Аннотация результатов, полученных в 2019 году
- изучить изменение состояния ФС2 (по ПАМ флуорометрии и OJIP тесту), накопление аскорбата и крахмала внутри клеток микроводоросли C. reinhardtii, выросших в фотоавтотрофных условиях при недостатке азота и при высокой и низкой интенсивности света. Выявить роль интенсивности света в выделении водорода. При изучении состояния фотосистемы II (ФСII) у фотоавтотрофных культур C. reinhardtii, лимитированных и нелимитированных азотом, была налажена методика определения внутриклеточного аскорбата, накопление которого может быть индикатором разобщения водоокисляющего комплекса с реакционными центрами фотосинтеза. Культуры, не лимитированные азотом, переходили в стационарную фазу при 40-45 мг Хл/л. При этом содержание крахмала в клетках практически не изменялось, что свидетельствует о сбалансированном росте. Содержание аскорбата возрастало от 0,1-0,5 в начале культивирования до 2-3,5 нмоль/мг Хл в начале стационарной фазы, когда скорость фотосинтеза снижалась до точки компенсации фотосинтеза. Реальный квантовый выход ФСII у культур в начале составлял 0,73-0,77, а потенциальный – 0,74-0,76, снижаясь по мере роста до 0,55-0,65. Параметры нарастания OJIP сигнала в точках I и J изменялись незначительно. При лимитировании азотом (25% азота в среде), в начале роста культуры не отличались от контрольных (не лимитированных). После 20-25 ч рост культур прекращался вследствие исчерпания азота, рО2 в среде снижался до 0 (50 ч), содержание аскорбата - от 0,8 до 0,1-0,2 нмоль/мг Хл (25 ч). Содержание крахмала возрастало с 0,1 до 0,4 ммоль (по глюкозе) к 40 ч и в дальнейшем не изменялось. Реальный и потенциальный квантовые выходы до 20 ч были 0,74-0,77, снижаясь до 0,48-0,52 к 112-188 ч. Значение флуоресценции в точке J, как и скорость нарастания сигнала от начала OJIP теста после 40 ч несколько возрастали, но выделения Н2 не наблюдалось. Содержание аскорбата не увеличивалось к концу культивирования Это свидетельствует о том, что фотоавтотрофные культуры при недостатке азота не так значительно снижают активности ФСII, как фотогетеротрофные культуры при недостатке серы. Был использован специальный световой режим, подобранный ранее для фотоавтотрофных культур при серном голодании: в начале культивирования 120 мкЕ м-2 с-1, после снижения рО2 (43 ч) интенсивность света понижали до 40 мкЕ м-2 с-1. Это вызвало драматическое снижение всех параметров: рО2 падало до нуля, редокс-потенциал среды снижался до -60 мВ, реальный квантовый выход - до 0,47, а потенциальный - до 0,62. Разобщения водоокисляющего комплекса с реакционными центрами фотосинтеза не наблюдалось, о чем свидетельствует не только динамика содержания аскорбата, но и параметры Vj и dV/dt в начальный момент нарастания флуоресценции. Через 15 мин после установления анаэробных условий появлялся водород, общее количество которого достигало 130 мл/л. Таким образом, предварительные данные указывают, что механизм выделения Н2 фотоавто- и фотогетеротрофными культурами существенно различается. Ключевым параметром, определяющим способ адаптации фотоавтотрофных культур к недостатку азота, является интенсивность света, в зависимости от которой может происходить или не происходить выделение водорода. - на основе экспериментальных данных оценить константы ингибирования выделения водорода молекулярным азотом и ацетиленом у мутанта Nostoc PCC7120 без гидрогеназы и у мутантов на его основе с точечными мутациями в нитрогеназе (Q193S и R284H), что позволит оценить вклад замененных аминокислот в специфичность нитрогеназы к молекулярному азоту, ацетилену и в выделении ею водорода. Сравнивали выделение водорода на свету у трех штаммов филаментной цианобактерии Anabaena sp. (Nostoc) PCC 7120: родительского штамма ΔHup, не синтезирующего водород-поглощающую