КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-14-00151

НазваниеМолекулярные и клеточные эффекты ультракороткого импульсного излучения

РуководительОсипов Андреян Николаевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2019 - 2021

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-211 - Радиобиология

Ключевые словалинейный ускоритель с лазерным фотокатодом, ультракороткие электронные импульсы, фемтосекундные лазерные импульсы, двунитевые разрывы ДНК, репарация ДНК, клеточный цикл, пролиферация, клеточная гибель, клетки человека, сигнальные пути, анализ транскриптомных данных

Код ГРНТИ34.49.19


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В последние годы стремительными темпами разрабатываются ускорители нового поколения, принцип действия которых основан на ускорении заряженных частиц электромагнитной волной, создаваемой импульсным лазерным изучением. Предполагается, что ускорители этого типа могут сделать революцию в радиационной терапии опухолей. Помимо существенно меньших размеров и стоимости, несомненным преимуществом лазерных ускорителей является возможность создания направленных ультракоротких (фемто- и пикосекундных) моноэнергетических пучков ускоренных частиц с минимальным боковым рассеиванием. Это дает возможность ювелирно-дозированного локального воздействия на солидные опухоли с минимальным облучением нормальных тканей. При этом конструкторские разработки в этой области намного опережают радиобиологические исследования. Существуют лишь единичные публикации о биологических эффектах, индуцированных воздействием ультракоротких импульсов электронных пучков. Исследования особенностей формирования этих эффектов лишь начинаются, фактически речь идет о новом направлении в радиационной биологии и медицине. В тоже время фемтосекундное лазерное излучение в ближнем инфракрасном диапазоне (800-1100 нм) широко используется в биологических исследованиях, в том числе в качестве сверхточного «скальпеля» для осуществления микрохирургических воздействий. В основе такого применения лежат принципы нелинейного поглощения лазерных импульсов с высокой пиковой мощностью и последующего создания в области поглощения плазмы низкой плотности. Воздействие этой плазмы на биологический материал также может приводить к возникновению желательных радиобиологических эффектов. Поскольку длительность облучения (и в случае ускоренных электронов, и в случае лазерных импульсов) короче времени протекания многих химических реакций в облученных клетках, можно предположить возникновение иных/новых радиационных процессов, которые могут повлиять на радиобиологическую эффективность облучения. Целью настоящего проекта является изучение особенностей формирования молекулярных и клеточных радиобиологических эффектов при облучении нормальных и опухолевых клеток человека пикосекундными импульсами пучков ускоренных электронов и лазерными импульсами фемтосекундной длительности. Такой комплексный подход преследует две основных задачи: 1) оба вида воздействия вызывают биологические эффекты за счёт ионизации биологического материала, совместное рассмотрение этих эффектов позволит получить информацию о механизмах воздействия как импульсов ускоренных электронов, так и фемтосекундных лазерных импульсов; 2) применяя стандартизованные методы исследования биологических эффектов, вызываемых этими методами воздействия, удастся развить подходы терапии для обоих видов облучения одновременно. Для импульсного облучения будет использоваться лазерный ускоритель электронов AREAL (Advanced Research Electron Accelerator Laboratory, Армения) и комплекс фемтосекундной лазерной нанохирургии, разработанный в лаборатории био- и нанофотоники ИХФ РАН. В качестве референтного источника электронного излучения будет использоваться линейный ускоритель электронов Varian Trilogy (Varian Medical Systems, США). Исследования будут проводиться на первичных культурах