Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Артемизинин - терпеновый лактон, содержащийся в растении полынь однолетняя (Artemisia annua), и обладающий высокой антималярийной активностью. В настоящее время, комбинированные с артемезинином лекарственные средства, являются наиболее эффективными препаратами для лечения малярии, использование таких препаратов рекомендовано резолюцией ВОЗ WHA60.18 (май 2007) и является стандартом лечения во всем мире. Важно отметить, что помимо малярии, артемизинин и его производные также эффективны против многих паразитических гельминтов, включая шистосом, а также различных линий человеческих опухолевых клеток. Основным препятствием, сдерживающим использование артемизинина в клинической практике, является его высокая стоимость. Содержание артемизина в A. annua обычно находится в диапазоне 0,01-0,8% от сухого веса, что недостаточно для обеспечения глобальной потребности в артемизинин-содержащих лекарствах. Улучшение агротехники и селекция A. annua пока не привели к существенному улучшению выхода артемизинина что вызвало значительный интерес к разработке методов получения артемизинина в гетерологичных растениях-продуцентах. Путь биосинтеза артемизинина в A. annua к настоящему времени хорошо изучен. К настоящему времени артемизинин был получен в гетерологичных экспрессионных системах - табаке (Farhi et al., 2011; Malhotra et al., 2016; Wang et al., 2016) и мхе Physcomitrella patens (Ikram et al., 2017). Накопление артемизинина в тканях продуцента в этих исследованиях было низким. Это могло быть обусловлено, в частности, дефицитом его предшественников. Очевидным способом увеличения продукции артемизинина в гетерологичных системах является выбор растения-продуцента с естественно высоким содержанием терпеноидов и их предшественников. К числу таких растений относится широко распространенный вид хризантемы Chrysanthemum morifolium Ramat, которая является важнейшей цветочной культурой. Учитывая богатство метаболизма растений этого вида, хризантема может быть перспективной платформой для получения артемизинина в гетерологичных экспрессионных системах. В результате исследований по Этапу проекта в 2019 году нами были получены следующие научные результаты: 1. Клонированы гены биосинтетического пути артемизинина из полыни Artemisia annua- ADS (аморфа-4,11-диен синтазы), CYP71AV1 (аморфа-4,11-диен монооксигеназы), DBR2 (дельта-11(13) редуктазы артемизининового альдегида) и CPR (цитохром P450 редуктазы). 2. Получены векторы для трансформации растений- р1250 с цитоплазматической локализацией продукта гена ADS и р1240- с его митохондриальной локализацией. Также получен вектор для трансформации растений р2356 с клонированными в нём генами биосинтеза предшественника артемизинина фарнезилдифосфата (ген фарнезилдифосфатсинтазы, FDPS) и альдегид-дегидрогеназы ALDH1, катализирующей окисление дигидроартемизининового альдегида до дигидроартемизининовой кислоты - непосредственного предшественника артемизинина. 3. В результате агробактериальной трансформации успешно получены трансгенные растения хризантемы- восемь независимых линий после трансформации вектором p1240 и две линии – вектором p1250. Методом ПЦР- анализа показана интеграция всех целевых генов ADS, CYP71AV1, DBR2, CPR и tHMGR в геном двух трансгенных линий, полученных в результате трансформации вектором p1240, и одной линии, полученной после трансформации вектором p1250. Трансгенная природа этих линий была дополнительно подтверждена методом Саузерн блот анализа. Таким образом, нам впервые удалось перенести в геном хризантем 6 гетерологичных генов (включая селективный ген npt II) в составе одной Т-ДНК размером 14 т.п.н. 4. С помощью ОТ-ПЦР была изучена экспрессия генов биосинтеза артемизинина на уровне транскрипции. В результате показана экспрессия всех целевых генов в двух независимых трансгенных линиях, которые были отобраны для проведения дальнейших исследований. 5. В результате агробактериальной трансформации табака вектором р1250 было получено 7 независимых трансгенных линий, после трансформации вектором р2356 - 2 линии. В результате двойной трансформации векторами р1250 и р2356 было получено 6 линий, несущих одновременно гены устойчивости к двум селективным агентам. 6. Методом ПЦР подтверждена интеграция всех целевых генов в двух трансгенных линиях, полученных в результате трансформации вектором р1250, и в двух линиях, полученных после трансформации вектором р2356. В трансгенных линиях, полученных после ко-трансформации векторами р1250 и р2356, все семь целевых генов биосинтеза артемизинина были детектированы в шести линиях. Показана транскрипция всех целевых генов в изученных линиях. Таким образом, в результате проведённых исследований были получены трансгенные линии табака, несущие семь гетерологичных генов биосинтеза артемизинина, эти линии были отобраны для проведения дальнейших исследований. 7. В результате проведённых исследований получены линии трансгенных растений табака и хризантемы, трансформированные генами биосинтеза артемизинина, отобраны линии с транскрипцией целевых генов. Эти линии в настоящее время культивируются в условиях теплицы для проведения исследований следующего Этапа.