КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 16-14-10027

НазваниеГликирование белков: механизмы индукции инактивации, денатурации и агрегации белков и взаимосвязь с развитием патологий

РуководительМуронец Владимир Израилевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 2019 г. - 2020 г. 

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-203 - Общая биохимия

Ключевые словабелки, амилоидные белки, гликирование, сахара, альдегиды,шапероны, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, диабет, нейродегенеративные заболевания

Код ГРНТИ31.27.00

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Актуальность начатого в 2016 году проекта сохраняется, поскольку гликирование белков при диабете играет особую роль в развитии различных осложнений, сопровождающих данное заболевание. При планируемом продолжении проекта главным направлением исследований будет изучение роли гликирования белков в возникновении и развитии нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы, поскольку именно при изучении модификации амилоидогенных белков сахарами и альдегидами были получены наиболее интересные результаты. Не менее важным представляется исследование участия гликолиза, эффективность которого изменяется при ряде нейродегенеративных заболеваний, в накоплении гликирующих альдегидов, модифицирующих белки. Мы надеемся, что проведение планируемых исследований будет полезным для понимания механизмов развития таких социально значимых заболеваний, как диабет, болезни Паркинсона и Альцгеймера и других амилоидных патологий, и, возможно, позволит найти новые способы их лечения и профилактики. Научная новизна проекта при его продлении будет заключаться, прежде всего, в выяснении механизмов обнаруженного в нашей работе влияния альфа-синуклеина на гликолитический фермент - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАФД). Было установлено, что изменение активности этого фермента приводит не только к замедлению гликолиза, но и к накоплению метилглиоксаля и глицеральдегид-3-фосфата, способных модифицировать белки, в том числе амилоидогенные. Необходимо установить, как изменяется взаимодействие двух белков при их модификации, в частности, при гликировании альфа-синуклеина и окислении и глутатионилировании ГАФД, а также выяснить участие этих процессов в патологической трансформации клеток. Кроме того, новым является выяснение влияния модификации белков глицеральдегид-3-фосфатом на их характеристики и эффективность взаимодействия с белками-партнерами, поскольку предварительные данные указывают на существенные отличия свойств белков, модифицированных двумя альдегидами – метилглиоксалем и глицеральдегид-3-фосфатом. Будет предложена концепция о взаимосвязи гликирования, гликолиза и нейродегенерации, учитывающая новые данные, полученные при реализации проекта. При продолжении проекта будут изучены факторы, влияющие на активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, поскольку ее инактивация прямо или косвенно стимулирует накопление глицеральдегид-3-фосфата и метилглиоксаля. Основное внимание будет уделено роли глутатионилирования ГАФД, которое, как было показано в наших работах, предотвращает необратимое окисление сульфгидрильных групп активного центра фермента активными формами кислорода. В частности, при сравнении ГАФД дикого типа с мутантной формой, содержащей замену 156 остатка цистеина на серин, будет изучено значение второго цистеинового остатка активного центра в предотвращении необратимой инактивации фермента. Будет изучен механизм инактивирующего действия гликирования на ГАФД, который, предположительно, заключается в инактивации сульфгидрильных групп белка активными формами кислорода, образующимися в процессе преобразования ранних продуктов гликирования (кетоаминов) в конечные продукты. Кроме того, будет продолжено изучение взаимодействия гликированного разными способами альфа-синуклеина с ГАФД как с помощью молекулярного моделирования, так и экспериментальными методами. Будут идентифицированы продукты модификации белков глицеральдегид-3-фосфатом для установления причин отличий в их свойствах по сравнению с белками, гликированными другими соединениями. Будут проведены исследования на клеточных линиях, продуцирующих разные формы альфа-синуклеина, для подтверждения установленных для изолированных белков сведений о роли гликирования в патологической трансформации клеток, содержащих амилоидогенные белки. В этих экспериментах будут использованы стабильные клеточные линии, полученные на основе транзиентно трансфицированных клеток с помощью метода отбора клонов, которые продуцируют альфа-синуклеин дикого типа или мутантный белок A53T. Будут выделены и охарактеризованы агрегаты альфа-синуклеина, и установлено влияние модификации этого белка в разных условиях гликирования на индукцию его агрегации и амилоидоизации. Особое внимание будет уделено предотвращению сумоилирования и убиквитинилирования гликированных белков. На заключительном этапе будет сделана попытка идентификации белков, модифицированных разными гликирующими агентами, в крови больных диабетом. Кроме того, необходимо продолжить работу по детальному изучению структуры обнаруженных нами необычных флуоресцирующих спиральных агрегатов, образующихся при взаимодействии в присутствии тиофлавина Т гликированного определенным образом бета-казеина и прионного белка. В дополнение к методам флуоресцентной и трансмиссионной электронной микроскопии будет использована специальная установка, в которой образец анализируется с помощью атомно-силового и одновременно флуоресцентного микроскопа. Проведение этих экспериментов необходимо для исключения ложноположительных результатов при детекции с помощью тиофлавина Т амилоидных структур при флуоресцентной микроскопии из-за его взаимодействия с гликированными белками. Увеличение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при его связывании с гликированными белками будет использовано для разработки метода детекции модифицированных сахарами аминокислотных остатков. Будет также продолжено изучение влияния синтетических и природных полимеров на амилоидную трансформацию нативных и гликированных альфа-синуклеина и прионного белка. Продемонстрированная возможность переключения амилоидной трансформации альфа-синуклеина на аморфную агрегацию в присутствии пиридиниевого поликатиона позволяет начать поиск природных полиэлектролитов, предотвращающих патологическую агрегацию амилоидогенных белков. Будет исследована способность полиэлектролитов предотвращать инфекционное воздействие прионного белка. Полученные результаты будут использованы для моделирования влияния различных заряженных макромолекул на развитие амилоидозов у человека, а также при поиске новых подходов к лечению этих заболеваний с использованием природных полимеров. На основе изучения указанных выше молекулярных механизмов влияния гликирования на индивидуальные белки, на энергетический обмен и на жизнедеятельность клеток будет предпринята попытка выяснить причины возникновения осложнений диабета и, прежде всего, развития нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы.