Hup-гидрогеназу, и мутантов dc-Q193S и dc-R284H, предоставленных профессором Sakurai H., университет Канагава, Япония. Мутанты имели аминокислотные замены глутамина на серин в 193 положении (dc-Q193S) и аргинина на гистидин в 284 положении(dc-R284H), в непосредственной близости от FeMo-кофактора нитрогеназы. Для изучения выделения водорода были подобраны разные условия выращивания для трех штаммов. Показано, что мутанты dc-Q193S и dc-R284H имели нитрогеназную активность около 18 мкмоль Н2/(мг ч), что на ~30% ниже, чем у родительского штамма. Это коррелирует с пониженной прочностью филаментов (их фрагментацией) у мутантов, что, вероятно, вызвано азотным голоданием при выращивании. При добавлении >57 мкМ N2 скорость выделения водорода у родительского штамма заметно снижалась, при 300 мкМ наблюдали 50% ингибирование, но даже при 100% N2 в газовой фазе сохранялось около 40% активности. По-видимому, это связано с отсутствием потребления водорода на синтез азотсодержащих соединений в отсутствие Hup-гидрогеназы. При добавлении 0,9 мкМ ацетилена выделение водорода у всех трех штаммов цианобактерий падало в 2 - 5 раз и продолжало снижаться с увеличением концентрации ацетилена до 7,7 мкМ. В среднем 50% ингибирование у всех штаммов достигалось при 0,4 – 1,1 мкМ ацетилена. Известно, что для выделения молекулы водорода требуется два электрона от ферредоксина, тогда как для восстановления молекулярного азота - 8 электронов. Поскольку молекулярный азот не ингибирует выделение водорода, можно полагать, что данная точечная мутация приводит к потере способности нитрогеназы к накоплению 8 электронов, но не 2 электронов. -изучить активность нативной гидрогеназы до и после ее обработки цианидом в реакции дейтериевого обмена с целью выявления действия цианида на активный центр гидрогеназы; Ранее нами было установлено, что цианид является необратимым ингибитором HydSL гидрогеназы T. roseopersicina, подавляющим восстановление метилвиологена водородом. Действие цианида приводит к необратимому разрушению железосерных кластеров, но состояние CO и CN лигандов активного центра не изменяется [Zorin at al. 2017], и, возможно, активный центр способен катализировать реакцию изотопного обмена Н2 – Д2О. Для проверки этого предположения сравнили активность гидрогеназы после обработки цианидом в реакциях окисления водорода и дейтериевого обмена. Препарат гидрогеназы, полученный как описано ранее, инкубировали с KCN (2, 10, 50 мМ). Удаление избытка ингибитора и других низкомолекулярных соединений (с массой <10 kDa) из реакционной среды проводили с помощью микроконцентраторов “Microcon-10”. Для регистрации реакции дейтериевого обмена по образованию HD (регистрируемая масса 3) использовали изотопный масс-спектрометр Delta V Advantage (“Thermo Fisher”, Германия). Полученные данные свидетельствуют, что препарат фермента, обработанный цианидом, в реакции дейтериевого обмена имел ~75% активности по сравнению с необработанным препаратом. При этом активность в реакции восстановления метилвиологена практически отсутствовала. Полученные результаты показывают, что при действии цианида сохраняется не только структура, но и каталитическая активность NiFe активного центра HydSL гидрогеназы T. roseopersicina, хотя железо-серные кластеры разрушаются, что приводит к потере внутримолекулярного переноса электрона от активного центра. - отработать методику выделения цитохрома, который предполагается природным акцептором электронов от гидрогеназы, выделить его и определить основные свойства Пурпурная серная бактерия T. roseopersicina BBS содержит несколько цитохромов. Предполагается, что природным акцептором электронов от HydSL гидрогеназы этой бактерии является цитохром-подобный белок, кодируемый геном isp1 (Palagyi-Meszaros et al. 2009). Данный белок является