КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-14-00331

НазваниеУльтравысокопроизводительное профилирование природных сообществ микроорганизмов

РуководительСмирнов Иван Витальевич, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словаультравысокпроизводительный скрининг, микробиота, кластеры биосинтеза, функциональный отбор, антибиотики, лекарственная устойчивость

Код ГРНТИ34.27.21


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Важнейшим направлением, связанным с развитием медицинской биотехнологии, является поиск путей борьбы с устойчивостью патогенных штаммов микроорганизмов к лекарственным соединениям. В России разработана Стратегия предупреждения распространения антимикробной резистентности в РФ на период до 2030 г (распоряжение Правительства РФ от 25 сентября 2017 г. № 2045-р). В связи с вышесказанным принципиально важно учесть мировые тенденции в развитии медицинской биотехнологии в области молекулярных основ резистентности. Данный проект направлен на генетическое профилирование и метаболомный анализ микробных сообществ методами высокопроизводительного скрининга с целью решение проблемы поиска новых антибиотических препаратов, а также исследование механизмов и поиск лигандов, ингибирующих факторы резистентности микроорганизмов к существующим антибиотическим препаратам. Комбинированное использование таких препаратов может иметь решающее значение для решения проблемы лекарственной устойчивости к антибиотикам и явиться основой для нового направления в синтетической биологии. Общая идея реализации проекта заключается в ультравысокопроизводительном скрининге представителей микробиоты из природных источников с использованием разработанной нами технологии и оригинальных микрофлюидных чипов собственного производства (Terekhov, Smirnov et al. PNAS 2017; Terekhov, Smirnov et al. PNAS 2018). В ходе эксперимента проводится инкапсулирование пары микроорганизмов «мишень»-«эффектор» в капли двойной эмульсии. В качестве «мишени» используется флуоресцентный штамм микроорганизма, для которой поставлена задача поиска «эффектора» – штамма микроорганизма, способного продуцировать вещества (антимикробные пептиды, низкомолекулярные вещества) обладающие антимикробными свойствами, и как следствие, содержащего кластер(ы) генов их биосинтеза. Для регистрации антимикробной активности вводятся специальные флуоресцентные маркеры: (i) генно-инженерно вводится внутриклеточный флуоресцентный белок – для наблюдения за бактерией «мишенью», (ii) – флуоресцентный краситель Calcein violet (или аналог) – для идентификации живых клеток микроорганизмов и (iii) – флуоресцентный краситель для определения количества клеток бактерии «мишени» на начальном этапе скрининга. После инкубации при выбранных условиях проводится отбор «позитивных» инкапсулированных пар с использованием стандартного клеточного сортера (FACS AriaIII или аналог) и подобранных условиях сортинга. Полученные в результате отбора инкапсулированные пары анализируются методами NGS-секвенирования и масс-спектрометрии в режимах без и после культивации в стандартных условиях. Проводится биоинформатический анализ и определяются штаммы микроорганизмов, проводится поиск и идентификация кластеров генов биосинтеза веществ, осуществляющих антимикробное действие, а также при возможности сами антимикробные вещества. В ходе выполнения проекта будут решены задачи по исследованию природных источников бактериальных сообществ на наличие потенциальных продуцентов новых антимикробных соединений. Будет проведен скрининг и идентификация штаммов-продуцентов веществ, ингибирующих рост патогенных бактерий «мишеней», а также поиск кластеров генов и исследование механизмов биосинтеза веществ, обладающих антимикробной активностью. Научная новизна данного проекта базируется на использовании инновационных технологий ультравысокопроизводительного скрининга для поиска новых уникальных популяций бактерий-продуцентов антибиотиков. В отличие от классических источников бактериального разнообразия, таких как образцы почвенных бактерий, в рамках данного проекта мы планируем сконцентрировать свое основное внимание на таких малоизученных бактериальных сообществах как микробиота диких животных. Таким образом, использование современных методов поиска, идентификации и гетерологической экспрессии кластеров генов биосинтеза антибиотиков, а также веществ – ингибиторов факторов устойчивости является актуальной задачей современной медицинской биотехнологии РФ. Проект может явиться основой для одного из перспективных направлений современной синтетической биологии.

