Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На первом этапе работы была охарактеризована способность красной формы флуоресцентного белка SAASoti к обратимому фотопереключению. Красная форма SAASoti, полученная облучением образца SAASoti светом λ=400 нм в течение 10 минут, не обладает способностью к обратимому переходу из флуоресцентной формы в темную. При продолжительном (60 мин) облучении образца красной формы SAASoti светом λ=550 нм происходит очень медленная его фотодеструкция, в то время как последовательное облучение зеленой формы сними светом (470 нм) в течение 10 минут и последующее облучение фиолетовым светом 400 нм приводит к тому, что полученная красная форма способна к частичному фотопереключению при продолжительном облучении светом 550 нм с очень быстрым временем термической релаксации. Для выяснения причины необычного фотохимического поведения был проведен масс-спектрометрический анализ образцов SAASoti до и после облучения светом 470 нм, в результате которого выяснилось, что аминокислотный остаток метионина в положении 164 подвергается химической модификации – окислению, что, скорее всего, и обуславливает частичное фотопереключение красной формы. Ранее окисление данного аминокислотного остатка было показано также при исследовании другого бифотохромного белка – IrisFP. Для белков, фотоконвертируемых по механизму флуоресцентного белка Kaede, установлено, что механизм конверсии предполагает участие в этом процессе протонированной зеленой формы хромофора. Поэтому было предложено получать красную форму из предварительно потушенной зеленой, так как при этом происходит изомеризация и протонирование хромофора, то есть предполагалось, что хромофор и его окружение в такой конформации будут «подготовлены» к фотоконверсии. Скорость фотоконверсии предварительно потушенной зеленой формы превышает аналогичную величину для красной формы, полученной «классическим» методом. Уменьшение интенсивности флуоресценции красной формы SAASoti для образца, полученного с предварительным тушением зеленой формы, описывается биэкспоненциальной зависимостью I=I_1 exp⁡(-k_1 t)+I_2 exp⁡(-k_2 t)+c, где I1 и I2 – предэкспоненциальные коэффициенты, с – фоновый сигнал, включающий остаточную флуоресценцию. Константы скорости фотопереключения равны – k1=0,24 c-1 и k2=0,0006 c-1 (соотношение предэкспоненциальных множителей равно 1/4). Скорее всего, первая экспоненциальная составляющая связана с обратимым переключением, а вторая соответствует необратимой фотодеструкции образца. В следующей части работы исследовали положения аминокислотных остатков в ближайшем окружении хромофора (106, 164 и 178) методом сайт-направленного мутагенеза, а также получили библиотеку вариантов SAASoti со случайными аминокислотными остатками в этих же положениях. Сайт-направленный мутагенез был осуществлён методом «Overlap-extension PCR». Полученные ПЦР-фрагменты, содержащие ген белка SAASoti с различными заменами аминокислотных остатков, были клонированы в вектор pET22b. Таким образом, были получены формы C106V/V127T, M164A/V127T и F178S/V127T SAASoti. Соответствующие рекомбинантные белки были наработаны в клетках E. Coli BL21 (DE3), выделены и очищены хроматографическими методами, после чего были охарактеризованы их физико-химические и флуоресцентные свойства (максимумы длин волн поглощения и эмиссии, константы кислотности хромофора в возбужденном состоянии, коэффициент молярного поглощения). Для вариантов M164A/V127T и F178S/V127T SAASoti наблюдали смещение максимума поглощения хромофора как для зеленой, так и для красной формы, а также увеличение значения величины pKa в сторону более высоких значений pH. Также для данных форм SAASoti была охарактеризована скорость фотопереключения из флуоресцентной формы в темную. В случае исходного варианта V127T и C106V/V127T SAASoti тушение зеленой флуоресценции описывается биэкспоненциальной зависимостью (1), в то время как для вариантов M164A и F178S – моноэкспоненциальной (2) I=I_1 exp⁡(-k_1 t)+c. Формы M164A и F178S белка V127T SAASoti демонстрируют повышенную скорость обратимого фотопереключения по сравнению с исходным белком V127T SAASoti (100 с по сравнению с 600 с). Как и в случае V127T SAASoti, для всех полученных мутантных форм обратимое фотопереключение можно проводить несколько раз