трансмембранным и возможно образует гидрофобный комплекс с гидрогеназой. Разработанный нами метод очистки позволил получить из 150 г клеток ~4 мг цитохром-подобного белка и ~10 мг гомогенной гидрогеназы с активностью 160 мкмоль/мин*мг. Далее цитохром-подобный белок лиофилизировали и анализировали для установления первичной структуры (методом хроматомасс-спектрометрии) и её сопоставления с первичной структурой белка Isp1 (с использованием возможностей лаборатории Prof. Yakunin, Toronto Univ., Canada). Основной пептид препарата был идентифицирован как цитохром с553 (Uniprot ID A0A1H2UHK8), содержащий гем, относящийся к семье белков цитохром с (Interpro superfamily -IPR036909) и не являющийся Isp1 или Isp2 белком. Его аминокислотная последовательность соответствует молекулярной массе 22,6 kDa. В препарате обнаруживается также большая (Uniprot ID A0A1H2R1T9) и малая субьединицы гидрогеназы, а также глутатион дегидрогеназа (A0A1H2VJ37) и несколько шаперонов (A0A1H2UNZ3, A0A1H2SR76). Это может указывать на наличие постоянного донора тиольной группы в восстановлении неустойчивых к воздействию О2 железосерных кластеров, а также на способы усиления стабильности гидрогеназы для применения in vitro. Таким образом, выделен и охарактеризован цитохром с553 из T.roseopersicina, т.е. выполнена часть работ, запланированная на второй год. При этом вследствие точной характеристики выделенного белка с помощью хроматомасс-спектрометрии отпала необходимость проверять наличие его в мутантах, не содержащих isp1 и isp2. Остается неясным, образует ли HydSL гидрогеназа комплекс с этим цитохромом, и способен ли он акцептировать электроны от гидрогеназы в присутствии Н2. Вопрос о продуктах isp1 и isp2 генов также пока остается открытым и требует дальнейшего изучения в следующем году. - подобрать методику ориентированной иммобилизации модифицированной гидрогеназы с гистидиновой вставкой в малой субъединице на углеродных электродах Изучали возможность иммобилизации модифицированной гидрогеназы на угольных поверхностях без их активации Ni-NTA. Проверено влияние различных угольных материалов (углевойлок Карбопон-Актив, Карбопон-22, углеткань ЛШГ-240, углебумага гидрофобная Freudenberg 0,3) на гидрогеназную активность в спектрофотометрическом тесте. Активность не менялась после высушивания гидрогеназы в присутствии указанных материалов. Однако, этот метод неприменим для изучения действия наночастиц сажи (Vulcan 72) вследствие их высокого светопоглощения и невозможности осаждения. В связи с этим были проведены электрохимические измерения в специально изготовленном топливном элементе с электродами до 1 см2. Топливный элемент испытывался при использовании нанопорошка Pt в смеси с нанопорошком сажы в качестве катализатора на обоих электродах. Показано, что он развивал мощность до 14 mW/cm2 при токе 55 mA. Затем вместо платинового устанавливали электрод с природной гидрогеназой, смешанной с нанопорошком Vulcan 72, нанесенной на электрод из гидрофобной углебумаги. Полученный топливный элемент развивал мощность до 3,2 mW/cm2 при токе 5,65 mA/cm2. Аналогично устанавливали электрод с модифицированной гидрогеназой, содержащей гистидиновую вставку. К сожалению, полученный топливный элемент не только не развивал мощности, но и не создавал разности потенциалов при подаче водорода и воздуха в разные половины топливного элемента. Далее модифицированную гидрогеназу наносили напрямую на электрод из гидрофобной углебумаги, однако топливный элемент также не создавал разности потенциалов. Таким образом, модифицированная гидрогеназа, в отличие от природной, не способна к ориентированной иммобилизации на поверхности углебумаги и нанопорошка угля. Можно предположить, что она способна к биоэлектрокатализу лишь при ориентированной иммобилизации за счет гистидиновой метки, находящейся на С-конце малой субъединицы и связывающейся со специально обработанной поверхностью, например, с использованием Ni-NTA.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