нормальных клеток (фибробласты кожи) и перевиваемых культурах опухолевых клеток (SK-MEL-2,MCF7, A549). В ходе выполнения проекта планируется исследовать: 1) индукцию и репарацию повреждений ДНК; 2) задержку клеточного цикла и пролиферативную активность; 3) клеточную гибель. При изучении особенностей индукции и репарации ДНК особый акцент будет сделан на изучении критических радиационно-индуцированных повреждений ДНК - двунитевых разрывов (ДР). Считается, что именно ДР ДНК являются основным триггером запускающим процессы клеточного отклика на воздействие ионизирующего излучения. Репарация ДР ДНК происходит довольно медленно, в то время как ДР, не устраненные в ходе репарации ДНК, приводят к серьезным цитогенетическим нарушениям, гибели клеток, инактивации генов супрессоров опухолей или активации онкогенов. Для изучения механизмов репарации, количества и характера распределения ДР в клеточном ядре будет использоваться иммуноцитохимический анализ белков, участвующих в процессах репарации ДР ДНК. Во время распознавания и репарации двунитевых разрывов (ДР) ДНК происходит образование динамических микроструктур, получивших название foci и содержащих от сотен до тысяч копий различных белков, задействованных в этих процессах (гамма-Н2АХ, фосфо-АТМ, 53BP1, RAD51 и др.). Количественный анализ фокусов белков репарации ДНК и их локализации/солокализации в пострадиационный период позволяет дать ответ не только о количестве ДР и их пространственном распределении в клеточном ядре, но и эффективности и механизмах их репарации. В зависимости от количества повреждений и эффективности репарации ДНК в клетках может запускаться арест клеточного цикла, вплоть до полного ингибирования пролиферации. Поэтому для оценки радиобиологических эффектов чрезвычайно важно оценивать продолжительность клеточного цикла и пролиферативную активность клеток. Для этого в ходе настоящего проекта будет использоваться иммуноцитохимический анализ соотношения клеток позитивных по белкам маркерам клеточной пролиферации (Ki-67) и фазам клеточного цикла (Cyclin-A, CENPF и т.д.), а также проточно-цитометрический анализ клеточного цикла. И наконец, для оценки интегральных клеточных эффектов будет оцениваться доля репродуктивно погибших клеток (клоногенный анализ) и соотношение клеток, гибнущих по механизмам апоптоза и аутофагии. Клоногенный анализ являются «золотым стандартом» для оценки радиобиологических эффектов. Именно потеря репродуктивной способности является наиболее общей характеристикой клеточной популяции. Так, клетка, сохраняющая способность к биосинтезу белков и ДНК, а также способная митотически поделиться один или два раза, но не образующая большого числа потомков, считается погибшей в качестве репродуктивной единицы в популяции клеток. Для оценки общей биологической эффективности (ОБЭ) ультракоротких импульсов пучков ускоренных электронов будет проведено сравнение с эффектами референтного излучения. Для понимания молекулярных механизмов действия ультракоротких импульсов пучков ускоренных электронов по сравнению с другими режимами облучения клеток человека будут использованы подходы массового транскриптомного анализа клеточных образцов на основе технологии полногеномного секвенирования. Сравнительный анализ транскриптомов облученных образцов с транскриптомами необлученных контролей будет проводиться при помощи одного из наиболее совершенных алгоритмов анализа сигнальных путей iPANDA (insilico Pathway Activation Network Decomposition Analysis), авторы которого являются участниками проекта (Ozerov et al., Nature Commun., 2016). Используя данный метод, будут определены наиболее значимые сигнальные пути, определяющие клеточный ответ на воздействие ультракоротких импульсов ускоренных электронов. Особое внимание будет уделено анализу сравнительной активации сигнальных каскадов, ассоциированных с репарацией ДНК, пролиферативной активностью и клеточной гибелью.

