КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

---

Номер 16-14-00052

НазваниеРасшифровка молекулярного механизма биолюминесценции высших грибов и разработка методических основ ее использования с целью создания новой патентно чистой линии аналитических методов для биотехнологии и медицины

РуководительГительзон Иосиф Исаевич, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Федеральный исследовательский центр "Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук", Красноярский край

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2020 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11).

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словабиолюминесценция, грибы, биотехнология, тест-системы, люцифераза, светящиеся грибы, Neonothopanus nambi, люциферин, люцифераза, люминесцентная система

Код ГРНТИ62.00.00

СтатусУспешно завершен

---

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

---

Аннотация
Биолюминесцентные методы исследования очень разнообразны и применяются in vitro и in vivo для анализа метаболитов, в иммунологических исследованиях, изучения экспрессии генов и экологическом мониторинге. Биолюминесценция нашла широкое применение в медицине для изучения таких болезней, как диабет, онкологические, инфекционные и нейродегенеративные заболевания (Magalhães C.M., Esteves da Silva J.C., Pinto da Silva L. (2016) Chemiluminescence and Bioluminescence as an Excitation Source in the Photodynamic Therapy of Cancer: A Critical Review Chemphyschem. 7(15):2286-94), а также для скрининга лекарственных препаратов (Kelkar M., De A. (2012) Bioluminescence based in vivo screening technologies. Curr Opin Pharmacol. 12(5):592-600), для биоимиджинга живых систем в режиме реального времени (полученные биолюминесцентные трансгенные животные в дальнейшем применяются в доклинических исследованиях (Coleman S., and McGregor A. (2015) A bright future for bioluminescent imaging in viral research. Future Virol. ; 10(2): 169–183)), также биоимиджинг широко используется для исследования белок-белковых взаимодействий. Поскольку различные классы люцифераз принципиально отличаются друг от друга по структуре белка и субстратной специфичности, их большее разнообразие позволит увеличить и методический спектр применения в фундаментальных и прикладных целях . Найденная нашей лабораторией в рамках проекта РНФ люцифераза гриба Neonothapanus nambi принадлежит к принципиально новому семейству белков, не имеющих гомологии с какими-либо описанными ранее белками. Нами была показана биолюминесцентная активность этой люциферазы при гетерологической экспрессии гена в клетках Pichia pastoris и млекопитающих. В рамках настоящего проекта мы планируем несколько задач, имеющих как фундаментальное значение, так и практическое применение. Нами будут получены линии клеток млекопитающих, стабильно экспрессирующие люциферазу гриба Neonothapanus nambi. Такие линии клеток успешно применяются в доклинических исследованиях противоопухолевой терапии (De A., Loening A.M., S.S. (2007) An Improved Bioluminescence Resonance Energy Transfer Strategy for Imaging Intracellular Events in Single Cells and Living Subjects. Cancer Res. Aug 1; 67(15): 7175–7183). Так как люцифераза грибов является мембранным белком, в процессе работы будут изучены различные среды, имитирующие мембранное окружение, в которых белок имеет нативные структуру и активность, но при этом которые отлично подходят для структурных и биофизических методов исследования. Для увеличения яркости люциферазы при таких исследованиях будет проведен мутагенез гена люциферазы, включающий модификацию N-концевого участка. Для оценки люминесцентной активности полученных мутантов, а также для детекции люциферазы в денатурированном и неактивном состоянии нами предполагается получить антитела к этому белку, что в значительной мере расширит области применения этой люциферазы и возможности постановки различных контролей. Кроме того, планируется провести масштабный подбор условий для кристаллизации люциферазы. Кристаллизация мембранных белков сопряжена со значительными трудностями (Parker J.L., Newstead S. (2016) Membrane Protein Crystallisation: Current Trends and Future Perspectives. Adv Exp Med Biol.; 922: 61–72), поскольку необходима их солюбилизация при одновременном сохранении нативной структуры и стабильности. На данный момент разрешена структура чуть более 600 мембранных белков, из более, чем 50000 известных белков, ассоциированных с мембранами. Информация, полученная при кристаллизации каждого нового мембранного белка, позволяет улучшить точность алгоритмов предсказания подобных структур и аналогичных белковых доменов.