с одним и тем же образцом, при этом регенерацию флуоресценции зеленой формы можно проводить путем облучения короткими импульсами света 400 нм в буфере с высоким значением pH (9,2) во избежание фотоконверсии в красную форму. Для варианта M164A наблюдается минимальное снижение общего уровня флуоресценции при переходе от цикла к циклу, то есть данный белок является более фотостабильным. Что еще раз подтверждает тот факт, что M164 частично окисляется под действием света 470 нм в случае белков V127T и F178S/V127T. Введение замен M164A и F178S привело также к появлению свойства частичного обратимого фотопереключения для красной формы SAASoti, чего не наблюдалось ранее для исходного белка. Облучение полученной классическим методом (λ=400 нм, 5 минут) красной формы белков M164A/V127T и F178S/V127T светом λ=550 нм в течение 5 минут приводит к значительному уменьшению интенсивности флуоресценции красной формы. Этот процесс можно повторять множество раз с одним и тем же белком, в данном случае следующий цикл тушения проводили после 30-минутной релаксации частично потушенной красной формы. В случае F178S/V127T SAASoti эффективность фотопереключения составляет примерно 40 %, в то время как для варианта M164A/V127T SAASoti – 55 %, однако в этом случае наблюдается значительное уменьшение исходной интенсивности флуоресценции при переходе от цикла к циклу. Возможно, это объясняется тем, что нахождение красной формы хромофора белка M164A/V127T SAASoti в выключенной транс-форме является более энергетически выгодным, чем в случае белка F178S/V127T, поэтому для ее полной релаксации требуется больше времени. Кинетику релаксации потушенных форм данных мутантных форм следует изучать отдельно. Также была отработана методика проведения случайного мутагенеза по определенным положениям (106, 164 и 178), и по предварительным данным секвенирования (ООО «Евроген) определено, что получены генетические конструкции, содержащие ген SAASoti со следующими заменами: С106H и C106S, M164W, F178K и F178C. Эти замены являются перспективными для дальнейшего изучения физико- химических и флуоресцентных свойств SAASoti. Для проведения отбора колоний была сконструирована эпифлуоресцентная установка на основе прямого микроскопа Olympus CX41, которая позволяет облучать колонии клеток E. coli, экспрессирующие рекомбинантные флуоресцентные белки, светом 400, 450, 470 и 560 нм и регистрировать флуоресценцию на КМОП камеру и спектрометр. На данный момент установлена и отъюстирована оптическая система, разработана электрическая схема синхронизации импульсов и регистрации на основе контроллера ATmega 328P и ЦАП AD5314. В данный момент ведется разработка алгоритмов и программного обеспечения для управления установкой в автоматическом режиме для проведения скрининга колоний. Также была отработана методика получения кинетических кривых фотопревращений мутантных форм флуоресцентного белка SAASoti на колониях E. coli c использованием конфокальной сканирующей системы PicoQuant Microtime 200 на основе инвертированного микроскопа Olympus IX71. Чашка помещалась над объективом колониями вниз. Фокус размещался в области колонии, эту область облучали сфокусированным пучком синего света (λ=485 нм, 5 мкВт), за флуоресценцией наблюдали с помощью спектрометра, установленного в конфокальной схеме. Данная схема облучения показала воспроизводимые результаты при исследовании трех различных колоний, экспрессирующих белок F178S/V127T SAASoti. Кинетика затухания флуоресценции зеленой формы F178S/V127T также описывается биэкспоненциальной зависимостью (1). При сравнении кинетики тушения зеленой формы белка F178S, измеренными в кювете и на клетках, видно, что в обоих случаях интенсивность флуоресценции зеленой формы практически полностью падает за 100 с (в случае конфокальных измерений на клетках величина с – фоновая флуоресценция – значительно выше). Данный метод наиболее удобен для экспрессного отбора перспективных клонов без выделения белка и, основываясь на воспроизводимости полученных данных, будет использоваться для поиска наиболее перспективных мутантных форм.