Ожидаемые результаты
В ходе выполнения проекта планируется получить следующие конкретные результаты: 1) Будут изучены зависимости количества двунитевых разрывов ДНК в опухолевых и нормальных клетках человека от дозы и режима облучения пучками ускоренных электронов и фемтосекундными лазерными импульсами. 2) Будет проведен сравнительный анализ кинетики, вклада основных путей репарации (негомологичное соединение концов и гомологичная рекомбинация) и эффективности (остаточные повреждения) репарации двунитевых разрывов ДНК в опухолевых и нормальных клетках человека, облученных импульсными и квазинепрерывными пучками ускоренных электронов. 3) Будет дана оценка изменений продолжительности клеточного цикла, доли клеток в S/G2 фазе (S/G2 клеточный арест) и общей пролиферативной активности в культурах нормальных и опухолевых клеток человека после импульсного и квазинепрерывного облучения. 4) Будет исследовано влияние импульсного облучения на индукцию клеточной гибели опухолевых и нормальных клеток человека. При этом будет анализироваться соотношение клеток, гибнущих по механизмам апоптоза и аутофагии и доля репродуктивно погибших клеток с помощью клоногенного теста. 5) На основании сравнения выраженности изученных радиобиологических эффектов воздействия ультракоротких импульсов ускоренных электронов с эффектами референтного излучения будет сделана оценка общей биологической эффективности ультракороткого импульсного электронного облучения. 6) Будет проведен предварительный подбор оптимального режима импульсного облучения, вызывающего наиболее выраженный эффект (репродуктивная и интерфазная гибель, снижение пролиферативной активности) в перевиваемых культурах опухолевых клеток. 7) Будет проведен анализ сигнального ландшафта клеточных образцов, подвергшихся воздействию ультракоротких импульсов пучков ускоренных электронов и фемтосекундных лазерных импульсов, путем транскриптомного профилирования и последующего анализа профилей при помощи алгоритма анализа сигнальных путей iPANDA. Результаты исследований помогут выбрать дальнейшую стратегию исследований возможности использования импульсного излучения для создания новых технологий радиационной терапии злокачественных новообразований у человека. Уровень ожидаемых результатов опережает мировой, что определяется уникальными возможностями ускорителя AREAL, современными методами исследования и системным методологическим подходом. По результатам, полученных в ходе выполнения проекта планируется опубликовать не менее 8 статей в авторитетных международных журналах, индексируемых в базах данных Web of Science Core Collection и Scopus и не менее 4 статей в Российских профильных журналах, индексируемых в базе данных Scopus.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В последние годы активно развиваются технологии для получения лазер-генерируемых ускоренных электронов. Лазер-генерируемые пучки ускоренных электронов отличаются сверхкороткими импульсами в диапазоне от фемто- до пикосекунд. Однако конструкторские разработки в этой области намного опережают радиобиологические исследования. Существуют лишь единичные публикации о биологических эффектах ультракоротких электронных импульсов. Мощность дозы излучения во время импульса достигает колоссальных значений (до десятков ГГр/с), а время самого импульса (от сотен фс до нескольких пс) несоизмеримо меньше времени полужизни (t1/2) свободных радикалов (для примера t1/2 гидроксил радикала ~ 1 нс). Это позволяет предположить, что при сверхкоротком импульсном излучении происходят ранее неизученные физико-химические процессы, которые могут повлиять на радиобиологическую эффективность излучения. В 2019 г. были проведены сравнительные исследования индукции критических повреждений ДНК и эффективности их репарации в культивируемых клетках человека, облученных субпикосекундным импульсным и квазинепрерывным излучением. Исследования были выполнены на культуре фибробластов легких человека MRC-5 и культурах опухолевых клеток человека HeLa (рак шейки матки) и A549 (аденокарцинома легких). Клетки культивировались в стандартных условиях СО2-инкубатора (5 % СO2, 37°C) с использованием сред и сывороток, рекомендованных ведущей глобальной организацией биологических материалов и стандартов (ATCC) для культивирования каждой конкретной клеточной линии. Облучение клеток субпикосекундными пучками электронов проводили на линейном ускорителе с лазерным фотокатодом АРЕАЛ (AREAL-Advanced Research Electron Accelerator Laboratory) в Институте Синхротронных Исследований “КЕНДЛ” (CANDLE -Center