Ожидаемые результаты
При реализации проекта в 2019-2020 годах будет доказано, что одним из основных последствий гликирования белков является ингибирование гликолиза на стадии, катализируемой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой (ГАФД). В результате инактивации этого фермента из-за прямого гликирования или окисления сульфгидрильных групп активного центра происходит накопление глицеральдегид-3-фосфата, являющегося одним из предшественников метилглиоксаля, концентрация которого также возрастает. Повышение концентраций двух гликирующих альдегидов приводит к дальнейшей инактивации ГАФД и к еще большему накоплению обоих альдегидов. Подтверждение этих результатов при работе с клеточными линиями, культивируемыми в различных условиях, а также изучение взаимосвязи гликирования с различными типами гибели клеток является важным и новым аспектом работы. Принципиально новыми будут результаты о роли глутатионилирования ГАФД в изменении эффективности гликолиза под действием гликирующих агентов и активных форм кислорода, накапливающихся в результате каскада реакций гликирования. Кроме того, будет выяснена функция второй сульфгидрильной группы активного центра ГАФД в обеспечении обратимого окисления остатков цистеина в присутствии восстановленного глутатиона. Сравнение особенностей окисления ГАФД дикого типа и мутантной формы ГАФД с заменой 156 остатка цистеина на серин позволит установить неизвестную до сих пор роль этого консервативного остатка в функционировании фермента. Этот аспект работы имеет принципиальное значение для фундаментальной энзимологии и соответствует мировому уровню исследований в этой области. При выяснении роли гликирования белков в возникновении и развитии нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы будут получены новые результаты о влиянии гликирования на амилоидную трансформацию альфа-синуклеина и прионного белка. Основное внимание будет уделено исследованию изменения свойств этих амилоидогенных белков после гликирования глицеральдегид-3-фосфатом, действие которого, судя по предварительным данным, может существенно отличаться от действия метилглиоксаля и восстанавливающих сахаров. Будут идентифицированы продукты модификации белков глицеральдегид-3-фосфатом для установления причин отличий в их свойствах по сравнению с белками, гликированными другими соединениями. Новым аспектом работы над проектом будет изучение влияния гликирования на сумоилирование и убиквитинилирование амилоидогенных белков, поскольку три типа модификации конкурируют за одни и те же аминокислотные остатки. Будет проверено предположение, согласно которому гликирование может уменьшать эффективность деградации амилоидогенных белков протеасомами из-за снижения сумоилирования и убиквитинилирования. Мы полагаем, что одним из отрицательных последствий гликирования может быть накопление амилоидогенных белков из-за невозможности их протеолитического расщепления. Новые важные результаты будут получены при изучении механизмов регуляции взаимодействия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и альфа-синуклеина, обнаруженного в нашей работе. Будет установлено, как изменяется взаимодействие двух белков при их модификации, в частности, при гликировании альфа-синуклеина и окислении, гликировании и глутатионилировании ГАФД, также будет выяснено участие этих процессов в патологической трансформации клеток. Данные об особенностях взаимодействия модифицированных ГАФД и альфа-синуклеина будут получены как с помощью молекулярного моделирования, так и экспериментальными методами. Сравнение данных, полученных при изучении взаимодействия изолированных гликированных белков, с информацией о патологической трансформации клеток, продуцирующих разные типы амилоидогенных белков, позволит выявить новые взаимосвязи между гликированием, гликолизом и амилоидоизацией. Мы предполагаем, что на заключительном этапе в крови больных диабетом будут выявлены белки, содержащие конечные продукты модификации глицеральдегид-3-фосфатом, что позволит выдвинуть предположение о важной роли этого метаболита в гликировании белков. Исследование структуры необычных флуоресцирующих спиральных агрегатов, образующихся при взаимодействии гликированного глюкозой бета-казеина и прионного белка, позволит доказать, что увеличение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т может происходить при его связывании с гликированными белками, а не только с бета-складчатыми структурами. Практическая значимость этих результатов связана с тем, что их необходимо учитывать для исключения ложноположительных результатов при детекции амилоидных структур при флуоресцентной микроскопии с помощью тиофлавина Т. Кроме того, данные об увеличении интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при его связывании с гликированными белками будут использованы для разработки метода детекции модифицированных сахарами аминокислотных остатков. Данные о возможности переключения амилоидной трансформации альфа-синуклеина и прионного белка на аморфную агрегацию в присутствии синтетических и природных полиэлектролитов полезны для моделирования влияния различных заряженных макромолекул на развитие амилоидозов у человека, а также для поиска новых подходов к лечению этих заболеваний с использованием природных полимеров. Одним из важных результатов реализации проекта будет гипотеза о взаимосвязи гликирования, гликолиза и возникновения нейродегенеративных заболеваний, предложенная на основе изучения указанных выше молекулярных механизмов влияния гликирования на индивидуальные белки, на энергетический обмен и на жизнедеятельность клеток. Мы полагаем, что эта гипотеза позволит выявить неизвестные ранее причины возникновения осложнений диабета, прежде всего, развития нейродегенеративных болезней и, следовательно, найти новые подходы к профилактике и лечению этих социально значимых заболеваний. Кроме того, практическое значение могут иметь разработанные способы детекции гликированных белков с помощью тиофлавина Т, а также рекомендации, позволяющие исключить ложноположительные результаты при использовании этого соединения для обнаружения амилоидных структур. Полученные результаты будут соответствовать мировому уровню исследований и будут опубликованы в ведущих отечественных и зарубежных журналах, в том числе, в изданиях, относящихся к Q1, так как данные, полученные при реализации проекта в 2016-2018 годах, уже опубликованы в престижных журналах (10 журнальных статей - в журналах, включенных в системы цитирования Web of Science и/или Scopus, а 5 статей - в изданиях, относящихся к первому квартилю (Q1) по разным системам цитирования).

