КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 19-15-00125

НазваниеКаспазы: функциональное значение в норме и патологии

РуководительЖивотовский Борис Давидович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2019 - 2021 

КонкурсКонкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-101 - Экспериментальная медицина

Ключевые словагибель клеток, каспазы, митотическая катастрофа, эволюция, рак

Код ГРНТИ76.03.31


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Феномен программируемой гибели клетки (ПГК) характерен для всех живых организмов. Он необходим для развития эмбрионов, а во взрослом организме для поддержания гомеостаза всех тканей и органов. Совершенно очевидно, что механизм ответственный за регуляцию гибели клеток одинаково важен для организма, как механизмы, ответственные за деление клеток и их дифференцировку. Нарушения в функционировании любого из этих механизмов ведут к возникновению большого ряда заболеваний. Одной из причин возникновения и течения одного из важнейших и наиболее грозных заболеваний – рака - является неспособность организма уничтожать патологические опухолевые клетки. Важно также отметить, что если феномен ПГК один из нескольких физиологических изменений, ведущих к возникновению и развитию опухоли, то этот феномен является единственным, ответственным за элиминацию опухолевых клеток. Исследование различных аспектов клеточной гибели является наиболее быстро развивающейся областью биомедицины и, как следствие, единственная область биомедицины, удостоенная двух Нобелевских Премий по Физиологии или Медицины в 21 веке (2002 и 2016 гг). Наиболее изученной формой ПГК является апоптоз. В его инициации и развитии важнейшую роль играет семейство цистеиновых протеаз – каспазы. В настоящее время идентифицировано 13 белков данного семейства, из них у человека их 11. Белки данного семейства обнаружены также у нематоды (2 белка), у дрозофилы (6 белков) и других организмах. Совершенно очевидно, что количество каспаз в разных организмах растет пропорционально комплексности последних. Помимо участия в развитии апоптоза, каспазы принимают участие в регуляции воспалительного ответа клетки, а также в дифференцировке клеток. К сожалению, эволюционная роль каспаз не ясна. В настоящем проекте будет впервые создана система эволюции каспаз на основе Марковского моделирования и проведен анализ изменения всех известных физико-химических свойств их аминокислот. Уникальной особенностью системы будет являться возможность напрямую соотносить вычисленные особенности молекулярной эволюции с эволюцией заданных фенотипических признаков организмов и, таким образом, легко интерпретировать полученный результат. Кроме того, с помощью созданной системы будет проведен корреляционный анализ, который позволит выделить новые функциональные особенности ферментов, а также установить роль ранее малоизвестных каспаз в различных процессах ПГК. Первой из каспаз, обнаруженных у человека, являлась каспаза-2, которая, однако, остается наименее изученной. Мы и наши зарубежные коллеги установили, что каспаза-2, как член семейства каспаз, обладает как проапоптотическими, так и онкосупрессорными функциями, а также функциями поддержания генетической стабильности, и играет одну из ключевых ролей в запуске апоптоза в клетках в ответ на генотоксический стресс. Работы последних лет продемонстрировали ее роль в элиминации потенциально опасных онкогенных анеуплоидных клеток, получившихся в результате нарушений процесса деления. Однако, детальные механизмы активации и функционирования каспазы-2 остаются неясными и требуют дальнейшего изучения. В процессе выполнения предыдущего проекта, поддержанного РНФ нами получены новые факты, касающиеся как апоптотических, так и неапоптотических функций данного белка, установлена новая платформа его активации, получены гетерозиготы мышей, несущих гены дикого типа и с делециями. В настоящем проекте мы планируем исследование мышей с нокаутом по каспазе-2. Нами будет изучен фенотип нокаутных по каспазе-2 мышей, влияние отсутствия данного белка на репродуктивную, нервную и иммунную системы. К числу конкретных задач данного проекта относятся (см. также файл в приложении): 1. Молекулярно-филогенетический анализ каспаз и построение филогенетических деревьев, что позволит установить не только родство между организмами и описать эволюционную составляющую процесса ПГК, но и предсказать новые функции ферментов, а также их роль в клеточных процессах онкогенеза. 2. На модели мышей, дефицитных по гену каспазы-2, изучить фенотип животных и физиологическую роль данного белка, что даст возможность ответить на вопрос о важности каспазы-2 как регулятора нормальных процессов в организме. 3. Установить роль каспазы-2 в процессах различных типов ПГК, ее роль в детекции повреждений и репарации ДНК. Новизна предлагаемого проекта состоит в установлении функциональных особенностей каспаз, которые возникли в результате эволюции и их значимость в различных процессах ПГК. Впервые будет проведен анализ фенотипических изменений, зависящих от экспрессии каспазы-2 в клетках, изучена физиологическая роль данного фермента в норме и при патологии, ее участие в регуляции различных типов ПГК, детекции повреждений ДНК и процессах репарации/репликации. Все принципиально новые знания о молекулярных основах процессов ПГК будут использованы в качестве основы для разработки в будущем новых подходов способствующих повышению эффективности химиотерапии злокачественных новообразований. Условиями для успешного выполнения данного проекта является наличие: (а) команды, включающей как опытных, так и молодых исследователей, обладающей опытом в исследовании различных форм клеточной гибели; (б) предварительно полученных интересных и перспективных результатов; (в) оборудования необходимого для проведения экспериментов (конфокальный микроскоп, уникальный прибор для оценки биоэнергетики клетки – Seahorse Analyzer, оборудование для спектрального анализа, проточный цитометр, наличие многих программ для постройки филогенетических деревьев, и т.д.).