Ожидаемые результаты
В ходе реализации проекта будут проведены исследование природных источников бактериальных сообществ на наличие потенциальных продуцентов новых антимикробных соединений. Будет проведен систематический анализ кластеров биосинтеза антибиотиков, основанный на геномном майнинге и гетерологической продукции, что может позволить идентифицировать неизвестные ранее антибиотики в редких и/или «некультивируемых» микроорганизмах. Впервые будет проведен анализ состава микробиоты ротовой полости дикого кабана (Sus scrofa), амурского тигра (Panthera tigris altaica), также будет исследована микробиота представителей грызунов, в частности крыс (Rattus norvegicus), комодского варана (Varanus komodoensis), диких и домашних птиц, а также рыб Байкальского бассейна и других водных водоемов России. Использование неклассических источников биоразнообразия микроорганизмов становится трендом современных исследований, направленных на поиск антибиотических препаратов нового поколения (Chu et al., Nature Chemical Biology. 2016). Уникальность нашего подхода позволит нам с высокой эффективностью и скоростью провести анализ природных сообществ микроорганизмов с целью поиска кластеров биосинтеза новых антибиотических препаратов. С использованием полученных биообразцов будет проведен ультравысокопроизводительный скрининг и идентификация штаммов продуцентов веществ, ингибирующих рост патогенных бактерий, в том числе и резистентных. На основании полученных результатах скрининга будут идентифицированы веществ, обладающие антимикробной активностью, будет проведен поиск кластеров генов и исследование механизмов биосинтеза веществ, обладающих антимикробной активностью. Эксперименты по гетерологической экспрессии кластеров генов биосинтеза обнаруженных веществ позволят идентифицировать новые антибиотические препараты, которые могут стать прототипами новых лекарственных средств для борьбы с возбудителями инфекционных заболеваний в том числе и мультирезистентных. Кластеры генов биосинтеза антимикробных соединений, идентифицированные и изученные в ходе реализации данного проекта позволят направлено создавать и/или направленно модифицировать антимикробные препараты. Таким образом, полученные результаты могут стать основой для решения проблем синтетической биологии, связанных с поиском новых антибиотиков.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На первом этапе перед нами была поставлена задача создания штаммов бактерий-мишеней, используемых в дальнейшем в качестве репортерных штаммов для детекции антибиотической активности индивидуальных представителей бактериальных сообществ. Для этого в качестве модельных бактерий-репортеров были использованы штаммы грамположительных бактерий Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis, а также грамотрицательных Escherichia coli и дрожжевых клеток Pichia pastoris. Наиболее принципиальным моментом на данном этапе для нас являлось создание пары бактерий-репортеров, позволяющих детектировать антибактериальную активность как в отношении грамположительных, так и в отношении грамотрицательных бактерий. Основными критериями для нас были интенсивность флуоресценции зеленого флуоресцентного белка (GFP), продуцируемого модельным микроорганизмом, а также узкое распределение клонов микроорганизмов по флуоресценции. В ходе реализации проекта созданы рекомбинантные репортерные штаммы грамположительных бактерий S. aureus и грамотрицательных E. coli, обладающих требуемым уровнем интенсивности и монодисперсности распределения капель по флуоресценции. Был проведен отбор микробиоты дикого фазана, добытого на охоте, а также жука-кожееда (Dermestes maculatus), питающегося останками теплокровных. Еще одним объектом исследований стали группы добровольцев в рамках подготовки к проведению 8-ми месячного изоляционного эксперимента, организуемого ИМБП РАН совместно с HRP NASA. Был проведен отбор микробиоты носоглотки, ротовой полости и паховой области у 6 добровольцев, лежащих в сухой иммерсионной ванне 5 дней с отбором в начале и по окончанию эксперимента; а также 3 добровольцев, находящихся в сухой иммерсионной ванне в течение 21 дня. В последнем случае был произведено три отбора перед началом эксперимента и на 11-ый и 21-ый дни исследований. Ранее нами было показано, что бактерии Propionibacterium acnes, компонент микрофлоры кожи, обладают высоким уровнем ингибирующей активности по отношению к золотистому стафилококку, мы полагаем, что в режиме ограниченного движения, заселенность закрытых областей кожи, в том числе паховой области, увеличит титр бактерий, в том числе и P.acnes. Проведены пробные отборы и криоконсервация уникальных бактериальных сообществ диких животных (фазан и жук кожеед). А также 9-ти добровольцев из программы подготовки к проведению 8-ми месячного изоляционного эксперимента, организуемого ИМБП РАН совместно с HRP NASA. На основании отобранных биообразцов проведен ряд предварительных отборов бактерий, обладающих антибиотическими свойствами в отношении бактерий S. aureus и E. coli. Проводится идентификация культивируемых штаммов методами широкомасштабного секвенирования. Проводится анализ их генома и метаболома с целью идентификации действующих веществ, обуславливающих эффекторные свойства отобранных штаммов. В результате полногеномного секвенирования бактерий, продемонстрировавших антагонистические свойства по отношению к репортерному штамму патогенных бактерий получен набор метагеномных данных и проведен их биоинформатический анализ с целью идентификации новых кластеров биосинтеза антимикробных агентов. Биоинформатический анализ позволил идентифицировать новое подсемейство AmiN-подобных киназ, обладающих уникальной субстратной специфичностью. Уникальные свойства AmiN-подобных киназ были исследованы методом рентгеноструктурного анализа, позволившего детализировать структуру активного центра фермента, а также основные структурные мотивы, обуславливающие функциональные свойства AmiN-подобных киназ. Полученные результаты легли в основу публикации статьи «A kinase bioscavenger provides antibiotic resistance by extremely tight substrate binding». На данный момент работа находится на рассмотрении в редакции журнала Science Advances (издатель AAAS, ИФ 12.804, Q1). А также представлению результатов на международной конференции FEBS2019, которые были опубликованы в специальном выпуске журнала ACTA NATURAE (ИФ 1.657, Q2).