- изучить изменение состояния ФС2 (по ПАМ флуорометрии и OJIP тесту), накопление аскорбата и крахмала внутри клеток микроводоросли C. reinhardtii, выросших в фотоавтотрофных условиях при недостатке углерода при высокой и низкой интенсивности света. Провести сравнительный анализ полученных данных с результатами первого года исследований, полученными на культурах, выросших при недостатке азота; Изучали фотоавтотрофные культуры C. reinhardtii, выросшие при постоянном обеспечении СО2 или при недостатке углерода в условиях либо постоянной высокой интенсивности света (175 мкмоль/м2/сек), либо при смене ее на низкую (30 мкмоль/м2/сек) в фазе потребления кислорода, а также с дополнительным введением темнового периода. В культурах со снабжением СО2 рост был сбалансированным (содержание крахмала не менялось). Содержание аскорбата возрастало с 10 до 14 нмоль/мг Хл (а+в) в начале стационарной фазы, когда скорость фотосинтеза снижалась практически до точки компенсации. Реальный квантовый выход ФСII снижался с 0,73-0,77 до 0,4-0,65. Параметры нарастания OJIP сигнала в точках I и J изменялись после окончания стационарной фазы. Выделения водорода не наблюдали. В культурах с недостатком углерода после удаления СО2 наблюдали возникновение анаэробиоза и резкое снижение редокс-потенциала с 250 до 150 мВ (в случае высокой интенсивности света) или до 50 мВ (в случае снижения интенсивности), что сопровождалось падением реального квантового выхода до 0,55 и 0,45, соответственно. Выделение Н2 при высокой интенсивности света было 4,9 мл/л, а в условиях со сменой на низкую - 2,0 мл/л. В культурах с недостатком углерода и сменой интенсивности света был также введен темновой период (2 ч). После выключения света редокс - потенциал среды снижался до -100 мВ, повышаясь после включения света до 0 мВ. Содержание крахмала в клетках практически не изменялось. Через 20 мин после включения света начиналось выделение Н2 (суммарно ~56 мл/л), что значительно выше, чем без темновой инкубации, но ниже, чем у фотоавтотрофных культур при недостатке азота или серы. Содержание аскорбата было невысоким. Таким образом, в условиях недостатка углерода в разных режимах освещения не происходило накопления крахмала, в отличие от условий недостатка азота, но поведение параметров флуоресценции и динамика содержания аскорбата были схожими. Следовательно, при недостатке углерода также не наблюдается разобщения водоокисляющего комплекса с реакционными центрами фотосинтеза. - изучить возможность образования комплекса между очищенным цитохромом, выделенным в 2019 г., и HydSL гидрогеназой, а также возможность переноса электронов между ними. Проверить возможность образования комплекса гидрогеназы с другими белками в бесклеточном экстракте Thiocapsa roseopersicina, используя электрофоретическое разделение; Получены препараты цитохрома с553 из клеток пурпурной серной бактерии T. roseopersicina и проверено его восстановление гидрогеназой в атмосфере Н2. Показано, что цитохрома с553 восстанавливался полностью за 30-60 минут, однако скорость реакции достигала лишь 4,2 нмоль/мин мг, что существенно меньше, чем с искусственным акцептором электрона, метилвиологеном. Это ставит под сомнение физиологическое значение этой реакции в клетках. Проверена возможность комплексообразования между гидрогеназой и цитохромом при использовании щадящих методов разрушения клеток. При электрофорезе бесклеточных экстрактов проявлялась только одна полоса, совпадающая по электрофоретической подвижности с гомогенной гидрогеназой. Это указывает на отсутствие комплексов гидрогеназы с другими белками, в