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В настоящее время существует значительный научный и практический интерес к разработке методов метаболической инженерии растений, т.е. методов целенаправленной модификации их метаболических путей и регуляторных процессов для превращения растительных субстратов в целевые продукты. К числу наиболее интересных для изучения метаболитов относится артемизинин - терпеновый лактон, выделенный из полыни однолетней (Artemisia annua). Артемизинин является в настоящее время наиболее эффективным препаратом для лечения малярии. Использование комбинированных с артемизинином лекарственных средств рекомендовано резолюциями ВОЗ и является «золотым» стандартом лечения малярии в мире. Помимо малярии, артемизинин и его производные эффективны против некоторых паразитических гельминтов, включая шистосом, а также многих линий человеческих опухолевых клеток (Ho et al., 2014). Имеются сообщения о возможной активности артемизинина (как и других биоактивных веществ A. annua) против вируса SARS‐CoV, родственного SARS-CoV-2, который является причинным агентом пандемической болезни COVID‐19 (Haq et al., 2020). Основным препятствием, сдерживающим использование артемизинина в клинической практике, является его высокая стоимость и нерегуляроность поставок. Содержание артемизина в A. annua обычно находится в диапазоне 0,01-0,8% от сухого веса, что недостаточно для обеспечения глобальной потребности в артемизинин-содержащих лекарствах. Урожайность артемизинина сильно варьирует по годам в зависимости от трудно учитываемых агротехнических факторов, в том числе от места произрастания и погодных условий. Улучшение агротехники и селекция A. annua пока не привели к существенному улучшению выхода артемизинина что вызвало значительный интерес к разработке методов его получения в гетерологичных системах, тем более, что путь биосинтеза артемизинина в A. annua в настоящее время детально изучен (Brown, 2010; Ikram and Simonsen, 2017; Tu, 2017). Основной массив исследований по получению рекомбинантного артемизинина к настоящему времени был выполнен с использованием видов табака Nicotiana tabacum и N. benthamiana (van Herpen et al., 2010; Farhi et al., 2011; Ting et al., 2013; Wang et al., 2016; Malhotra et al., 2016). Эти исследования подтвердили возможность продукции артемизинина в гетерологичных растениях. Накопление артемизинина в этих исследованиях было относительно невысоким. Это могло быть связано, в частности, с дефицитом его предшественников. Одним из способов увеличения продукции артемизинина в гетерологичных системах является выбор растения-продуцента с естественно высоким содержанием предшественников терпенов. К числу таких видов относится хризантема, в том числе широко распространенный вид Chrysanthemum morifolium Ramat (Chang et al., 2013; Yang et al., 2017). Другим подходом к увеличению накопления артемизинина в гетерологичных растениях, может быть выключение путей синтеза терпенов, расходующих общие с артемизинином предшественники, тем самым увеличивая их количество, доступное для синтеза артемизинина. Такое выключение может быть обеспечено, в частности, методами РНК- интерференции. Изучение этих подходов было целью данного Этапа исследований по проекту. В результате исследований по Этапу проекта в 2020 году нами были получены следующие научные результаты: 1. С использованием методов хромато-масс-спектрометрии впервые показано накопление рекомбинантного артемизинина в трансгенных растениях хризантем; 2. Проведен количественный анализ накопления артемизинина в трансгенных растениях табака и хризантем, выделена линия хризантемы 1240-1 сорта White Snowdon, обеспечивающая продукцию рекомбинантного артемизинина, показано соответствие масс-спектра рекомбинантного артемизинина соответствующим характеристикам природного; 3. Сконструирован РНК -интерференционный вектор для замалчивания гена сквален-синтазы хризантем; 4. Получены растения линии хризантемы, продуцента артемизинина, трансформированные вектором для замалчивания гена сквален-синтазы, молекулярно-биологическими методами подтверждён их трансгенный статус.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В настоящее время существует большой научный и практический интерес к разработке методов метаболической инженерии растений, т.е. методов целенаправленной модификации их метаболических путей и регуляторных процессов для превращения растительных субстратов в целевые продукты. К числу наиболее интересных для изучения метаболитов относится артемизинин - терпеновый лактон, выделенный из полыни однолетней (Artemisia annua). Артемизинин является в настоящее время наиболее эффективным препаратом для лечения малярии. Использование комбинированных с артемизинином лекарственных средств рекомендовано резолюциями ВОЗ и является «золотым» стандартом лечения малярии в мире. К настоящему времени основной объём исследований по получению артемизинина в гетерологичных системах был выполнен с использованием растений табака. В ходе исследований Этапа III было подтверждено присутствие артемизинина в трансгенной линии хризантем сорта White Snowdon и проведена количественная оценка его накопления в листовых тканях растений. Количественный анализ накопления артемизинина в трансгенной