 

Публикации

1. Мокрушина Ю.А., Смирнов И.В., Терехов С.С., Пипия С.О., Габибов А.Г. РЕКОНСТРУКЦИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ БИОСИНТЕЗА ЛАНТИБИОТИКА В ДРОЖЖАХ PICHIA PASTORIS ACTA NATURAE, ACTA NATURAE, СПЕЦВЫПУСК том 2, 2019, СТР. 258 (год публикации - 2019).

2. Терехов С.С., Мокрушина Ю.А., Назаров А.С., Злобин А., Залевский А.О., Буренков Г., Головин А.В., Белогуров А.А., Остерман И.А., Куликова А.А., Миткевич В.А., Хуа Джейн Лу, Турк Б.Е., Вильманнс В., Смирнов И.В., Альтман С, Габибов А.Г. A kinase bioscavenger provides antibiotic resistance by extremely tight substrate binding Science Advances, - (год публикации - 2020).

3. Терехов С.С., Смирнов И.В., Назаров А.С., Габибов А.Г. ГЛУБОКОЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ МИКРОБИОМОВ ACTA NATURAE, ACTA NATURAE, СПЕЦВЫПУСК том 2, 2019, СТР. 170 (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
На данном этапе проекта разработанная нами ранее ультравысокопроизводительная платформа скрининга была адаптирована для функционального профилирования микробиома диких животных. Принципиальная схема данной платформы заключается в следующем: микробиота диких животных подвергалась микрофлюидной компартментализации в каплях биосовместимой мирофлюидной эмульсии в присутствии полученных на предыдущем этапе штаммов-репортеров. Бактерии, подавляющие рост репортерных штаммов, были отобраны с использованием клеточного сортера (FACS) и проанализированы с использованием классических микробиологических методов, а также методов высокопроизводительной геномики и метаболомики. В результате экспедиции в коллаборации с Дальневосточным Федеральным Университетом произведены сбор и криоконсервация оральной микробиоты рыси (Lynx lynx), харзы (Martes flavigula) и енотовидной собаки (Nyctereutes procyonoides). В ходе скрининга были отобраны штаммы микроорганизмов, обозначенные как Р1, Х1, Х27, Е14, Е18, Е32. Для каждого из этих продуцентов была проведена масс-спектрометрическая идентификация. Обнаружено, что метаболиты бактерий Х27, Е18 и Е32, обеспечивающих антибиотическую активность. Е18 – штамм Staphylococcus pseudintermedius, продуцирующий в ростовую среду BHI соединение, активное в отношении S. aureus вплоть до 256-кратного разведения. Показано, что антибиотический эффект соединения сохраняется при инкубации в диапазоне pH 1.5-12.0 при температурах 25 и 37°С. При инкубации в течение 1.5 часов при 60°С наблюдалась потеря 90% активности. Соединение подвергается концентрированию на мембранах 30 кДа, что указывает на его высокомолекулярную природу. Были подобраны стадии его очистки, которые включают катионообменную хроматографию при использовании сорбента SP-sepharose и твердофазную экстракцию с применением сорбента LPS-500, позволяющее сохранить до 68 % антибиотической активности метаболита. Было установлено, что Е18 проявлял специфическую бактерицидную активность в отношении S. aureus – ингибирующее разведение равно 2048. С использованием хромато-масс-спектрометрического анализа было установлено, что продуктом, обладающим активностью в отношении S. aureus в случае бактерий рода Bacillus штаммов Р1, Х1 и Е14 является антибиотик амикумацин, продуцируемый в культивационную среду (BHI) до 64-кратного разведения в случае штамма Е14 и до 32-кратного разведения для Р1 и Х1. Используя данные полногеномного секвенирования, в геномах, отобранных ранее штаммов D10 и E14, удалось установить кластеры, отвечающие за биосинтез амикумацина. Организация доменов в обоих кластерах отличается от описанной ранее (Terekhov et al., PNAS 2018). В случае штаммов Р1 и Х1 очевидно требуется более глубокое секвенирование с использованием технологии NanoPore, которое будет выполнено в ходе работы следующего этапа. Полученная панель штаммов была использована для селекции наиболее эффективных продуцентов амикумацина (Ami). Была оптимизирована очистка Ami, которая была масштабирована для наработки сотен миллиграмм Ami. В рамках данного проекта мы также исследовали структурные