том числе с цитохромом, в данных условиях анализа. Согласно литературным данным предполагается, что первичным акцептором электронов от гидрогеназы является белок Isp1, который далее передает электроны через Isp2 в электрон-транспортную цепь T. roseopersicina. Однако наши попытки идентифицировать и выделить эти белки из экстрактов клеток были пока безуспешными. - проверить возможность реактивация гидрогеназы с разрушенными цианидом FeS кластерами в различных условиях; Показана возможность реактивации гидрогеназы T. roseopersicina и реконструкции железо-серных кластеров, разрушенных под действием цианида. Инкубация обработанной цианидом гидрогеназы с бета-меркаптоэтанолом, FeCl3 и Na2S приводила к восстановлению 60% активности в реакции поглощения водорода с метилвиологеном, а также к реконструкции железосерных кластеров, судя по специфическим спектрам абсорбции при 420 нм. Степень активации зависела от времени инкубации, достигая максимума через 30 минут. Такая реконструкция может быть полезной при изучении железосерных кластеров гидрогеназ: например, замена при реконструкции 56Fe на 57Fe позволит изучать редокс состояния кластеров при переносе электрона с помощью мессбауэровской спектроскопии. При этом вместо выращивания бактерий с изотопом 57Fe замену на 57Fe можно произвести уже в очищенном ферменте, расходуя таким образом меньше изотопа. - определить электрокаталитическую активность гидрогеназы без 54 аминокислот с гистидиновой меткой, иммобилизованную за счет гистидиновой метки. Для изучения электрокаталитической активности HydSLdelta54-6His гидрогеназы необходимо активировать поверхность углебумаги, избранной нами ранее для иммобилизации гидрогеназ в топливном элементе (ТЭ). В отличие от нативной HydSL гидрогеназы, модифицированная гидрогеназа может образовывать хелатные комплексы между His-tag и ионами Ni. Из трех рассмотренных способов нанесения Ni на поверхность электрода выбран наиболее простой: углебумагу активировали концентрированной H2SO4, инкубировали в растворе NiSO4 или последовательно NTA и NiSO4 с отмывкой в ультразвуковой ванне после каждого инкубирования. На высушенные образцы углебумаги наносили HydSLdelta54-6His гидрогеназу и также отмывали в ультразвуковой ванне. Полученные образцы анализировали с помощью Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry, а также проверяли электрохимическую активность электродов, изготовленных на основе этих образцов, в ТЭ с Pt электродом. Обнаружено, что предварительная обработка углебумаги NTA перед обработкой NiSO4 приводила к возрастанию содержания Ni, что свидетельствует о его связывании с углебумагой. При этом нанесение HydSLdelta54-6His приводило к снижению содержания Ni. Кроме того, содержание Fe и белка в образцах с гидрогеназой было не выше, чем без нее, что, вероятно, указывает на отсутствие связанной гидрогеназы. Напротив, содержание S в образцах с гидрогеназой повышалось, что может объясняться использованием буфера MOPS, содержащего серу. Электрохимическая активность электродов отсутствовала. Можно полагать, что связь Ni с активированной углебумагой слабая и скорее всего имеет характер адсорбции, а не ковалентного связывания. Именно поэтому при ультразвуковом отмывании имеет место смывание (десорбция) самого комплекса гидрогеназы с Ni вследствие его большего размера по сравнению с ионом Ni. Это подтверждается экспериментами со щадящим режимом отмывки, без использования ультразвука. Оказалось, что ТЭ на основе такого электрода развивал потенциал холостого хода -917 мВ (при теоретическом значении -1,1В). Однако его нагрузочная способность была крайне низка (2 мкВт/см2) по сравнению с природной HydSL гидрогеназой (более 4 мВт/см2). По-видимому, лишь незначительная часть молекул гидрогеназы имела возможность прямого переноса электронов при поглощении водорода. Таким образом, в отчетный период нам удалось получить невысокую электрохимическую активность электрода с HydSLdelta54-6His. Требуются дальнейшие исследования по оптимизации такого электрода с целью увеличения мощности. Основным направлением работ в следующем году будет активация углебумаги путем ковалентой пришивки Ni к ее поверхности.