Ожидаемые результаты
За время реализации проекта нами планируется провести модификацию гена люциферазы для увеличения ее люминесцентной активности и стабильности в водных средах. В частности, мы обратим пристальное внимание на N-конец данного белка, поскольку по биоинформатическим предсказаниям именно там расположены аминокислотные остатки, участвующие во взаимодействии люциферазы с мембраной. Возможно, модификации N-концевого участка смогут повлиять на растворимость данного белка, а также на его яркость и стабильность его структуры. В ходе проекта мы планируем с помощью методик мутагенеза создать модифицированные варианты гена люциферазы грибов, а также разработать методику высокопроизводительного скрининга мутантов с нужными свойствами. В настоящее время уровень люминесценции люциферазы грибов в гетерологической системе культуры клеток млекопитающих сопоставим с уровнем люминесценции часто используемой в биоимиджинге люциферазы светлячка (Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 115(50):12728-12732. Genetically encodable bioluminescent system from fungi. Kotlobay AA, Sarkisyan KS, Mokrushina YA, Marcet-Houben M, Serebrovskaya EO, Markina NM, Gonzalez Somermeyer L, Gorokhovatsky AY, Vvedensky A, Purtov KV, Petushkov VN, Rodionova NS, Chepurnyh TV, Fakhranurova LI, Guglya EB, Ziganshin R, Tsarkova AS, Kaskova ZM, Shender V, Abakumov M, Abakumova TO, Povolotskaya IS, Eroshkin FM, Zaraisky AG, Mishin AS, Dolgov SV, Mitiouchkina TY, Kopantzev EP, Waldenmaier HE, Oliveira AG, Oba Y, Barsova E, Bogdanova EA, Gabaldón T, Stevani CV, Lukyanov S, Smirnov IV, Gitelson JI, Kondrashov FA, Yampolsky IV.). В случае создания более яркого варианта люциферазы грибов, возрастет количество возможных методов ее применения, в том числе и в сочетании с другими известными люциферазами. В настоящее время методы, основанные на люциферин-люциферазной реакции, крайне популярны среди биологических и медицинских исследований по всему миру (J Immunol Methods. 2017 447:1-13. A bioluminescent caspase-1 activity assay rapidly monitors inflammasome activation in cells. O'Brien M, Moehring D, Muñoz-Planillo R, Núñez G, Callaway J, Ting J, Scurria M, Ugo T, Bernad L, Cali J, Lazar D.; Amino Acids. 2016 48(5):1151-60. Novel bioluminescent binding assays for interaction studies of protein/peptide hormones with their receptors. Liu YL, Guo ZY.; Biochemistry. 2017 56(39):5178-5184. Bioluminescent Probes for Imaging Biology beyond the Culture Dish. Rathbun CM, Prescher JA.), поэтому наличие яркого варианта люциферазы грибов, специфично связывающегося лишь со своим субстратом, позволит расширить круг методик биоимиджинга, а в ряде случаев увеличить чувствительность и область применения данных методов. В ходе работ над проектом нами будет создана коллекция векторов для создания лентивирусных частиц для трансдукции культур клеток млекопитающих, коллекция соответствующих вирусных частиц, а также коллекция культур клеток млекопитающих, стабильно экспрессирующих ген люциферазы грибов дикого типа или его модифицированных вариантов (например, слитый с флуоресцентным белков для улучшения визуализации и возможностей проведения микроскопических исследований или ген, кодирующий модификации N-конца для увеличения яркости продукта). Для решения практических задач, связанных с детекцией люциферазы и определения ее удельной активности, нами будут получены антитела к люциферазе. Полученные антитела будут использованы для проведения вестер-блот гибридизаций и гисто-химических реакций культур клеток млекопитающих, трансформированных геном люциферазы. С использованием в том числе мутантов с улучшенными характеристиками нами будет продолжен скрининг условий для кристаллизации люциферазы, что в дальнейшем позволит установить активный центр и механизм реакции ферментативного окисления люциферина грибов, предположения о котором выдвигались ранее (Kaskova Z.M. et al (2017) Mechanism and color modulation of fungal bioluminescence.Science Advances, Vol. 3, no. 4, e1602847). Таким образом, поставленные в проекте задачи - установление строения новой люциферазы высших грибов и разработка методов ее биомедицинского применения соответствуют тематике передовых мировых исследований в данной области. Успешная реализация поставленных задач позволит значительно усовершенствовать эргономичность имеющихся в медицине методов диагностики и мониторинга распространенных опасных заболеваний.

---

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

---