КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-14-00190

НазваниеРазработка растительной экспрессионной системы наработки артемизинина с использованием методов синтетической биологии.

РуководительДолгов Сергей Владимирович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ2019 - 2021

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словаартемизинин, хризантема, трансгенные растения, биофарминг, малярия

Код ГРНТИ34.15.27


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Задачей предлагаемого проекта является решение проблемы производства биофармацевтических веществ небелковой природы на примере артемизинина с использованием растительных экспрессионных систем, созданных с использованием методов синтетической биологии. Малярия- группа хронических трансмиссивных инфекционных заболеваний, передаваемых человеку при укусах малярийных комаров рода Anopheles. В настоящее время благодаря миграции населения, устойчивые очаги малярии сформировались в Московской области и на Кавказе. С 2016г. в России регистрируются летальные исходы от малярии. Предполагается, что наблюдающееся потепление климата будет способствовать распространению малярии в России, т.к. увеличится период эффективной заражаемости комаров. В настоящее время наиболее эффективными лекарственными средствами для лечения малярии являются комбинированные с артемезинином лекарственные средства (рекомендовано резолюцией ВОЗ WHA60.18, май 2007). Артемизинин представляе собой терпеновый лактон, содержится в растении полынь однолетняя (Artemisia annua) и имеет высокую эффективность против малярии, но его производство в мире недостаточно. Поэтому в настоящее время активно изучается возможность производства артемизинина методами, альтернативными экстракции из природных источников. Необходимо отметить, что в России до сих пор не производятся ни артимизинин, ни какие-либо другие антималярийные субстанции. Основной трудностью, лимитирующей получение веществ небелковой природы в растениях, является то, что для их синтеза требуются длинные биохимические цепочки и регулируемые соответствующими генетическими модулями. Для получения в растениях низкомолекулярных веществ небелковой природы требуется перенос в геномы растений группы гетерологичных генов и обеспечение их скоординированной экспрессии. В последние годы в биофарминг начинают внедряться современные подходы синтетической биологии, которые позволяют осуществлять перепроектирование существующих биологических систем для заданных целей. Современные методы молекулярной биологии растений позволяют создавать генетические и биохимические модули, и переносить их в растения для получения соединений, которые не синтезируются в данном виде растений. Исследования в мире в этой области в мире пока очень немногочисленны. В ходе исследований будут: 1. Клонированы гены пути биосинтеза артемизинина из полыни Artemisia annua; 2. Получена серия векторов для трансформации растений хризантем, в том числе вектор, несущий генетический модуль, включающий все 5 генов пути биосинтеза артемизинина («мегавектор»), и вектор для замалчивания экспрессии гена сквален-синтазы хризантемы; 3. Получены трансгенные растения хризантем, трансформированные генами биосинтеза артемизинина, проведён анализ накопления артемизинина в полученных растениях, отобраны линии-продуценты; 4. Изучено влияние замалчивания гена сквален-синтазы на накопление артемизинина в растениях-продуцентах; 5. Разработан лабораторный протокол выделения артемизинина из биомассы трансгенных растений хризантем, проведёно изучение особенностей его структуры в сравнении с артемизинином, выделенным из природного источника A. annua; 6. Проведено изучение антималярийных свойств артемизинина на лабораторных животных. В качестве экспрессионной платформы для наработки артемизина будет использована Хризантема садовая (Chrysanthemum morifolium). Особенностью хризантемы, определившей её выбор как экспрессионной платформы, является наличие в этом растении высокого уровня вторичных метаболитов, в частности, ключевого предшественника артемизинина - фарнезилдифосфата. Уровень накопления фарнезилдифосфата может быть дополнительно повышен за счет замалчивания гена сквален-синтазы хризантемы. Это делает возможным получение растений-продуцентов с высоким уровнем накопления артемизинина. Кроме того, для хризантемы детально разработаны методы биотехнологии, включая надёжные и воспроизводимые методы генетической трансформации. В результате реализации проекта, будет впервые разработана экспрессионная платформа на основе растений хризантем для получения антималярийного агента артемизинина. Растения-продуценты и полученные в ходе реализации проекта новые знания будут использованы в дальнейших исследованиях по разработке инновационной технологической платформы для производства артемизинина. Это позволит резко снизить себестоимость его производства, повысить доступность для различных категорий потребителей и, тем самым, увеличить конкурентоспособность фармацевтической промышленности. Кроме того, полученные новые знания могут быть использованы для разработки технологий производства различных низкомолекулярных соединений биофармацевтического назначения на основе растительных экспрессионных систем и в исследованиях в области синтетической биологии растений.