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Одним из основных результатов проекта, полученных в 2019, является новая информация о влиянии гликирования на энергетический статус клеток. Эксперименты, проведенные на стабильных клеточных линиях нейробластомы SH-SY5Y, продуцирующих альфа-синуклеин дикого типа или склонный к агрегации мутантный белок A53T, показали, что инкубация с метилглиоксалем в большинстве случаев приводит к замедлению гликолиза. При этом происходит уменьшение как накопления лактата, так и потребления глюкозы. Синтез в клетках альфа-синуклеина дополнительно ухудшает энергоснабжение клеток, причем замедление гликолиза коррелирует с увеличением содержания в клетках мономерных, но не агрегированных форм альфа-синуклеина. Показано, что одной из причин уменьшения эффективности гликолиза в присутствии гликирующих агентов является снижение активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, которое может быть как следствием модификации самого фермента, так и усиления инактивирующего действия гликированного альфа-синуклеина. Полученные стабильные клеточные линии нейробластомы SH-SY5Y, продуцирующие альфа-синуклеин дикого типа или склонный к агрегации мутантный белок A53T, являются удобной моделью как для продолжения данных исследований, так и для оценки антиагрегационного действия соединений, рассматриваемых как потенциальные средства профилактики и лечения синуклеинопатий. Анализ кинетического поведения и чувствительности к окислению, а также к глутатионилированию, двух рекомбинатных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД), позволил установить неизвестную ранее функцию 156 цистеинового остатка активного центра. Этот цистеиновый остаток почти также консервативен как участвующий в каталитическом акте Cys152, однако о его функциональном значении имелась лишь ограниченная и противоречивая информация. Нами было показано, что, хотя основные кинетические параметры двух форм ГАФД (рекомбинантного фермента дикого типа и мутантной формы C156S) практически идентичны, однако мутация C156S значительно снижает чувствительность фермента к окислению. Глутатионилирование цистеина активного центра (Cys152) защищает белок от необратимого окисления, причем в определенных условиях возможно образование дисульфидной связи между Cys152 и Cys156, что было доказано методом MALDI-MS анализа. Вероятно, второй остаток цистеина Cys156 необходим как для увеличения реакционной способности каталитического остатка цистеина, так для образования дисульфидной связи Cys152-Cys156, препятствующей необратимому окислению сульфгидрильных групп фермента. Полученная информация необходима для изучения механизмов инактивации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы под действием гликирующих агентов и выяснения роли цистеиновых остатков фермента в этом процессе, запланированных на завершающий год реализации проекта. Было экспериментально подтверждено усиление взаимодействия альфа-синуклеина с глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой после его гликирования, предсказанное ранее методом молекулярного моделирования. С помощью метода молекулярного моделирования были изучены особенности взаимодействия нативной и глутатионилированной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы с нативным и гликированным альфа-синуклеином. Было высказано предположение, что ослабление связывания альфа-синуклеина с ферментом из-за присутствия в активном центре ГАФД глутатиона может компенсироваться выходом кофактора из NAD+-связывающего сайта. Были получены предварительные экспериментальные данные, подтверждающие это предположение. Было начато изучение взаимосвязи гликирования с убиквитинилированием и сумоилированием альфа-синуклеина в клеточных лизатах и разработаны подходы к исследованию этой проблемы на заключительном этапе реализации проекта. Было доказано, что гликирование как метилглиоксалем, так и 3-фосфоглицериновым альдегидом изменяет вторичную структуру рекомбинантного овечьего прионного белка, препятствует его амилоидной трансформации, стимулируя аморфную агрегацию. При этом модификация 3-фосфоглицериновым альдегидом обладает более выраженным воздействием, вероятно, из-за присутствия в полученных производных фосфатной группы. Полученные результаты о предотвращении различными полиэлектролитами патологической трансформации альфа-синуклеина важны для понимания роли природных полиэлектролитов в развитии синуклеинопатий, а также для разработки средств профилактики и лечения таких заболеваний. Продемонстрировано образование необычных флуоресцирующих структур, содержащих спиральные элементы, при совместной инкубации прионного белка, гликированного бета-казеина и тиофлавина Т. Сделанное наблюдение необходимо учитывать при выявлении амилоидных белков с помощью метода, основанного на изменении интенсивности флуоресценции тиофлавина Т, во избежание ложноположительных результатов из-за взаимодействия красителя с гликированными белками, приводящего к формированию спиральных структур. Кроме того, увеличение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при связывании с конечными продуктами гликирования может быть использовано для идентификации гликированных белков. В 2019 году по результатам работы по проекту было опубликовано 5 журнальных статей в международных изданиях, включенных в системы цитирования Web of Science и/или Scopus. Из них 4 статьи были опубликованы в журналах, относящихся к Q1. Были сделаны устные и стендовые доклады на международных конференциях, опубликованы тезисы этих докладов. 3 статьи были подготовлены и отправлены в редакции журналов.