Ожидаемые результаты
К моменту завершения работы над проектом планируем: 1. Установить и понять эволюционную составляющую процесса программируемой гибели клеток (ПГК), построить филогенетическое дерево каспаз, и предсказать новые функции ферментов, а также их роль в процессe онкогенеза. 2. Изучить фенотип животных, дефицитных по гену каспазы-2 и понять апоптотические и неапоптотические функции данного белка. 3. Получить новую важную информацию о роли каспазы-2 в процессах различных типов ПГК, ее роль в детекции повреждений и репарации ДНК. Известно, что машина, регулирующая ПГК постоянно экспрессируется в клетках, но находится под контролем ингибирующих факторов. Важно отметить, что многие гены и их продукты, участвующие в регуляции ПГК могут выполнять «нормальные» функции, не связанные с гибелью. К сожалению, большая часть таких функций до настоящего времени остается не исследованной. Поэтому, идентификация генов и их продуктов, вовлечённых в регуляцию ПГК и взаимосвязь между ними являются важной научной задачей. В то же время, все возрастающий объем знаний о механизме их действия заложили фундамент для выработки новых терапевтических стратегий, способных использовать в качестве мишеней различные звенья метаболических путей клеточной гибели. Каспазы, семейство цистеиновых протеаз, играют важную роль в инициации и развитии апоптоза, наиболее изученного механизма ПГК. Они найдены во многих организмах, но их роль в эволюции абсолютно неизвестна. В результате данного проекта мы ожидаем выяснить эволюционную составляющую процесса ПГК, построить филогенетическое дерево каспаз и, насколько возможно, предсказать новые функции этих ферментов. Таких данных в настоящее время нет и совершенно очевидно, что такие результаты будут соответствовать самому передовому уровню знаний. Они помогут также установить роль каспаз в клеточных процессах онкогенеза. В настоящем проекте мы продолжим изучение свойств каспазы-2. Нами в предыдущем проекте, поддержанном РНФ, впервые было показано существование альтернативного комплекса активации каспазы-2, отличного от описанной в литературе платформы PIDDosome. был проанализирован механизм активации каспазы-2 в составе высокомолекулярного комплекса в ответ на обработку раковых клеток ДНК-повреждающим препаратом цисплатином, разработан оригинальный метод выделения высокомолекулярного комплекса активации каспазы-2 (получен патент), с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 были созданы линии клеток Caov-4, отличающиеся практически полным отсутствием каспазы-2 и гетерозиготы соответствующих мышей. В настоящем проекте мы, после получения гомозиготных мышей, ожидаем получить новые данные о фенотипе животных, дефицитных по гену каспазы-2 и понять, как апоптотические, так и неапоптотические функции этого фермента. Более того, т.к. каспаза-2 может выполнять онкосупрессорные функции, полученные нами результаты помогут установить механизм этого феномена. Мы впервые сможем описать роль каспазы-2 в регуляции иммунной и репродуктивной систем организма, а также в когнитивной функции. Принципиально важным и интересным является получение новой информации о роли каспазы-2 не только в апоптозе, но и других типов ПГК, ее роль в детекции повреждений и репарации ДНК. Все ожидаемые результаты являются новыми, оригинальными и соответствуют мировому уровню. Область исследования программируемой гибели клеток является одной из наиболее быстро и эффективно развивающихся областей биомедицины. Наша группа входит в число лидирующих в мире и, к сожалению, весьма немногочисленных в России, занимающихся этой проблемой. Научная значимость ожидаемых результатов достаточно высока. Мы проводили и будем стараться проводить исследования на самом высоком уровне, и сохранять высокий статус известной в мире российской лаборатории, ведущей фундаментальные и прикладные исследования в данной области знаний. Мы, в результате выполнения данного проекта, планируем не только внести вклад в понимание механизмов клеточной гибели, но и получить научные данные, используя экспериментальные модели животных, которые впоследствии можно будет рекомендовать для разработки новых подходов к идентификации мишеней, позволяющих расширить набор терапевтических вариаций при лечении онкологических заболеваний. Важно отметить, что научные данные и постоянно развиваемая нами инфраструктура были и будут доступны научному сообществу вне нашей лаборатории. Тематика, разрабатываемая нашей группой (анализ функционального значения каспаз в норме и патологии) представляет собой предмет центральной важности, поскольку полученные результаты существенно расширят наши знания в одной из наиболее развивающихся областей знаний и позволят существенно повлиять на развитие направления, связанного с возможным повышением эффективности применяемых стратегий противоопухолевой терапии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проведено