Ожидаемые результаты
В результате исследований будут: 1. Клонированы гены пути биосинтеза артемизинина из полыни Artemisia annua; 2. Получена серия векторов для трансформации растений хризантем, в том числе вектор, несущий генетический модуль, включающий все 5 генов пути биосинтеза артемизинина («мегавектор»), и вектор для замалчивания экспрессии гена сквален-синтазы хризантемы; 3. Получены трансгенные растения хризантем, трансформированные генами биосинтеза артемизинина, проведён анализ накопления артемизинина в полученных растениях, отобраны линии-продуценты; 4. Изучено влияние замалчивания гена сквален-синтазы на накопление артемизинина в растениях-продуцентах; 5. Разработан лабораторный протокол выделения артемизинина из биомассы трансгенных растений хризантем, проведёно изучение особенностей его структуры в сравнении с артемизинином, выделенным из природного источника A. annua; 6. Проведено изучение антималярийных свойств артемизинина на лабораторных животных. В результате реализации проекта, будет впервые разработана экспрессионная платформа на основе растений хризантем для получения антималярийного агента артемизинина. Растения-продуценты и полученные в ходе реализации проекта новые знания будут использованы в дальнейших исследованиях по разработке инновационной технологической платформы для производства артемизинина. Это позволит снизить себестоимость его производства, повысить доступность для различных категорий потребителей и, тем самым, увеличить конкурентоспособность фармацевтической промышленности. Кроме того, полученные новые знания могут быть использованы для разработки технологий производства различных низкомолекулярных соединений биофармацевтического назначения на основе растительных экспрессионных систем и в исследованиях в области синтетической биологии растений.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Артемизинин - терпеновый лактон, содержащийся в растении полынь однолетняя (Artemisia annua), и обладающий высокой антималярийной активностью. В настоящее время, комбинированные с артемезинином лекарственные средства, являются наиболее эффективными препаратами для лечения малярии, использование таких препаратов рекомендовано резолюцией ВОЗ WHA60.18 (май 2007) и является стандартом лечения во всем мире. Важно отметить, что помимо малярии, артемизинин и его производные также эффективны против многих паразитических гельминтов, включая шистосом, а также различных линий человеческих опухолевых клеток. Основным препятствием, сдерживающим использование артемизинина в клинической практике, является его высокая стоимость. Содержание артемизина в A. annua обычно находится в диапазоне 0,01-0,8% от сухого веса, что недостаточно для обеспечения глобальной потребности в артемизинин-содержащих лекарствах. Улучшение агротехники и селекция A. annua пока не привели к существенному улучшению выхода артемизинина что вызвало значительный интерес к разработке методов получения артемизинина в гетерологичных растениях-продуцентах. Путь биосинтеза артемизинина в A. annua к настоящему времени хорошо изучен. К настоящему времени артемизинин был получен в гетерологичных экспрессионных системах - табаке (Farhi et al., 2011; Malhotra et al., 2016; Wang et al., 2016) и мхе Physcomitrella patens (Ikram et al., 2017). Накопление артемизинина в тканях продуцента в этих исследованиях было низким. Это могло быть обусловлено, в частности, дефицитом его предшественников. Очевидным способом увеличения продукции артемизинина в гетерологичных