 

Публикации

1. Баринова К.В., Серебрякова М.В., Шеваль Е.В., Шмальгаузен Е.В., Муронец В.И. Modification by glyceraldehyde-3-phosphate prevents amyloid transformation of alpha-synuclein Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics, 1867(4): 396-404 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2019.01.003

2. Муронец В.И., Мельникова А.К., Баринова К.В., Шмальгаузен Е.В. Ингибиторы глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и неожиданные последствия снижения ее активности Биохимия, 84(11):1578-1591 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1134/S0320972519110058

3. Семенюк П.И., Баринова К.В., Муронец В.И. Glycation of α-synuclein amplifies the binding with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase International Journal of Biological Macromolecules, 127:278-285 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2019.01.064

4. Семенюк П.И., Муронец В.И. Protein Interaction with Charged Macromolecules: From Model Polymers to Unfolded Proteins and Post-Translational Modifications International Journal of Molecular Sciences, 20, 1252 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.3390/ijms20051252

5. Софронова А.А, Семенюк П.И., Муронец В.И. The influence of beta-casein glycation on its interaction with natural and synthetic polyelectrolytes Food Hydrocolloids, 89:425-433 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.foodhyd.2018.11.011

6. Муронец В.И. Изменение структуры и функции белков при гликировании Acta Naturae, Спецвыпуск 2:71 (год публикации - 2019)

7. Муронец В.И., Баринова К.В., Шмальгаузен Е.В. Effect of post-translational modifications on the amyloid transformation of proteins Innovations and High Technologies MSU Ltd, p.37 (год публикации - 2019)

8. Муронец В.И., Заняткин И.А., Стройлова Ю.Ю. Unusual spiral structures, formed by glycated casein in the presence of thioflavin T International Journal of Biomedicine, Volume 9, Issue Suppl_1,32 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.21103/IJBM.9.Suppl_1.P35

9. Поздышев Д.В., Мельникова А.К., Муронец В.И. Сравнительный анализ модельных систем для изучения агрегации а-синуклеина на основе клеток линии SH-SY5Y Acta Naturae, Спецвыпуск 2:98 (год публикации - 2019)

10. Баринова К.В., Шмальгаузен Е.В., Муронец В.И. Influence of alpha-synuclein glycation on its amyloid transformation and binding with other proteins "Biophysics of Amyloid Formation" Ulm University, Germany, 19-21 February, - (год публикации - 2019)

11. Муронец В.И., Заняткин И.А. Formation of unusual spiral structures from prion protein and glycated casein in the presence of thioflavin T "Biophysics of Amyloid Formation" Ulm University, Germany, 19-21 February, - (год публикации - 2019)