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Краткий отчет о проделанной в 2021 г работе - проверить накопление аскорбата в фотоавтотрофных культурах C. reinhardtii в условиях недостатка серы в разных фазах серного голодания, а также в условиях продувки фотоавтотрофных культур бескислородной газовой фазой без лимитирования серой Для выяснения особенностей деградации ФС2 у фотоавтотрофных культур C. reinhardtii при серном голодании в анаэробной атмосфере изучали динамику накопления аскорбата и крахмала, содержание О2 и Н2, изменение Eh и состояние фотосинтетического аппарата по данным JIP теста. Для контроля использовали культуры, не голодающие по сере, в аэробной или анаэробной атмосфере. Полученные данные свидетельствуют, что у голодающих по сере культур, имеет место разобщение водоокисляющего комплекса и ФСII сразу после наступления анаэробиоза, что приводит к деградации ФСII. Это подтверждается резким увеличением содержания аскорбата, который становится донором электронов вместо воды, а также данными JIP теста, в котором показано, что в момент наступления анаэробиоза скорость нарастания флуоресценции резко возрастает. Вместе с тем, падение активности ФС2 в фазе поглощения кислорода никак не связано с аскорбатом или повышением Vj, dV/dt0 на OJIP кривой, а обусловлено перевосстановлением пула пластохинонов. Полученные данные позволяют выявить сходство и различие в процессах адаптации фотоавтотрофных культур C. reinhardtii к недостатку азота, углерода и серы. Сделан вывод, что любой тип голодания микроводорослей приводит к деградации ФСII, однако механизм деградации может различаться и не быть связанным с накоплением аскорбата. В качестве сверхплановой работы проанализированы особенности углеродного метаболизма при использовании основного компонента органических отходов – ацетата – с целью увеличения образования водорода фототрофными бактериями. - моделировать взаимодействие гидрогеназы с isp1; проверить возможность гетерологичной экспрессии белков Isp1 и Isp2 в E. coli с целью изучения их восстановления водородом в присутствии природной гидрогеназы и модифицированной удалением 54 аминокислот и вставкой гистидиновой метки; получить стабильные комплексы гидрогеназы с природным акцептором с использованием бифункционального агента (глутарового альдегида) и изучить их молекулярные параметры; Проведенный нами анализ последовательности Isp1 не выявил наличия гем связывающей сигнатуры PS00190. Проверка последовательности Isp1 c использованием алгоритмов HemeBind сервера (http://mleg.cse.sc.edu/hemeBIND/) выявила потенциальные аминокислотные остатки участвующие в связывании гема с белком. С использованием Phyre 2 было построено 10 моделей Isp1 белка, ранжированных по энергии от -10.01 - -9.06 ккал/моль. Для проверки возможности взаимодействия HydSL гидрогеназы с Isp1 мембранным белком осуществили белок-белковый докинг моделей на ClusPro сервере с учетом гидрофобных взаимодействий. Как HydSL_WТ, так и HydSL_Δ54 взаимодействуют с Isp1 со стороны терминального железосерного кластера малой субъединицы. С-концевой участок HydSL_WT в более близком рассмотрении похоже с Hyd-1 гидрогеназой E. coli (Volbeda et al., 2013) участвует в формировании симметричной структуры из 6 трансмембранных спиралей. Учитывая погруженность Isp1 в мембрану, его взаимодействие c HydSL_Δ54 продольной поверхностью маловероятно. Таким образом, взаимодействие HydSL и Isp1 вполне