моделирование эволюции всех членов семейства каспаз и оценка эволюционной изменчивости всех известных физико-химических свойств аминокислот. Собрана база данных аминокислотных последовательностей всех известных каспаз в основных таксономических семействах. Проведено множественное выравнивание, а также построено филогенетическое дерево. Проведен анализ отношения частот фиксации радикальных аминокислотных замен к консервативным и исследование скоростей изменения физико-химических свойств каспаз в их эволюции. С помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 созданы мутантные мыши имеющие делеции 7 нуклеотидов и 20 нуклеотидов в экзоне 5 каспазы-2. Выполнено генотипирование мышей с данными делециями и установлено, что у полученных генно-модифицированных животных действительно нокаутирован ген каспазы-2. Впервые показано, что гомозиготные семьи ko-casp2/ko-casp2 с обеими делециями практически не дают потомства. При этом, самцы ko-casp2/ko-casp2 не способны покрывать самок, а самки ko-casp2/ko-casp2 вообще не дают потомство. Следовательно, размножение выведенных нокаутных линий оказалось возможным лишь только с помощью скрещиваний гетерозиготных животных, что значительно удлинило процесс накопления нокаутных животных и весь процесс исследования. При патоморфологическом анализе мышей линии FVB/N дикого типа никакой патологии отмечено не было. В связи со сложностью получения потомства, в течение первого года нами получено очень ограниченное число гомозиготных самок. Большая их часть была использована для скрещивания без всякого успеха. Поэтому, число гомозиготных нокаутных мышей обоего пола для патоморфологических исследований было не достаточным. Данная работа продолжается по мере накопления нокаутных животных и статистический анализ патоморфологических исследований будет проведен в течение следующего года. Необходимо подчеркнуть, что факт неспособности к размножению связан с нокаутированием гена каспазы-2. Это представляет собой очень неожиданное, интересное и новое наблюдение. В связи с этим нами запланировано в будущем детально изучить данный феномен, а именно, каким образом отсутствие каспазы-2 может влиять на половую систему мышей. Для выявления механизмов развития нарушений митоза в клетках карциномы яичника, дефицитных по каспазе-2, к обработке ДНК-повреждающими агентами были использованы следующие химиотерапевтические препараты, различающиеся по механизму действия: цисплатин, колцемид, этопозид и доксорубицин. В экспериментах были использованы клетки линии Caov-4 wild type (wt), Caov4-shRNA caspase-2 (sh), CRISPR/Cas9 control Caov-4 (с/с) и caspase-2 knockout Caov-4 (CRISPR/Cas9) (ko). Установлено, что все препараты вызывают индукцию апоптоза. Анализ повреждения ДНК выявил существенное отличие в детектируемом количестве фосфорилированого по серину 139 гистона H2AX. Уровень фосфорилирования Ser139H2AX был существенно ниже в каспаза-2 дефицитных клетках. При обработке клеток колцемидом, который оказывает непосредственное влияние на микротрубочки, отличия в уровне фосфорилирования H2AX не детектировались, что позволяет утверждать, что механизм воздействия на клетки данного препарата не зависит от наличия каспазы-2. С помощью ингибиторного анализа показано, что инкубация в течение 24 или 48 часов с доксорубицином приводит к значительному росту активности каспазы-2 в клетках Caov-4 с/с, но при этом активность каспазы-2 не регистрировалась в нокаутных по этому белку клетках. Для анализа накопления биохимических маркеров программируемой гибели клетки карциномы яичника Caov-4-wt, с/с и caspase-2 knockout Caov-4 инкубировали с доксорубицином (600 нM) в течение 8, 16 и 24 часов. Вестерн-блот анализ лизатов клеток показал, что в клетках с нормальным уровнем каспазы-2, обработанных доксорубицином, через 24 часа детектируется значительное количество фрагмента каспазы-3 р17и р89-PARP, но не в клетках caspase-2 knockout Caov-4. При этом различия в уровне накопления γH2AX в зависимости от наличия каспазы-2 в клетке детектировались после 12 часов инкубации. Таким образом, отсутствие или дефицит каспазы-2 свидетельствуют об устойчивости клеток без каспазы-2 к программируемой гибели в условиях генотоксического стресса индуцированного доксорубицином. Исследование накопления γН2АХ нормальными клетками Caov-4 и клетками Caov-4, нокаутными по каспазе-2 (CRISPR/Cas9) показало наличие γН2АХ в клетках Caov-4 и caspase-2 knockout Caov-4 (CRISPR/Cas9) уже через 15 минут после обработки доксорубицином, т.