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
При проведении исследований по проекту 16-14-10027 «Гликирование белков: механизмы индукции инактивации, денатурации и агрегации белков и взаимосвязь с развитием патологий» в 2020 году были изучены механизмы, участвующие в изменении жизнедеятельности эукариотических клеток вследствие гликирования белков карбонильными соединениями. Было обнаружено, что гликирование изменяет энергоснабжение эукариот на клеточной модели нейробластомы SH-SY5Y. Так, после их инкубации с метилглиоксалем или глицеральдегид-3-фосфатом снижается интенсивность гликолиза и уменьшается активность глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД). При этом действие гликирующих агентов на энергетический обмен клеток-продуцентов альфа-синуклеина было менее выражено, чем для контрольных клеток. Вероятно, это связано с тем, что, как показано было нами ранее на изолированных белках, альфа-синуклеин связывается с ГАФД и частично защищает фермент от инактивирующего действия гликирующих агентов. На изолированном препарате ГАФД была продемонстрирована практически полная необратимая инактивация фермента после его продолжительной инкубации с карбонильными соединениями (метилглиоксалем и глицеральдеги-3-фосфатом). Инактивация ГАФД была вызвана необратимой модификацией каталитического цистеинового остатка фермента. Кроме того, указанные карбонильные соединения модифицируют в ГАФД до 2-х остатков аргинина. Продукт модификации одного из аргининовых остатков (Арг80) был идентифицирован как гидроимидазолон (MG-H1). Снижение активности ГАФД при воздействии на клетки карбонильных соединений, вероятно, связано с модификацией цистеиновых остатков фермента, так как содержание модифицированных по аргининовым остаткам форм белка незначительно. Было обнаружено, что инкубация клеток-продуцентов альфа-синуклеина с карбонильными соединениями значительно снижает содержание в них олигомерных и высокомолекулярных форм белка. Это наблюдение согласуется с результатами нашей предшествующей работы, в которой было показано предотвращение амилоидной трансформации альфа-синуклеина при его модификации метилглиоксалем и глицеральдегид-3-фосфатом (Barinova et al., Biochim Biophys Acta (Proteins Proteom). 2019,1867(4),396-404). Инактивирующее воздействие на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу оказывают только олигомеры и в меньшей степени мономеры альфа-синуклеина, тогда как фибриллы альфа-синуклеина и его гликированные формы на активность фермента не влияют. Сравнение эффективности гликирования глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы дикого типа и ее мутантной формы с заменой второго цистеинового остатка Cys156 на остаток серина позволило обнаружить новую функцию Cys156, представления о роли которого до сих пор остаются противоречивыми. Было обнаружено, что реакционная способность Cys152 в активном центре ГАФД в отношении карбонильных соединений выше, чем остатка цистеина в молекуле восстановленного глутатиона (GSH). Однако при отсутствии второго остатка цистеина Cys156 в мутантной форме ГАФД под воздействием карбонильных соединений происходит только обратимая инактивация фермента из-за частичного окисления Cys152. При этом GSH полностью защищает фермент от инактивации. Следовательно, необратимая инактивация ГАФД дикого типа из-за образования необратимых продуктов модификации цистеинов при модификации карбонильными соединениями обусловлена повышенной реакционной способностью остатка Cys152. Именно для поддержания реакционной способности каталического остатка цистеина необходим второй цистеиновый остаток. Таким образом, роль 156 остатка цистеина заключается в повышении реакционной способности 152 остатка цистеина не только в отношении активных форм кислорода, но и в отношении карбонильных соединений. Такое повышение реакционной способности