хризантеме показал, что его аккумуляция составила 0,5 – 0,9 мкг/г сухого веса листьев и слабо зависела от условий культивирования. Это обусловлено тем, что гетерологичные гены артемизининового пути находились под контролем сильных конституитивных промоторов, регуляция которых слабо зависит от условий окружающей среды. Кроме того, в результате экспериментов с трансгенными растениями сорта Египтянка показана важность учета сортовой специфики в исследованиях по метаболической инженерии. Необходимо отметить, что этот вопрос в исследованиях по модификации метаболизма растений до сих пор практически не учитывается. Для изучения влияния замалчивания гена сквален-синтазы на метаболом хризантем и уровень накопления рекомбинантного артемизинина нами были получены трансгенные растения сорта White Snowdon и двойные трансформанты артемизинин-продуцирующей линии 1240-1 с замолчанным геном SQS. Уровень транскрипции SQS в двойном трансформанте 1240-1SQ1 составлял около 50% от исходной линии; при этом наблюдались сильные негативные изменения морфологии растений, в частности листовые пластинки двойных трансформантов были частично альбиносные, меньшего размера, чем у контрольных растений, асимметричные и морщинистые. Рост растений был замедленным. В тоже время растения сорта White Snowdon, трансформированный вектором pCam-SQ для замалчивания сквален-синтазы, в течение их культивирования в теплице не показали каких-либо существенных отличий от исходных нетрансгенных растений, ни по морфологии, ни по скорости роста. Уровень транскрипции гена SQS варьировал в этих линиях в диапазоне 30-40% от исходного. Анализ состава метаболитов выявил снижение содержания сквалена, β-кариофиллена, гермакрена и хумулена в листьях линии 1240-1SQ1 по сравнению с 1240-1. Одновременно в растениях 1240-1SQ1 наблюдался резкий рост накопления β-фарнезена, при этом содержание артемизинина снижалось до недетектируемого уровня. Мы предполагаем, что снижение уровня накопления артемизинина в линии 1240-1SQ1 обусловлено перенаправлением потока фарнезилпирофосфата в клетке на синтез, преимущественно, β-фарнезена. Таким образом, из полученных данных следует, что замалчивание гена сквален-синтазы ведёт к существенному изменению баланса сесквитерпенов, в частности, к возрастанию накопления в тканях растений β- фарнезена с одновременным снижением уровня накопления артемизинина. В результате проведённых исследований нами была показана возможность получения рекомбинантного артемизинина в хризантемах - новом объекте для исследований в области метаболической инженерии растений; проведен количественный анализ накопления артемизинина в трансгенных растениях; получены линии с замолчанным геном сквален-синтазы и проведена оценка его влияния на накопление артемизинина. На примере артемизининового пути нами начаты исследования по изучению влияния переноса гетерологичных биосинтетических путей на метаболом растений-продуцентов и по метаболической инженерии фарнезилпирофосфата – предшественника разнообразных сесквитерпенов. Тем самым нами создан научный и методический задел для дальнейших исследований в области биохимии и метаболической инженерии растений. В результате исследований в 2021 году нами были получены следующие результаты: 1. С использованием метода GC-MS анализа проведена количественная оценка накопления рекомбинантного артемизинина, подтверждено его стабильное накопление в трансгенных растениях хризантем. Показано соответствие масс-спектра рекомбинантного артемизинина из растений хризантем соответствующим характеристикам артемизинина из природного источника A. annua. 2. Получена линия двойного трансформанта 1240SQS1, несущая гены артемизининового пути одновременно с RNAi- конструкцией для замалчивания гена сквален-синтазы, изучены морфологические особенности полученной линии. 3. Проведёно изучение метаболома линии 1240SQS1, в том числе анализ накопления некоторых сесквитерпенов, показано сильное влияние замалчивания гена сквален-синтазы на баланс соединений, синтезируемых из фарнезилпирофосфата, в том числе существенное возрастание накопления β- фарнезена. 4. Проведён анализ накопления мРНК генов некоторых сесквитерпен-синтаз в растениях хризантем методом qRT-PCR, показано, что замалчивание гена сквален-синтазы вело к существенному возрастанию транскрипции генов β- фарнезен – синтазы и гермакрен – синтазы, и не оказывало существенного влияния на транскрипцию генов фарнезил пирофосфат – синтазы 1 и β-кариофиллен – синтазы. 5. Получены растения хризантем сорта White Snowdon с замолчанным геном сквален-синтазы. С использованием усовершенствованного протокола генетической трансформации получены двойные трансформанты хризантем: линии, предварительно трансформированные генами FDPS и ALDH1 в составе вектора р2356 или RNAi- конструкцией для замалчивания гена сквален-синтазы (вектор pCam-SQ) были трансформированы генами артемизининового пути (вектор р1240). Изучение полученных линий продолжается. 6. Проведено изучение влияния условий культивирования в условиях теплицы на накопление артемизинина в растениях хризантемы. Показано незначительное влияние температурных условий, режимов полива и освещенности на содержание артемизинина в листьях растений-продуцентов.