е., индукция γН2АХ происходит задолго до момента начальной активации каспаз. Наличие отличий в уровне фосфорилирования Н2АХ спустя столь непродолжительное время после обработки, говорит о возможности влияния каспазы-2 на детекцию двунитевых разрывов ДНК, что, в свою очередь, возможно, является новой неапоптотической функцией каспазы-2 в клетке. Согласно данным проточной цитометрии, при обработке в течение 48 часов клеток Caov-4 доксорубицином, более 80% клеток находились в тетра- или полиплоидном состоянии, что говорит о нарушениях процесса клеточного деления и возможности развития митотической катастрофы. Для проверки гипотезы о развитии митотической катастрофы в клетках Caov-4 wt и caspase-2 knockout Caov-4 был проведен анализ ядерной морфологии методом конфокальной микроскопии через 48 часов после обработки доксорубицином. Показано, что в необработанных клетках caspase-2 knockout Caov-4 (CRISPR/Cas9) детектируется бόльший процент клеток с нарушениями митоза и явлением мультинуклеации – 6,5%, чем в линии клеток Caov-4 дикого типа – 1,9%. Это согласуется с данными о геномной нестабильности и увеличении количества анеуплоидных клеток в опухолях, дефицитных по каспазе-2. Анализ изменения морфологии ядра спустя 48 часов после обработки доксорубицином продемонстрировал отличие порядка 6% в количестве клеток, которые находятся в состоянии митотической катастрофы в линиях Caov-4 дикого типа (30,8%) и caspase-2 knockout Caov-4 (CRISPR/Cas9) (25,2%). Таким образом, можно утверждать, что обработка клеток карциномы низкими концентрациями доксорубицина приводит к накоплению клеток в состоянии митотической катастрофы, однако этот процесс не зависит от каспазы-2. Анализ накопления SubG1 популяции показал, что при обработке клеток карциномы яичника в течение 24 часов эта популяция в клетках с нормальным уровнем каспазы-2 увеличивается в 4 раза, в то время как в нокаутной линии количество апоптотических клеток находится на уровне контроля. Через 48 часов после обработки доксорубицином в популяции клеток дикого типа наблюдалось существенное увеличение клеток с фрагментированной ДНК - в 17 раз, однако в клеточной линии с поддавленной экспрессией каспазы-2 популяция SubG1 увеличилась только в 3 раза. Таким образом, в клетках Caov-4 с нормальным уровнем каспазы-2 в условиях генотоксического стресса, индуцированного низкими концентрациями доксорубицина, доля погибших клеток по сравнению с контролем возросла очень существенно: в 4 раза спустя 24 часа после обработки, и спустя 48 часов – в 17 раз. При этом нокаутная по каспазе-2 линия Caov-4 проявляла гораздо большую резистентность по отношению к действию доксорубицина: спустя 24 часа инкубации с доксорубицином количество погибших клеток увеличилось в 1,5 раза, спустя 48 часов – только в 3 раза. Анализ данных проточной цитофлуорометрии показал, что при обработке доксорубцином пик основной популяции распределения клеток в клеточном цикле постепенно смещается в область 4n, т.е. происходит арест клеточного цикла и основная часть клеток становится тетра- и полиплоидными. Этот процесс происходит вне зависимости от наличия каспазы-2 в клетке, что также свидетельствует о развитии каспаза-2-независимой митотической катастрофы. Таким образом, наличие каспазы-2 определяет уровень гибели клеток после наступления состояния митотической катастрофы, но накопление полиплоидных клеток и клеток в состоянии митотической катастрофы не зависит от каспазы-2. В результате исследования нами опубликованы 3 статьи в журналах, входящих в Q1 и сделано 19 докладов на международных и национальных конференциях. Дополнительные исследования: Проведена оценка эффективности кремниевых поровых наночастиц (PSi-NPs – porous silicon nanoparticles), загруженных противоопухолевым препаратом доксорубицином, для индукции апоптоза опухолевых клеток различной этиологии. Установлено, что пустые наночастицы не обладают токсичностью для опухолевых клеток в широком диапазоне концентраций. Обработка клеток наночастицами Psi-NPs, загруженными доксорубицином, была эффективней в индукции клеточной гибели, чем обработка клеток свободным доксорубицином. В рамках проекта был проведен анализ путей как прямого, так и непрямого ингибирования антиапоптотического белка Mcl-1. В качестве непрямых регуляторов антиапоптотической активности Mcl-1 были проанализированы соединения, влияющие на содержание данного белка в опухолевых клетках за счет модуляции уровня его синтеза/распада. Так, были описаны соединения, влияющие на общий уровень синтеза белков (ингибиторы белков семейства CDK, ингибиторы mTOR) и активаторы протеасомной деградации Mcl-1. В качестве прямых антагонистов Mcl-1 были проанализированы соединения класса BH3-миметиков. Акцент был сделан на описании биологических маркеров, коррелирующих с ответом на данные соединения, а также на анализе потенциальных комбинаций, которые могут быть использованы в противоопухолевой терапии. Нами впервые проанализированы с помощью биоинформатического подхода данные о специфических типах аутофагии, связанных с различными внутриклеточными компартментами, их роли в физиологии всего организма и в связи с различными заболеваниями. Мы показали, что в зависимости от метаболического статуса клеток аутофагия и их избирательные формы могут быть союзником или врагом.