небходимо как для осуществления каталитической функции ГАФД, так и для не менее важного свойства - участия в нейтрализации токсичных для клетки карбонильных соединений. В контрольных клетках нейробластомы и в клетках, продуцирующих альфа-синуклеин, были обнаружены различные сумоилированные и убиквитинилированные белки, в том числе сумоилированный альфа-синуклеин. Было показано, что ингибирование протеасомной системы клеток нейробластомы, продуцирующих альфа-синуклеин, приводит к значительному накоплению в клетках этого белка. Инкубация клеток нейробластомы с метилглиоксалем или глицеральдегид-3-фосфатом, вызывающая гликирование альфа-синуклеина, приводит к его накоплению в клетках. Данные наблюдения свидетельствует об участии протеасом в деградации альфа-синуклеина, а также подтвержают предположение, согласно которому одним из отрицательных последствий гликирования может быть накопление амилоидогенных белков из-за невозможности их протеолитического расщепления. Было обнаружено, что гликирование альфа-синуклеина метилглиоксалем ослабляет его связывание с эукариотическим шаперонином TRiC. Следовательно, такая модификация предотвращает два последствия, возникающих при взаимодействии альфа-синуклеина с шаперонином TRiC: 1) блокирование активного центра шаперонина, препятствующее осуществлению реактивации белков-субстратов, 2) амилоидную трансформацию альфа-синуклеина функционально «неполноценным» шаперонином TRiC (в отсутствии АТФ). Таким образом, гликирование альфа-синуклеина приводит к его накоплению в клетке в виде аморфных агрегатов, которые не подвержены действию по крайней мере, некоторых шаперонов (TRiC). Таким образом, гликирование амилоидогенных белков предотвращает их патологическую трансформацию, в том числе с участием неполноценно функционирующих шаперонов, и стимулирует накопление аморфных агрегатов белков из-за неэффективного действия протеасомной системы на гликированные формы белков. Исследование крови пациентов с диабетом второго типа выявило накопление в лизатах их эритроцитов полипептидов, содержащих гидроимидазолон - продукт модификации аргининов метилглиоксалем. Наиболее интенсивной модификации подвергался гемоглобин и белки с молекулярной массой 18, 26 и 28 кДа. В лизатах эритроцитов было выявлено значительное количество глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и альфа-синуклеина, которые являлись основными объектами исследования в данном проекте. Однако активность фермента не изменялась при гипергликемии, а сам белок не содержал конечных продуктов гликирования или гидроимидазолона. Альфа-синуклеин хотя и не содержал продуктов гликирования, но накапливался в димерной форме в лизатах эритроцитов, причем у пациентов с диабетом содержание олигомерных форм было повышено. Появление димеров альфа-синуклеина, являющихся соединенными дитирозиновыми «сшивками» мономерами, вероятно, индуцировано активными формами кислорода, которые образуются при протекании каскада реакций гликирования. Анализ полипептидов, содержащих гидроимидазолон, и олигомерных форм альфа-синуклеина могут быть полезными для диагностики разных стадий диабета второго типа. В 2020 году результаты работы по Проекту 16-14-10027 были опубликованы в 3 журнальных статьях в изданиях, включенных в системы цитирования Web of Science, Scopus и РИНЦ и относящихся к Q1. Кроме того одна статья была принята в печать, а один обзор, суммирующий результаты исследований, направлен в редакцию журнала. Результаты работы были также представлены на международной конференции в виде устного доклада, а 2 стендовых доклада, принятых для участия в конференции, буду представлены после завершения пандемии. В нескольких интервью, данных участниками проекта и опубликованных в средствах массовой информации, отмечена роль РНФ как в поддержки данной работы, так и научных исследований в России в целом.