for the Advancement of Natural Discoveries using Light Emission) Республики Армения. Основные параметры электронного пучка: энергия электронов - 3.6 МэВ, заряд импульса - 30 пКл, длительность импульса - 450 фс, частота повтора импульсов – 2 Гц. Облучение клеток квазинепрерывным электронным излучением проводили на линейном ускорителе электронов Varian Trilogy (Varian Medical Systems, США). Характеристики: энергия электронов - 4 МэВ, мощность дозы 4 Гр/мин. В качестве источника квазинепрерывного фотонного излучения использовали рентгеновские установки РУСТ-М1 (Россия) и РУМ-17 (Россия), мощность дозы 0.85 и 0.24 Гр/мин, соответственно. Отдельно стоящей задачей проекта было изучение влияния лазерного фемтосекундного излучения на индукцию двунитевых разрывов ДНК (ДР ДНК). Облучение клеток проводили с использованием комплекса фемтосекундной лазерной нанохирургии, разработанный в лаборатории био- и нанофотоники ФИЦ ХФ РАН (лазер Mai-Tai Spectra-Physics, длина волны 795 нм, длительность импульса 100 фс, частота повторения 80 МГц). При малых значениях энергии одного импульса порядка 1-2 нДж, за счёт использования объективов с числовой апертурой 0.7 и выше достигается высокая плотность потока мощности порядка 10 ТВт/см^2, что и обеспечивает высокую эффективность многофотонных процессов. Результатом многофотонного поглощения фемтосекундного лазерного излучения является образование плазмы низкой плотности за счет процессов многофотонной ионизации и туннельной ионизации. Таким образом, фемтосекундное лазерное излучение можно рассматривать как ионизирующее излучение, обладающее при этом высокой степенью локализации. Оценку особенностей индукции и репарации двунитевых разрывов (ДР) проводили с использованием иммуноцитохимического окрашивания клеток антителами, специфичными к белкам, участвующих в процессах репарации ДР. Во время распознавания и репарации ДР ДНК происходит образование динамических микроструктур, получивших название foci и содержащих от сотен до тысяч копий различных белков, задействованных в этих процессах (гаммаН2АХ, фосфо-АТМ, 53BP1, RAD51 и др.). Количественный анализ фокусов белков репарации ДНК и их локализации/солокализации в пострадиационный период позволяет дать ответ не только о количестве ДР, но и об эффективности и механизмах их репарации. Визуализацию, документирование и обработку иммуноцитохимических микроизображений осуществляли на люминесцентном микроскопе Nikon Eclipse Ni-U (“Nikon”, Япония), оснащенном видеокамерой высокого разрешения ProgRes MFcool (“Jenoptik AG”, Германия). Анализировали не менее 200 клеток на точку. Для автоматического анализа фокусов белков репарации ДНК использовали программные пакеты DARFI (Озеров, 2014, https://github.com/varnivey/darfi) и FociCounter (http://focicounter.sourceforge.net/). На первом этапе исследований был проведен сравнительный анализ кривых «доза-эффект» образования фокусов белков-маркеров двунитевых разрывов ДНК (γH2AX/53BP1) в клетках линий MRC-5, HeLa и А549, облученных субпикосекундным импульсным (ускоритель AREAL) и квазинепрерывным излучением (ускоритель Varian Trilogy). Было показано, что через 60 мин после облучения, вне зависимости от типа излучения, дозовые зависимости изменений количества фокусов γH2AX/53BP1 в облученных клетках хорошо аппроксимируются линейными уравнениями. Количественный выход фокусов, в пересчете на единицу дозы, был на 7-15 % выше в клетках, облученных импульсным излучением. Однако эти различия не были статистически достоверными (р>0,05). Не было также отмечено различий при сравнении линейных угловых коэффициентов. В целом, проведенные исследования показали, что количественный выход двунитевых разрывов ДНК в облученных клетках существенно не зависит от режима облучения: субпикосекундное импульсное или квазинепрерывное. Также не было отмечено статистически достоверных различий выхода двунитевых разрывов ДНК при облучении клеток электронным или рентгеновским излучением. Результаты исследований влияния лазерного фемтосекундного излучения показали, что после облучения клеток фемтосекундными импульсами с энергией 1.0 и 1.5 нДж и общей экспозицией до 180 мс в клеточных ядрах отмечаются выстроенные в ряд одиночные фокусы белков гаммаН2AX и 53BP1. Увеличение энергии импульсов до 2.0 нДж с сокращением времени экспозиции до 60 мс приводит к образованию треков, состоящих из фокусов белков гаммаН2AX и 53BP1, локализованных строго в местах прохождения луча лазера по клеточным ядрам. Визуально треки очень похожи на треки, образующиеся после облучения клеток