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Методом сайт-направленного мутагенеза были получены формы C21N, C117S и C117T SAASoti. После выделения, очистки и характеристики белков методом гель-фильтрации было показано, что замена C21N приводит к удалению примеси димерной формы при повышенных концентрациях, что должно облегчить получение кристаллической структуры в дальнейшем. Также введенная замена не повлияла на основные физико-химические и флуоресцентные свойства белка, поэтому белок C21N SAASoti был принят за новый вариант мономерного белка SAASoti. Остаток цистеина в положении 21 находится на удалении от хромофора, а его боковая цепь ориентирована в раствор. Однако, было отмечено значительное изменение величины pKa красной формы в сторону более высоких значений pH. Для установления величин, ответственных за изменения значения pKa красной формы от 6,6 до 7,5 при введении замены C21N, было проведено молекулярно-динамическое моделирование с потенциалами QM/MM красных форм обоих белков (WT и C21N SAASoti). Анионная форма хромофора имеет две таутомерные формы. Значение pKa хромофора должно уменьшаться, если равновесие смещается в сторону формы с отрицательным зарядом на фенольном атоме кислорода. Мы проанализировали динамическое поведение хромофора в обеих таутомерных формах и изучили корреляцию геометрического параметра R (C-O) – длину ковалентной связи, при этом отрицательный заряд находится на атоме кислорода, порядок связи вычисляется из лапласиана электронной плотности и заряда NBO. Среднее расстояние C-O в фенильном фрагменте хромофора составляет 1,261 Å и 1,255 Å для белков WT* и C21N SAASoti, соответственно. Из траекторий молекулярной динамики были извлечены несколько кадров для оценки величин, основанных на электронной плотности и ответственных за изменения в величинах pKa. MD-структуры с большей длиной связи имеют меньший отрицательный заряд на атоме кислорода и имеют меньшее сродство к протонированию; другими словами, они должны иметь более высокие значения pKa. Другой критерий – порядок связей Лапласиана – учитывает различные особенности связи, включая полярность связи. Уменьшение LBO является мерой увеличения полярности связи. Вследствие чего она увеличивается с увеличением расстояния C-O, что согласуется с другими результатами вычислений. Для сокращения количества реакционноспособных а.о. (цистеина) в структуре SAASoti, проанализировали также индивидуальное влияние при замене каждого остатка цистеина. Были получены и охарактеризованы следующие формы SAASoti: C72V, C106V, C176A. Затем были получены варианты с двойными заменами – C21N/C72V и C21N/C176A и тройной заменой C21N/C72G/C176A SAASoti В первую очередь были определены физико-химические параметры новых вариантов SAASoti (максимумы возбуждения и флуоресценции λex/λem, значения рКа хромофоров зеленой и красной форм, коэффициенты молярной экстинкции (ε) и квантовые выходы (ϕ)). Точечные замены приводят к спектральному сдвигу красных форм, заметному возрастанию значений pKa их красных форм, особенно для варианта C176A SAASoti. Для полученных форм были исследованы процессы необратимой фотоконверсии из зеленой формы в красную и обратимое фотопереключение между ярким и темным состояниями. Необратимая фотоконверсия регистрировалась в течение 10 минут при облучении белков в растворе светом с длиной волны 400 нм и фиксировались изменения интенсивности флуоресценции красной формы (590 нм) от времени. После кинетического анализы кривых образования красной формы было установлено, что процесс описывается биэкспоненциальной зависимостью (1), I=〖-I〗_1*exp⁡(-k_1 t)+I_2*exp⁡(-k_2 t)+c (1) Максимальная скорость образования красной формы наблюдалась для вариантов SAASoti с заменами в положении 72 (C72V, C21N/C72V и C21N/C72G/C176A), в то время как в вариантах с единичными и двойными заменами C72V также обеспечивает повышенную фотостабильность (минимальное значение k2). Для варианта C21N/C72G/C176A SAASoti характерны максимальные значения обоих констант k1 и k2. Увеличение скорости фотоконверсии предполагает снижение времени облучения светом с длиной волны 400 нм, что снизит токсический эффект при проведении измерений на клетках. Замена C21N в WT SAASoti привела к стабилизации мономерной формы и не повлияла на характер различных фотопревращений (фотоконверсия и фотопереключение). По этой причине C21N был выбран как улучшенный вариант мономерного SAASoti. Варианты с заменами в положении 72 продемонстрировали повышенную скорость