системах является выбор растения-продуцента с естественно высоким содержанием терпеноидов и их предшественников. К числу таких растений относится широко распространенный вид хризантемы Chrysanthemum morifolium Ramat, которая является важнейшей цветочной культурой. Учитывая богатство метаболизма растений этого вида, хризантема может быть перспективной платформой для получения артемизинина в гетерологичных экспрессионных системах. В результате исследований по Этапу проекта в 2019 году нами были получены следующие научные результаты: 1. Клонированы гены биосинтетического пути артемизинина из полыни Artemisia annua- ADS (аморфа-4,11-диен синтазы), CYP71AV1 (аморфа-4,11-диен монооксигеназы), DBR2 (дельта-11(13) редуктазы артемизининового альдегида) и CPR (цитохром P450 редуктазы). 2. Получены векторы для трансформации растений- р1250 с цитоплазматической локализацией продукта гена ADS и р1240- с его митохондриальной локализацией. Также получен вектор для трансформации растений р2356 с клонированными в нём генами биосинтеза предшественника артемизинина фарнезилдифосфата (ген фарнезилдифосфатсинтазы, FDPS) и альдегид-дегидрогеназы ALDH1, катализирующей окисление дигидроартемизининового альдегида до дигидроартемизининовой кислоты - непосредственного предшественника артемизинина. 3. В результате агробактериальной трансформации успешно получены трансгенные растения хризантемы- восемь независимых линий после трансформации вектором p1240 и две линии – вектором p1250. Методом ПЦР- анализа показана интеграция всех целевых генов ADS, CYP71AV1, DBR2, CPR и tHMGR в геном двух трансгенных линий, полученных в результате трансформации вектором p1240, и одной линии, полученной после трансформации вектором p1250. Трансгенная природа этих линий была дополнительно подтверждена методом Саузерн блот анализа. Таким образом, нам впервые удалось перенести в геном хризантем 6 гетерологичных генов (включая селективный ген npt II) в составе одной Т-ДНК размером 14 т.п.н. 4. С помощью ОТ-ПЦР была изучена экспрессия генов биосинтеза артемизинина на уровне транскрипции. В результате показана экспрессия всех целевых генов в двух независимых трансгенных линиях, которые были отобраны для проведения дальнейших исследований. 5. В результате агробактериальной трансформации табака вектором р1250 было получено 7 независимых трансгенных линий, после трансформации вектором р2356 - 2 линии. В результате двойной трансформации векторами р1250 и р2356 было получено 6 линий, несущих одновременно гены устойчивости к двум селективным агентам. 6. Методом ПЦР подтверждена интеграция всех целевых генов в двух трансгенных линиях, полученных в результате трансформации вектором р1250, и в двух линиях, полученных после трансформации вектором р2356. В трансгенных линиях, полученных после ко-трансформации векторами р1250 и р2356, все семь целевых генов биосинтеза артемизинина были детектированы в шести линиях. Показана транскрипция всех целевых генов в изученных линиях. Таким образом, в результате проведённых исследований были получены трансгенные линии табака, несущие семь гетерологичных генов биосинтеза артемизинина, эти линии были отобраны для проведения дальнейших исследований. 7. В результате проведённых исследований получены линии трансгенных растений табака и хризантемы, трансформированные генами биосинтеза артемизинина, отобраны линии с транскрипцией целевых генов. Эти линии в настоящее время культивируются в условиях теплицы для проведения исследований следующего Этапа.