корпускулярным ионизирующим излучением с высокой линейной передачей энергии (ЛПЭ). Можно полагать, что фемтосекундное лазерное излучение можно использовать для моделирования процессов повреждения ДНК плотноионизирующим излучением в живых клетках. Дальнейшее увеличение энергии импульсов до 2.5-3.0 нДж приводило к локальному вскипанию (абляции) клеток. На следующем этапе работы по проекту были проведены исследования кинетики репарации двунитевых разрывов ДНК в опухолевых и нормальных клетках человека, облученных импульсным и квазинепрерывным ионизирующим излучением. Было показано, что в клетках, облученных импульсным излучением, эффективность репарации ДР ДНК значительно ниже по сравнению с репарацией ДР ДНК, индуцированных квазинепрерывным ионизирующим излучением. Так, в клетках, облучённых квазинепрерывным ионизирующим излучением, через 4-6 ч после воздействия количество фокусов снижалось ~ на 60-70 % по сравнению с количеством фокусов гаммаН2AX, регистрируемых в точке максимума (1ч после облучения), а через 24-48 ч после облучения ~ на 90-95 %. Через 4-6 ч после воздействия субпикосекундного импульсного излучения отмечалось снижение количества фокусов всего лишь на 40-50 %, а через 24-48 ч на 70-80 %. Низкая эффективность репарации двунитевых разрывов ДНК, индуцированных импульсным излучением, наблюдалась как в нормальных, так и в опухолевых клетках, что не позволяет на данном этапе исследований сделать заключение о большей противоопухолевой эффективности действия импульсного излучения. На следующем этапе работы были проведены исследования вклада гомологичной рекомбинации в репарацию двунитевых разрывов ДНК в клетках, облученных импульсным и квазинепрерывным ионизирующим излучением. Было обнаружено, что вклад гомологичной рекомбинации в репарацию двунитевых разрывов ДНК, индуцированных импульсным излучением, был выше по сравнению с репарацией разрывов, индуцированных квазинепрерывным излучением. Аналогичные закономерности были выявлены и при облучении фемтосекундным лазерным излучением. Однако необходимо отметить, что существенная вариабельность этого показателя не позволяет сделать однозначное заключение и требует проведения дополнительных исследований. На заключительном этапе работы проводили сравнительные исследования количества остаточных фокусов репарации ДНК в опухолевых и нормальных клетках человека, облученных импульсным субпикосекундным и квазинепрерывным ионизирующим излучением. Результаты работы показали, что количество остаточных фокусов γH2AX/53BP1, регистрируемых через 24-48 ч после воздействия импульсного излучения выше, чем после воздействия квазинепрерывного излучения. Повышенный выход остаточных фокусов подтверждает вывод о низкой эффективности репарации двунитевых разрывов ДНК, индуцированных импульсным субпикосекундным излучением. Дополнительно на клетках линии MRC-5 были проведены исследования цитогенетических эффектов с помощью микроядерного теста и клеточной гибели по механизму апоптоза с помощью проточно-цитометрического анализа Annexin-V позитивных клеток. Показано, что биологическое действие импульсного субпикосекундного излучения характеризуется выраженной индукцией апоптоза и низким выходом клеток с микроядрами вследствие элиминации поврежденных клеток по сравнению с эффектами квазинепрерывного излучения. В целом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что импульсное субпикосекундное излучение приводит к образованию более сложных и труднорепарируемых повреждений ДНК, по сравнению с квазинепрерывным. Необходимо продолжать исследования механизмов биологического действия импульсного субпикосекундного излучения.

 

Публикации

1. - Ученые выяснили, как излучение лазерных ускорителей влияет на живые клетки Indicator.Ru, Indicator.Ru /Биология/ 03 НОЯБРЯ 2019 (год публикации - ).

2. - Ученые выяснили, как излучение лазерных ускорителей влияет на живые клетки Газета.Ру, Газета.Ру / 31 октября 2019 (год публикации - ).

3. Бабаян Н.С., Григорян Б., Хондкарян Л., Тадевосян Г., Саркисян Н., Григорян Р., Апресян Л., Арутюнян Р.М., Воробьева Н.Ю., Пустовалова М.В., Грехова А.К., Осипов А.Н. Laser-Driven Ultrashort Pulsed Electron Beam Radiation at Doses of 0.5 and 1.0 Gy Induces Apoptosis in Human Fibroblasts International Journal of Molecular Sciences, V. 20. No. 20. pii: E5140. (год публикации - 2019).

4. Ованнисян Г., Арутюнян Т., Арутюнян Р., Лиер Т. DNA Copy Number Variations as Markers of Mutagenic Impact International Journal of Molecular Sciences, V. 20. No. 19, pii 4723 (год публикации - 2019).