фотоконверсии из зеленого в красный, а вариант с тройными заменами SAASoti – максимальную скорость, но в этом случае фотостабильность образующейся красной формы значительно снизилась. Вариант C106V SAASoti является самым быстрым в реакциях фотопереключения и релаксации. Все варианты C176A продемонстрировали разные механизмы фотопереключения, а кинетика фототушения зеленой формы во время фотопереключения не имеет разгорающейся компоненты во время первого цикла переключения, что указывает на возможную фотохимическую модификацию (окисление) 176 остатков цистеина во всех остальных мутантных формах. Было проведено классическое молекулярно-динамическое моделирование вариантов WT* и C176A SAASoti с последующим анализом карт взаимной корреляции, RMSD и гибкости аминокислотных остатков в хромофорной области. Аминокислотные остатки в белке WT * демонстрировали более коррелированные движения по сравнению с вариантом C176A. Также было установлено, что остаток F178 в случае C176A SAASoti менее гибкий, кроме того, данный фенилаланин в основном занимает такое же пространственное положение в C176A, что и фенильная часть хромофора в темном состоянии. Другими словами, реакция фотопереключения в WT * SAASoti обеспечивается за счет конформационной гибкости F178 в WT*. Биэкспоненциальный характер переключения «яркий-темный» ранее объяснялся существованием двух популяций белков, каждая из которых имеет индивидуальную кинетику переключения. Варианты с двойными и тройными заменами остатков цистеина, содержащие замену C176A, переключаются по моноэкспоненциальному закону. Термическая релаксация вариантов SAASoti C176A протекает медленнее по сравнению с WT* SAASoti. С176A также отрицательно влиял на фотостабильность SAASoti при повторных циклах переключения. Методом сайт-направленного мутагенеза была получена быстросозревающая форма K145P SAASoti, у которой также более чем на 10 000 увеличилось значение коэффициента молярного поглощения. Спектральные характеристики и параметры реакций фотопревращений при этом не отличаются от белка дикого типа SAASoti, поэтому она была выбрана как новый улучшенный вариант белка дикого типа SAASoti. На данном этапе были получены двойные мутантные формы SAASoti: С21N/K145P, С21N/K145P/M164A, С21N/K145P/F178S, С21N/K145P/M164A/F178S. Замены в положениях M164A и F178S приводят к смещению pKa в щелочную область, что сильнее всего отражается на красной форме. Интенсивность флуоресценции снижается в физиологических значениях pH 7,5. Скорости фотоконверсии для замен M164A/F178S и F178S превосходят скорость превращения исходного белка, однако имеют в 10 раз меньшую амплитуду интенсивности флуоресценции. Единичная замена M164A также приводит к значительному падению эффективности фотоконверсии, что, наиболее вероятно, обусловлено смещением величины pKa красной формы в область более высоких значений pH, а квантовый выход флуоресценции протонированной формы намного меньше. Скорость фотопереключения зеленой формы значительно увеличилась для всех вариантов замен 164/178 ~ в 10 раз, а для замены M164A – в 30. Скорость фотопереключения красной формы не изменилась, однако значительно увеличилась амплитуда, остаточная флуоресценция оригинального белка ~60%, в то время как для замен M164A/F178S и F178S составила ~20%, т.е. замены M164A/F178S и F178S положительно влияют на подвижность хромофора, однако отрицательно сказываются на его pKа, что снижает флуоресцентный сигнал. Методом сайт-насыщенного мутагенза были получены варианты C21N/K145P/F178X и C21N/K145P/M164X SAASoti, содержащие случайный набор а.о. в положениях 164 и 178. Для применения метода направленной эволюции отрабатывались методики анализа колоний. Была проанализирована воспроизводимость спектральных и кинетических параметров колоний E. coli, экспрессирующих мутантные формы C21N/K145P/F178X и C21N/K145P/M164X SAASoti. Оценивались разброс интенсивностей флуоресценции в максимуме и ошибки определения длины волны максимума, которую вносит шум детектора. Всего было обнаружено 84 флуоресцирующих колонии в 2х повторах. Стандартная ошибка определения интенсивности составила 20%, а длины волны максимума эмиссии – 0,4 нм. Также анализировалась воспроизводимость кинетических параметров. В рамках одной колонии разброс определения констант скоростей находится