правдоподобно и объясняет, почему при снижении ионной силы раствора при разрушении клеток димер HydSL переходит в растворимую фракцию. Для проверки способности Isp1 и Isp2 взаимодействовать с гидрогеназой была предпринята попытка наработать их в гетерологичной системе экспрессии E. coli. Обе последовательности были кодон оптимизированы и клонированы в вектор p15TVLic c N терминальным 6His тагом. Для полноценной сборки железосерного кластера Isp2 штамм E. coli был дополнительно трансформирован NifS цистеин десульфуразой3 Azotobacter venilandii, не несущей His тага заклонированной в вектор pZA23MCS. К сожалению, Isp1 и Isp2 не были обнаружены во фракции элюциипри использовании Ni-афинной хроматографии. Поэтому не удалось ни сравнить Isp1 с выделенным нами цитохромом с553, ни проверить взаимодействие HydSL с этим белком. В связи с этим было изучено взаимодействие гидрогеназы с другим предполагаемым природным акцептором - цитохромом с553. Были получены препараты HydSL гидрогеназы и цитохрома с553 в препаративных количествах, отработана методика сшивки глутаровым альдегидом и проведен SDS электрофорез в 10% ПААГ для анализа образовавшихся комплексов. Обнаруженная на электрофореграмме полоса выше 150 кДа может являться результатом сшивки нескольких цитохромов с гидрогеназой. Для проверки этого предположения проводили нативный электрофорез смеси гидрогеназы и цитохрома в 7% ПААГ с проявлением активности гидрогеназы. Смесь наносили на гель как без предварительной обработки, так и после инкубации с глутаровым альдегидом. Во втором случае проявлялась дополнительная полоса с большим молекулярным весом, что свидетельствует об образовании комплекса между белками. Полученные данные не противоречат утверждению, что цитохром с553 является первичным донором/акцептором электронов HydSL гидрогеназы. Другим подходом для идентификации первичного акцептора/донора гидрогеназы является выделение из клеток комплекса белков, обладающего как гидрогеназной активностью, так и активностью по Н2-зависимому восстановлению серы, т.е. физиологической активностью. Было выяснено, что при разрушении клеток T. roseopersicina в присутствии 10 г/л NaCl в мембранах локализованы обе активности. После обработки мембран Тритоном X-100 они переходили в растворимую фракцию, которая далее была частично очищена с использованием Q-сефарозы. Спектр полученной фракции имел пик в области 410-415 нм, характерный для FeS белков и гидрогеназы. Фракцию после ионообменной хроматографии изучали на содержание белков HydS, HydL, Isp1 и Isp2 с помощью хроматомасспектрометрии. Первые результаты показали, что в этой фракции находится более 300 белков, среди них HydL, Isp2 и цитохром с553. Ни HydS, ни Isp1 обнаружено не было. Протеомный анализ против полного генома T. roseopersicina затруднен, поскольку в полученном нами геноме (см ниже) аннотированы далеко не все гены. Таким образом, у нас есть два белка, потенциально способные служить в качестве акцептора электронов от гидрогеназы: цитохром с553, образующий комплекс с гидрогеназой, и Isp1, который в литературе все авторы считают акцептором электронов гидрогеназы без достаточного экспериментального подтверждения. Был проведен анализ современных литературных данных для выявления роли гидрогеназ, и, в частности, HydSL в серном метаболизме у пурпурных серных бактерий. Оказалось, что основные результаты получены с использованием не T. roseopersicina, а Allochromatium vinosum, у которой роль HydSL гидрогеназы совсем не изучалась. В GenBank имеются лишь разрозненные данные о генетическом составе T. roseopersicina в виде контигов, не подвергавшихся дополнительной проверке на ошибки секвенирования. Поэтому в отчетный период проведено секвенирование и сборка полного генома T. bogorovii BBS (прежнее название T. roseopersicina). Род