 

Публикации

1. Фирсов А., Митюшкина Т., Пушин А., Вайнштейн А., Долгов С. Agrobacterium-mediated transformation of chrysanthemum with artemisinin biosynthesis pathway genes. Plants MDPI, - (год публикации - 2019).

2. Фирсов А.П., Митюшкина Т.Ю., Пушин А.С., Царева А., Вайнштейн А.М., Долгов С.В. Агробактериальная трансформация табака генетическим модулем биосинтеза антималярийного агента артемизинина. Биотехнология, - (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В настоящее время существует значительный научный и практический интерес к разработке методов метаболической инженерии растений, т.е. методов целенаправленной модификации их метаболических путей и регуляторных процессов для превращения растительных субстратов в целевые продукты. К числу наиболее интересных для изучения метаболитов относится артемизинин - терпеновый лактон, выделенный из полыни однолетней (Artemisia annua). Артемизинин является в настоящее время наиболее эффективным препаратом для лечения малярии. Использование комбинированных с артемизинином лекарственных средств рекомендовано резолюциями ВОЗ и является «золотым» стандартом лечения малярии в мире. Помимо малярии, артемизинин и его производные эффективны против некоторых паразитических гельминтов, включая шистосом, а также многих линий человеческих опухолевых клеток (Ho et al., 2014). Имеются сообщения о возможной активности артемизинина (как и других биоактивных веществ A. annua) против вируса SARS‐CoV, родственного SARS-CoV-2, который является причинным агентом пандемической болезни COVID‐19 (Haq et al., 2020). Основным препятствием, сдерживающим использование артемизинина в клинической практике, является его высокая стоимость и нерегуляроность поставок. Содержание артемизина в A. annua обычно находится в диапазоне 0,01-0,8% от сухого веса, что недостаточно для обеспечения глобальной потребности в артемизинин-содержащих лекарствах. Урожайность артемизинина сильно варьирует по годам в зависимости от трудно учитываемых агротехнических факторов, в том числе от места произрастания и погодных условий. Улучшение агротехники и селекция A. annua пока не привели к существенному улучшению выхода артемизинина что вызвало значительный интерес к разработке методов его получения в гетерологичных системах, тем более, что путь биосинтеза артемизинина в A. annua в настоящее время детально изучен (Brown, 2010; Ikram and Simonsen, 2017; Tu, 2017). Основной массив исследований по получению рекомбинантного артемизинина к настоящему времени был выполнен с использованием видов табака Nicotiana tabacum и N. benthamiana (van Herpen et al., 2010; Farhi et al., 2011; Ting et al., 2013; Wang et al., 2016; Malhotra et al., 2016). Эти исследования подтвердили возможность продукции артемизинина в гетерологичных растениях. Накопление артемизинина в этих исследованиях было относительно невысоким. Это могло быть связано, в частности, с дефицитом его предшественников. Одним из способов увеличения продукции артемизинина в гетерологичных системах является выбор растения-продуцента с естественно высоким содержанием предшественников терпенов. К числу таких видов относится хризантема, в том числе широко распространенный вид Chrysanthemum morifolium Ramat (Chang et al., 2013; Yang et al., 2017). Другим подходом к увеличению накопления артемизинина в гетерологичных растениях, может быть выключение путей синтеза терпенов, расходующих общие с артемизинином предшественники, тем самым увеличивая их количество, доступное для синтеза артемизинина. Такое выключение может быть обеспечено, в частности, методами РНК- интерференции. Изучение этих подходов было целью данного Этапа исследований по проекту. В результате исследований по Этапу проекта в 2020 году нами были получены следующие научные результаты: 1. С использованием методов хромато-масс-спектрометрии впервые показано накопление рекомбинантного артемизинина в трансгенных растениях хризантем; 2. Проведен количественный анализ накопления артемизинина в трансгенных растениях табака и хризантем, выделена линия хризантемы 1240-1 сорта White Snowdon, обеспечивающая продукцию рекомбинантного артемизинина, показано соответствие масс-спектра рекомбинантного артемизинина соответствующим характеристикам природного; 3. Сконструирован РНК -интерференционный вектор для замалчивания гена сквален-синтазы хризантем; 4. Получены растения линии хризантемы, продуцента артемизинина, трансформированные вектором для замалчивания гена сквален-синтазы, молекулярно-биологическими методами подтверждён их трансгенный статус.

 

Публикации

1. Кондрашин А.В., Морозова Л.Ф., Степанова Е.В., Турбабина Н.А., Максимова М.С., Долгов С.В., Довгалев А.С., Морозов Е.Н. MALARIA CASE MANAGEMENT IN THE POST-ELIMINATION PERIOD (WITH SPECIAL REFERENCE TO THE ROLE OF ARTEMISININ BASED COMBINATION THERAPY [ACT] Journal of Tropical Medicine, - (год публикации - 2021).

2. Фирсов А.П., Митюшкина Т.Ю., Пушин А.С., Царева А., Вайнштейн А.М., Долгов С.В. Агробактериальная трансформация табака генетическим модулем биосинтеза антималярийного агента артемизинина Биотехнология, Биотехнология 2020 Т. 36 № 3 С. 34–45 (год публикации - 2020).

3. Фирсов А.П., Митюшкина Т.Ю., Шалойко Л.А., Пушин А.С., Вайнштейн А.М., Долгов С.В. Agrobacterium-Mediated Transformation of Chrysanthemum with Artemisinin Biosynthesis Pathway Genes Plants, Plants 2020, 9, 537; doi:10.3390/plants9040537 (год публикации - 2020).

4. Фирсов А.П., Митюшкина Т.Ю., Шалойко Л.А., Пушин А.С., Палий А., Мотылева С.М., Зиганшин Р.Х., Гороховатский А.Ю., Вайнштейн А.М., Долгов С.В. Heterologous biosynthesis of artemisinin in Chrysanthemum morifolium Ramat. Metabolites, - (год публикации - 2021).