особенности AmiN-подобных киназ, входящих в состав идентифицированных кластеров биосинтеза Ami. Эти ферменты являются принципиально важными для регуляции активности антибиотика и в раскрытии механизма авторезистентности. Полученные данные характеризуют AmiN как уникальный фермент, обладающий уникально эффективным связыванием своего субстрата (Ami). AmiN не обладает высоким сродством к АТФ, что является характерной чертой большинства цитоплазматических протеинкиназ и обусловлено, по-видимому, высокой естественной концентрацией свободного АТФ в живых клетках. Следует отметить, что эффективное связывание Ami возникает в присутствии АТФ, что подчеркивает необходимость образования тройного комплекса AmiN-ATP-Ami для максимально эффективного связывания субстрата. При этом ни комплекс AmiN-ADP, ни комплекс AmiN-AMP-PNP, не образовывали комплекс с продуктом реакции (Ami-P). Подобное поведение фермента принципиально важно в случае образования высокоаффинного комплекса с субстратом и, по-видимому, характерна для всех AmiN-подобных киназ. Для дальнейшего механистического исследования AmiN-подобных киназ были получены кристаллические структуры этих белков, а также их комплексов с субстратами и негидролизуемым аналогом и был установлен структурный механизм действия фермента. Было установлено, что уникальной отличительной чертой AmiN-подобных киназ является наличие дополнительной субстрат-связывающей петли, обеспечивающей формирование многочисленных π-π взаимодействий (π-бокс), и, таким образом, связывающей ароматический фрагмент Ami. Многие киназы, гомологичные AmiN, способны образовывать закрытую форму при связывании с субстратами. Мы показали, что закрытая форма гомологов AmiN-подобных киназ в большинстве случаев позволяет значительно снизить барьер реакции, позволяя произвести эффективный перенос фосфата. В то же время подсемейство AmiN-подобных киназ представляет собой некий исключительный пример, для которого уменьшение барьера реакции при закрытии активного центра фермента составляет более 30 ккал/моль. Таким образом, уникальная эффективность и специфичность AmiN-подобных киназ предопределена данным механизмом субстрат-индуцированного закрытия активного центра фермента. Одной из задач проекта является реконструкция обнаруженных кластеров биосинтеза антибиотиков в гетерологичной системе. Для доказательства того, что дрожжевые системы могут быть использованы для экспрессии антибактериальных агентов был создана модельная система экспрессии бактериоцина лизостафин в клетках P.pastoris. Было показзано, что, в отличие от родительского штамма GS115 P. pastoris, сконструированный rLys P. pastoris проявляет антагонистические свойства, опосредованные конститутивным продуцированием лизостафина. Антагонистические свойства rLys P. Pastoris были аналогичны спектру активности лизостафина. Наиболее эффективное ингибирование роста наблюдалось для S. aureus и S. vitulinus. Посредственное подавление наблюдалось для S. xylosus. Некоторые стафилококки (Staphylococcus pasteuri, Staphylococcus warneri, Staphylococcus haemolyticus и Staphylococcus epidermidis) и другие бактерии (Macrococcus caseolyticus, Bacillus subtilis, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis и Escherichia pastoris не подавлялись у E. coli. Такая селективность благоприятствует практическому применению rLys P. pastoris, поскольку его можно использовать в качестве целевого агента биоконтроля для уничтожения S. aureus.

 

Публикации

1. Пипия С.О., Мокрушина Ю.А., Габибов А.Г., Смирнов И.В., Терехов С.С. Selective Eradication of Staphylococcus aureus by the Designer Genetically Programmed Yeast Biocontrol Agent Antibiotics (Basel), 2020 Aug 19;9(9):527 (год публикации - 2020).

2. Терехов С.С., Назаров А.С., Мокрушина Ю.А., Баранова М.Н., Потапова Н.А., Малахова М.В., Ильина Е.Н., Смирнов И.В., Габибов А.Г. Deep Functional Profiling Facilitates the Evaluation of the Antibacterial Potential of the Antibiotic Amicoumacin Antibiotics (Basel), 2;9(4):157 (год публикации - 2020).