Thiocapsa на данный момент состоит из 9 видов, 2 из которых не являются валидированными (www.bacteronet.com). К последним относится исследуемый нами штамм: реклассификация вида T. roseopersicina BBS в новый вид T. bogorovii BBS была предложена Туровой и соавторами в 2009 году, но требовала уточнения. Анализ полученного нами полноразмерного генома T. bogorovii BBS с применением интегрированного подхода, который включал расчет значений параметров ANI (Average Nucleotide Identity) и расчет значений параметров DDH (digital DNA-DNA hybridization parameter), позволил валидировать систематическое положение T. bogorovii BBS. Данная бактерия не является родственной типовым видовым штаммам Т. marina, T. rosea, T. imhoffii, T. roseopersicina в достаточной степени. Таким образом, обосновано выделение штамма BBS T. bogorovii в новый вид, впервые получен полный собранный геном данного типового штамма нового вида (незапланированный результат, обладающий высокой ценностью). В настоящее время геном готовится для загрузки в базы данных GenBank, BioProject и BioSample. Готовится публикация. - оценить активность нативной гидрогеназы и ее варианта с гистидиновой меткой в оптимизированных условиях на электроде с оптимизированными условиями иммобилизации Показано, что независимо от отсутствия/наличия обработки углебумаги (кипячение в серной или азотной кислоте) проявлялась электрохимическая активность электрода на основе платины. При этом активация потенциала электрода при первой подаче водорода и воздуха происходила медленно, а после повторных циклов время активации существенно сокращалось, независимо от способа предобработки углебумаги. Максимальной нагрузочной способности топливный элемент (ТЭ) достигал через 7-10 дней с ежедневными циклами подачи/отключения газов с последующей инкубацией на воздухе. При 10 кОм нагрузки потенциал составлял 480-580 мВ с максимальным значением на углебумаге без предобработки перед посадкой HS-NTA. При всех способах предобработки достигаемая эдс без нагрузки во всех электродах достигала значения около 950 мВ и колебалась в диапазоне 50 мВ в разные циклы включения. Теоретический максимум соответствует примерно 1200 мВ. Для дальнейших исследований углебумагу не обрабатывали перед активацией HS-NTA. В целях оптимизации нанесения модифицированной гидрогеназы с His-меткой проверено влияние KCl и KCl с суспензией нафиона. В последнем случае получено наименьшее время стабилизации потенциала (менее часа), причем 0,8 от максимального значения достигалось за 180 сек. Через 5-10 циклов подачи/отключения газов нагрузочные способности ТЭ возрастали. При этом с увеличением нагрузки (уменьшением сопротивления нагрузки) наблюдали увеличение генерируемого тока. Выше определенного предела увеличение нагрузки приводило не только к значительному снижению генерируемого потенциала, но и к уменьшению генерируемого тока, что существенно отличает гидрогеназный электрод от платинового, у которого при увеличении нагрузки ток всегда возрастал. ТЭ с электродом, в котором гидрогеназа нанесена с добавлением KCl и нафиона на углебумагу без обработки кислотами перед активацией HS-NTA, развивал ток до 1,45 мА/см2 и мощность 0,47 мВт/см2. Таким образом, проведена оптимизация подготовки углебумаги и нанесения модифицированной гидрогеназы на электрод, позволившая получить значительные токи и мощности. Однако, эти значения пока меньше, чем у ТЭ с двумя платиновыми электродами. Дальнейшее увеличение мощности требует подробного исследования процессов активации углебумаги с помощью HS-NTA (подбор температуры, времени иммобилизации с контролем количества иммобилизованного HS-NTA рентгено-спектральным анализом ), а также подбора условий для иммобилизации гидрогеназы на никеле (время иммобилизации, температура, концентрация гидрогеназы).