльев в генерации аэродинамических сил и большей асимметрии крылового цикла по сравнению с более крупными Nematocera, имеющими высокую частоту взмахов. В результате масштабного анализах летных характеристик насекомых различного размера и разных отрядов показано, что скорость полета ожидаемо снижается во всех таксомических группах с уменьшением размеров тела, но микронасекомые, имеющие перистые крылья, имеют более высокие скорости полета, чем мембранознокрылые за счет уменьшения массы крыльев и инерционных потерь мощности. Исключение составляют миниатюрные двукрылые, высокая эффективность полета которых сохраняется благодаря большому относительному объему крыловой мускулатуры. Кинематика крыльев исследованных насекомых изменяется при миниатюризации таким образом, чтобы повысить аэродинамическую эффективность работы крыльев в условиях низких чисел Рейнольдса. Представители разных таксономических групп демонстрируют различные адаптации к этим условиям в зависимости от особенностей строения крылового аппарата. Для всех изученных нами перокрылых микронасекомых характерна большая амплитуда взмахов и относительно невысокая частота. Для Thripidae и Trichogramma telengai характерна U-образная траектория крыла, большие углы атаки во время трансляций, и наличие верхнего хлопка в крыловом цикле. При экстремальной миниатюризации у Trichogrammatidae траектория крыла претерпевает значительные изменения, что было показано для наездников Megaphragma amalphitanum: взмах вверх остается U-образным, но верхний хлопок модифицирован в возвратное движение, во время которого схлопнутые крылья продолжительное время движутся вместе. После возвратного движения происходит прямой взмах вниз. Самая необычная кинематика была описана у Ptiliidae, которые имеют в цикле как верхнее, так и нижнее возвратное движение, а взмахи крыльев практически перпендикулярны. Такая кинематика возможна благодаря активным движениям надкрылий, которые компенсируют крутящий аэродинамический момент, создаваемый крыльями и вдвое снижают колебания тела по тангажу. Проведен масштабный аллометрический анализ зависимости размеров органов от размеров тела в разны группах Hexapoda на основании результатов проекта, данных, полученных нами ранее и литературных данных. Расширение круга объектов, для которых проведен аллометрический анализ зависимости объемов органов от размеров тела, подтвердило ранее описанные тенденции для большинства систем органов. Однако для ряда органов двукрылые и коллемболы демонстрируют значения объемов, принципиально отличающиеся от таковых у других микронасекомых. В первую очередь это относится к относительному объемы половой системы изученных миниатюрных двукрылых, который в десятки раз меньше, чем у других Hexapoda того же размерного класса. Обобщение результатов проекта с данными полученными ранее позволило выделить основные принципы влияния миниатюризации на морфологию Hexapoda. Расширение круга изученных микронасекомых и вовлечение в анализ колембол подтвердило предположения, высказанные нами ранее. Большинство систем органов Hexapoda демонстрируют колоссальные возможности к масштабированию и сохраняют сложное строение, функциональность и даже относительные размеры, не смотря на предельное уменьшение размеров тела. Хуже всего миниатюризацию переносит нервная система, для которой необходимость сохранения функционального числа нейронов приводит к многократному увеличения относительного объема, асимметрии, изменению формы и расположения ганглиев вплоть до лопастной или перфорированной структуры мозга, а в предельных случаях к лизису тел и ядер нейронов. Таким образом, подтверждается одна гипотез о структурных факторах, ограничивающих миниатюризацию животных – размеры нервной системы, ограниченные минимальным числом и размеров нейронов, являются одним основных факторов, лимитирующих минимальные размеры тела. Результаты третьего года проекта значительно дополняют наши представления о влиянии миниатюризации на функциональную морфологию шестиногих и приближают нас к формулировке общих принципов миниатюризации животных.