Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В контексте канцерогенеза, дормантное состояние опухоли может быть определено как биологический феномен, при котором клетки опухоли характеризуются низкой пролиферативной активностью, а также низким уровнем метаболических процессов. Установлено, что ограниченное число клеток в опухолевой ткани может находиться в «спящем» («дормантном») состоянии в течение неопределенного времени, а затем под воздействием опять же неизвестных стимулов переходить в пролиферативное состояние. Эпигенетические процессы рассматриваются как одни из возможных вариантов подобных стимулов. микроРНК относятся к классу эпигенетических регуляторов, которые вызывают деградацию мРНК и угнетение трансляции. микроРНК могут играть роль в регуляции пролиферативного/ «спящего» состояния опухолевых клеток и динамического баланса между этими двумя состояниями. В результате первого года реализации данного проекта нами были получены Ki-67-негативные, G0-позитивные клетки меланомы после воздействия химиотерапевтическими агентами. Данные клетки экспрессировали ингибитор циклин-зависимой киназы 1В , что является характерным для дормантных клеток. Нами было определено, что данные клетки повышенно экспрессируют miR-204-5p и miR-211. При этом экспрессия miR-204-5p превысила 10-20 раз по сравнению с пролиферирующими клетками меланомы. Ранее нами было показано, что miR-204-5p является одной из наименее экспрессируемых микроРНК в образцах меланомы по сравнению с меланоцитарными невусами. Остается непонятным, принимает ли участие микроРНК miR-204-5p в регуляции перехода опухолевых клеток в состояние G0, а также поддержании этого состояния.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Резистентность к противоопухолевой терапии обусловлена многочисленными факторами, но в том числе, гетерогенностью опухолевой ткани и наличием среди опухолевых клеток незначительной доли G0-положительных, так называемых дормантных опухолевых клеток. Последние характеризуются сниженной метаболической активностью, однако повышенной устойчивостью к действию противоопухолевых веществ, в равной степени, как и к другим апоптоз-индуцирующим стимулам. Ранее нами было определено, что микроРНК miR-204-5p регулирует пролиферацию и апоптоз клеток меланомы, а с учетом литературных данных о ее участии в развитии химиорезистентности, нами было предположено, что данная микроРНК может также принимать участие в регуляции перехода опухолевых клеток в дремлющее состояние, фазу покоя. В этой связи, на данном этапе нами была осуществлена трансфекция специфического аналога, мимика miR-204-5p в клетки меланомы, которые предварительно подвергались воздействию противоопухолевого агента дакарбазина. Ранее нами было продемонстрировано, что дакарбазин вызывает повышение доли G0-положительных клеток в клеточных линиях меланомы BRO и SK-MEL-2. Эффективность трансфекции мимика была подтверждена повышением экспрессии целевой микроРНК, но также и ее генов-мишеней. Далее нами было выявлено, что гиперэкспрессия miR-204-5p вызывает снижение доли клеток, находящихся в апоптозе, повышая при этом, соответственно, процент живых клеток. Помимо этого, гиперэкспрессия miR-204-5p вызывала увеличение доли G0-положительных клеток меланомы после воздействия на них дакарбазином. Профилирование микроРНК клеток меланомы с гиперэкспрессией miR-204-5p после инкубации с дакарбазином выявило повышение в них уровня семейства микроРНК miR-320a, miR-320b, miR-320c, гены-мишени которых регулируют клеточный цикл, в том числе функционирование ингибитора циклинзависимой киназы 1B (CDKN1B) . Транскриптомный анализ данных выявил множественные изменения экспресии генов, являющихся компонентами сигнальных путей, связанных с клеточным циклом, но также сигнальных путей которые могут иметь отношение к ремоделированию микроокружения опухоли – сигнальный путь хемокинов, VEGFA-VEGFR2. Таким образом, дакарбазин обладает способностью повышать долю клеток меланомы, находящихся в фазе покоя, что может быть усилено при повышении экспрессии микроРНК miR-204-5p.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Новообразования состоят из клеток, различных по своей способности поддерживать эффективный рост опухоли в целом, метастазирование или устойчивость к проводимой терапии. Хотя сведения о дормантных клетках остаются весьма ограниченными, установлено, что их наличие является универсальной характеристикой новообразований, а сами дормантные клетки связаны с развитием рецидивов опухоли. Дормантные клетки временно выходят из клеточного цикла и находятся в фазе G0, однако сохраняют способность к пролиферации. На данном этапе исследования нами был проведен анализ профиля микроРНК и транскриптома клеток меланомы после воздействия химиотерапевтическим алкилирующим агентом дакарбазином, который применяется в терапии данного заболевания. Нами было показано, что часть клеток после этого воздействия сохраняют жизнеспособность, переходя в фазу G0 клеточного цикла. Анализ распределения дифференциально экспрессируемых генов по сигнальным путям показал, что наибольшее число генов являются компонентами механизмов внутриклеточной сигнализации «PI3K/AKT signaling pathway», «MiR-targeted genes in lymphocytes», «Cell cycle», «Focal adhesion: PI3K-AKT-mTOR-signaling pathway», «VEGFA-VEGFR2 signaling pathway». Профилирование микроРНК клеток меланомы после воздействия дакарбазином с последующей трансфекцией в эти клетки имитатора микроРНК miR-204-5p показало изменение уровня микроРНК, которые связаны с развитием лекарственной устойчивости. Ранее нами было показано, что микроРНК miR-204-5p принимает участие в регуляции пролиферации клеток меланомы. Для разъяснения механизмов участия miR-204-5р в регуляции клеточного цикла, на основе биоинформатического анализа было определено, что одним из генов-мишеней miR-204-5p является транскрипционный фактор FOXC1. Для доказательства функционирования FOXC1 в качестве регуляторной мишени miR-204-5p, была использована генетическая конструкция, где за геном светлячковой люциферазы была вставлена 3-некодирующая область гена FOXC1. Результаты репортерного люциферазного анализа показали, что воздействие имитатора miR-204-5p подавляет люциферазную активность в клетках с данной конструкцией, то есть miR-204-5p напрямую регулирует FOXC1 посредством взаимодействия со своим сайтом-мишенью в его 3'-некодирующей области. Трансфекция малых интерферирующих РНК FOXC1 в клетки меланомы вызывала снижение уровня вышеуказанной микроРНК, что соотносится с общепринятыми представлениями о регуляции экспрессии микроРНК генами-мишенями по принципу обратной связи. Оценка уровня пролиферации клеток меланомы под воздействием малых интерферирующих РНК FOXC1, выявила снижение пролиферативной активности клеток через 72 часа после трансфекции. Повышение доли G0-положительных клеток меланомы характеризовалось снижением уровня FOXC1. Таким образом, FOXC1, являющийся геном-мишенью микроРНК miR-204-5p, может участвовать в транскрипционной регуляции клеток, находящихся в G0/G1. При экспериментальном исследовании эффектов miR-204-5p с введением имитатора данной микроРНК на модели C57Bl6/B16 нами было выявлено изменение уровней генов-мишеней miR-204-5p BCL2, SIRT1 в легких, печени, почках, что свидетельствует о возможности модуляции эффектов микроРНК в дистантных органах, предполагает возможность целенаправленного воздействия на процессы, связанные с этой микроРНК в данных органах. Отмечалась тенденция к снижению объемов опухолевых узлов в группе животных, подвергнутых воздействию имитатором микроРНК miR-204-5p.