 

Публикации

1. - S-нитрозилирование -, - (год публикации - )

2. Баринова К.В., Серебрякова М.В., Эльдаров М.А., Куликова А.А., Мицкевич В.А., Муронец В.И., Шмальгаузен Е.В. S-glutathionylation of human glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and possible role of Cys152-Cys156 disulfide bridge in the active site of the protein Biochimica et biophysica acta. General subjects, 1864(6):129560, 1-11 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2020.129560

3. Заняткин И.А., Стройлова Ю.Ю, Мельникова А.К., Моосави-Мовахеди А.А., Сабури А.А., Эртле Т., Муронец В.И. Unusual spiral structures, formed by glycated casein in the presence of thioflavin T: amyloid transformation? Mendeleev Communications, - (год публикации - 2021)

4. Заняткин И.А., Стройлова Ю.Ю., Мельникова А.К., Мусави-Мовахеди Али Акбар, Эртль Томаш, Муронец В.И. Unusual spiral structures, formed by glycated casein in the presence of thioflavin T: amyloid transformation? Mendeleev Communications, 31 (1) 73-75 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.mencom.2021.01.022

5. Кудрявцева С.С., Стройлова Ю.Ю., Курочкина Л.П., Муронец В.И. The chaperonin TRiC is blocked by native and glycated prion protein Archives of biochemistry and biophysics, 683, 108319, 1-7 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.abb.2020.108319

6. Семенюк П., Курочкина Л., Баринова К., Муронец В. Alpha-Synuclein Amyloid Aggregation Is Inhibited by Sulfated Aromatic Polymers and Pyridinium Polycation Polymers, 12 ( 3), 517, 1-11. (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/polym12030517

7. - Ученые выяснили, какие искусственные полимеры помогут лечить болезнь Паркинсона (по материалам статьи в журнале "Polymers") "Газета ру" (gazeta.ru), - (год публикации - )

8. - Искусственные полимеры помогут лечить болезнь Паркинсона (по материалам статьи в журнале "Polymers") "Индикатор" (indicator.ru), - (год публикации - )

9. - Ученые выяснили, какие искусственные полимеры помогут лечить болезнь Паркинсона (по материалам статьи в журнале "Polymers") "Поиск" (poisknews.ru), - (год публикации - )

10. - Интервью участника проекта по гранту РНФ Софии Кудравцевой Лаборатория научной журналистики, - (год публикации - )

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта могут найти применение при разработке средств профилактики и лечения нейродегенеративных заболеваний амилоидной природы, а также новых способов диагностики изменений, возникающих при диабете, перечисленных ниже. 1. Полученные стабильные клеточные линии нейробластомы SH-SY5Y, продуцирующие альфа-синуклеин дикого типа или склонный к агрегации мутантный белок A53T, могут быть использованы в качестве модели для оценки антиагрегационного действия соединений, рассматриваемых в качестве средств профилактики и лечения синуклеинопатий. 2. Природные и синтетические полиэлектролиты, антиамилоидное действие которых было обнаружено в данной работе, могут быть использованы для разработки средств профилактики и лечения синуклеинопатий и других нейродегенеративных амилоидозов. 3. Обнаруженное в работе увеличение интенсивности флуоресценции тиофлавина Т из-за взаимодействия красителя с гликированными белками может быть использовано для идентификации гликированных белков. 4. Для диагностики разных стадий диабета второго типа может быть использован анализ полипептидов, содержащих гидроимидазолон, и олигомерных форм альфа-синуклеина в лизатах эритроцитах пациентов с гипергликемией.