в пределах 5%. Данный анализ показал, что максимальный разброс наблюдается для интенсивности из-за разного уровня экспрессии белка, а по спектральным и кинетическим параметрам можно идентифицировать клоны с одинаковыми заменами. Было отмечено, что замены в 164 положении в основном приводят к смещению спектра эмиссии в коротковолновую область. А в случае замен в 178 положении наблюдается тенденция увеличения интенсивности в длинноволновой области. Для скрининга колоний было разработано программное обеспечение (ПО), позволяющее одновременно управлять 4 LED-источниками и спектрометром. ПО позволяет менять интенсивности светодиодов и параметры регистрации спектров в реальном времени, а также задавать циклы облучения образца с временным разрешением 10 мс. Также было разработано ПО для анализа полученных данных. С его помощью можно проводить мультиэкспоненциальный анализ кинетик и спектральный анализ, что позволяет ускорить отбор перспективных колоний.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Получение mox варианта mSAASoti Получение mox (мономерного и устойчивого к окислению) варианта mSAASoti вели путем последовательной замен а.о. цистеинов, в ходе работы были получены следующие формы: C21N, C71V, C105V, C117S, C117T, C175A, C21N/C71V, C21N/C175A, C21N/C71V/C175A, C21N/C71G/C175A. После наработки белков в клетках E. coli BL21(DE3), выделения и очистки их хроматографическими методами, были оценены флуоресцентные характеристики, а также способность к фототрансформациям (фотоконверсия, обратимое фотопереключение). Для всех мутантных форм, не содержащих замену C175A, на спектрах эмиссии наблюдали спектральный сдвиг в более коротковолновую область (1-3 нм), возникающий в результате облучения светом 470 нм. Также следует отметить, что кинетика фотопереключения первого цикла отличается от последующих. Во всех случаях, за исключением вариантов, содержащих замену C175A, переключение в первом цикле происходит согласно Уравнению 1, в то время как второй и последующий цикл – согласно Уравнению 2. I=I_1*exp⁡(-k_1 t)-I_2*exp⁡(-k_2 t)+c (1) I=I_1*exp⁡(-k_1 t)+I_2*exp⁡(-k_2 t)+c (2) На основании этих результатов можно предположить, что во время фотопереключения происходит модификация остатка цистеина в положении 175 (фотоокисление), поэтому во время первого цикла фототушения наблюдается компонента с отрицательным знаком (разгорание флуоресценции) и спектральный сдвиг, однако при масс-спектрометрическом анализе образца mSAASoti до и после облучения 470 нм не удается детектировать соответствующий пептид. Для дальнейшего получения moxSAASoti был выбран вариант C21N/C71G/C175A, при добавлении замен C105A/V и C117S/T получился нефлуоресцирующий вариант mSAASoti, после чего был проведен сайт-насыщенный мутагенез по положениям 105 и 117. Наиболее яркие (по флуоресценции) клоны содержали замены C105G и C117V/T. Варианты moxC117V и moxC117T были экспрессированы в клетках E. coli и очищены по стандартной схеме, описаны их флуоресцентные и физико-химические свойства. После изучения фотопереключения и фотоконверсии в качестве moxSAASoti был выбран вариант C21N/C71G/C105G/C117T/C175A, т.к. он имеет высокую скорость фотопереключения, более низкую степень фотодеструкции (по сравнению с moxC117V) и более высокую скорость фотоконверсии, чем у исходного mSAASoti. Добавление C105G/C117T к C21N/C71G/C175A оказало наибольшее влияние на величину pKa красной формы moxSAASoti. Получение быстропереключаемых форм mSAASoti. Замены M163A и F177S выбраны отправной точкой для увеличения эффективности фотопереключения на основании данных литературы. Также были учтены положительные свойства замен C21N и K145P (улучшенная мономерная форма и более высокий коэффициент экстинкции, соответственно). Был проведен сайт-насыщенный мутагенез в положениях 163 и 177 в исходных белках C21N и C21N/K145P mSAASoti. Отбор перспективных мутантных форм проводили, анализируя колонии, экспрессирующие варианты SAASoti, с использованием разработанной нами эпифлуоресцентной установки на основе прямого микроскопа Olympus CX41. Было проанализировано более 100 колоний, обладающих флуоресценцией. Были получены и подробно исследованы следующие формы mSAASoti: C21N/K145P, C21N/M163A, C21N/M163S, C21N/M163L, C21N/M163T, C21N/M163G, C21N/K145P/M163A, C21N/K145P/M163F, C21N/K145P/M163C, C21N/K145P/M163I, C21N/K145P/M163V, C21N/K145P/M163P, C21N/F177S, C21N/F177A, C21N/F177N, C21N/F177T, C21N/K145P/F177S, C21N/K145P/F177T, C21N/K145P/F177L, C21N/K145P/F177C, C21N/K145P/F177Q, C21N/K145P/F177G, C21N/K145P/M163A/F177S. Наибольшую скорость фотопереключения зеленой формы продемонстрировали варианты C21N/M163T и C21N/K145P/M163A (в 33 и 36 быстрее, чем mSAASoti), в то время как без замены K145P и без замен C21N/K145P – выше в 17 и 13. Вариант C21N/M163T сохранил приемлемую степень фотоконверсии по сравнению другими вариантами. Красная форма C21N/M163T способна к фотопереключению с контарстом более 90% и нормированной скоростью в 15 раз превосходящей фотоперключение mSAASoti. Таким образом был получен наиболее перспективный бифотохромный вариант C21N/M163T mSAASoti. Пикосекундная флуоресцентная спектроскопия. Чтобы понять особенности поведения хромофора в белках M163A и F177S mSAASoti, наблюдали за кинетикой перехода из возбужденного в основное состояние зеленой формы, с помощью метода TCSPC, пикосекундной флуоресцентной спектроскопии. Для mSAASoti и F177S время жизни возбужденного состояния составило 3,3 и 3,0 нс, соответственно, и описывалось одной экспонентой. В то же время переход в основное состояние M163A описывается двумя экспонентами 1,2 и 2,3 нс с соотношением I1/I2 = 1/1,7. Возможно, замена M163A высвобождает место для конформационной подвижности хромофора. Причем данные конформации, скорее, имеют менее оптимальное для флуоресценции, не плоское строение, за счет чего происходит уменьшение их времени жизни. В случае mSAASoti и F177S хромофор, вероятно, более плотно фиксирован окружением глобулы, что не является также препятствием к увеличению эффективности цис-транс изомеризации в случае F177S. Как показывает опыт структурных исследований фотопереключаемых ФБ, изомеризация может протекать как с глобальными смещениями скелета белка, так и за счет тонкой реорганизации пространства вокруг хромофора. Получение кристаллической структуры и молекулярное моделирование. Ввиду того, что не удалось получить кристаллическую структуру белка SAASoti дикого типа, а также его мономерной версии V127T SAASoti (mSAASoti), были получены варианты C21N mSAASoti и mSAASoti содержащие на C-конце последовательность из 6 гистидинов для проведения металл-хелатной хроматографии. Был проведен кристаллизационный скрининг методом диффузии в парах. Кристаллы наблюдали только в случае белка C21N-mSAASoti-His при pH 7,0 и 6,0. Полную кристаллическую структуру пока не удалось разрешить ввиду небольшого размера кристаллов. В качестве альтернативы для описания наблюдаемых изменений физико-химических свойств мутантных форм mSAASoti использовались методы классической молекулярной динамики и QM/MM. Методом молекулярной динамики с потенциалами QМ(PBE0-D3/6-31G**)/MM(CHARMM) для систем, содержащих нейтральный красный хромофор были проанализированы распределения длины ковалентной связи C-O в фенильной части хромофора. Удлинение расстояния C-O, являющееся расчетным параметром, воспроизводит экспериментально наблюдаемое увеличение значения pKa для всех вариантов замен остатков цистеина. Таким образом была оптимизирована методика прогнозирования изменений pKa хромофора при проведении рационального мутагенеза. Методом классической молекулярной динамики продемонстрировано, что гибкость F177 определяет скорость перехода между выключенным и включенным состояниями. Для каждой из мутантных форм были рассчитаны полноатомные траектории методом молекулярной динамики, в них проанализировали конформационное поведение боковой цепи F177. В качестве меры конформационного разнообразия был выбиран двугранный угол C-Ca-Cβ-Cγ. Варианты mSAASoti и moxSAASoti преимущественно демонстрируют конформации с двугранными углами между 140 и 180 градусами. Для более медленных белков с одиночными и тройной аминокислотными заменами в исходном mSAASoti, двугранные углы распределены между 20 и 100 градусами. Эта конформация менее благоприятна для перехода между темной и светлой формами, так как в этом случае карман для связывания хромофора более плотный, что препятствует изомеризации. Таким образом, было предложено использовать конформационную гибкость боковой цепи F177 для определения скорости переключения in silico.