 

Публикации

1. - Биологи изучили пути гибели клеток с поврежденной ДНК Индикатор.Ру, - (год публикации - ).

2. - Специалисты МГУ изучили пути гибели клеток с поврежденной ДНК Газета.Ру, - (год публикации - ).

3. - Исследование клеток с поврежденной ДНК поможет в борьбе с раком Поиск, - (год публикации - ).

4. - Ученые МГУ изучили пути гибели клеток с поврежденной ДНК Новости МГУ, - (год публикации - ).

5. - Ученые МГУ изучили пути гибели клеток с поврежденной ДНК Нучная Россия, - (год публикации - ).

6. - Ученые МГУ исследовали гибель клеток с поврежденной ДНК АиФ, - (год публикации - ).

7. - Учёные МГУ: Пористый нанокремний поможет в борьбе с раком Новости МГУ, - (год публикации - ).

8. - Пористый кремний превратили в наноконтейнеры для доставки лекарств к раковой опухоли Наука ТАСС, - (год публикации - ).

9. - УЧЕНЫЕ ПРЕДЛОЖИЛИ БОРОТЬСЯ С РАКОМ С ПОМОЩЬЮ НАПОЛНЕННЫХ ЛЕКАРСТВОМ НАНОКОНТЕЙНЕРОВ НА ОСНОВЕ КРЕМНИЯ Агентство Москва Новости, - (год публикации - ).

10. - Московские ученые предложили лечить рак с помощью кремния Москва 24, - (год публикации - ).

11. Абдрахманов А, Гогвадзе В, Животовский Б. To eat or to die: deciphering selective forms of autophagy Trends in Biochemical Sciences, - (год публикации - 2019).

12. Максимчик П, Тамаров К, Шевал ЕВ, Толстик Е, Киршбергер-Толстик Т, Янг З, Сиваков В, Животовский Б, Осминкина ЛА Biodegradable porous silicon nanocontainers as an effective drug carrier for regulation of the tumor cell death pathways ACS: Biomaterials, Science and Engineering, 5, 11, 6063-6071 (год публикации - 2019).

13. Прохорова ЕА, Егоршина АЯ, Животовский Б., Копеина ГС The DNA-damage response and nuclear events as regulators of nonapoptotic forms of cell death Oncogene, - (год публикации - 2019).


Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. За текущий отчетный период удалось провести анализ замен аминокислот к консервативным и исследование скоростей изменения физико-химических свойств каспаз. Вычислили частоту изменений этих показателей между всеми альтернативными наследственными последовательностями узлов дерева. Было показано, что наибольшая степен дивергенции наблюдалась для клад, тесно связанных с возникновением крупных таксономических групп. Также было выявлена интересная ассоциация между наличием определённых каспаз у грызунов, степенью аминокислотных замен и продолжительностью жизни. 2. Поскольку на первом году были получены мыши с делециями 7 (del7) и 20 (del20) нуклеотидов в 5 экзоне гена каспазы-2, было важно показать, что полученные животные не содержат остаточной мРНК, синтезированной с мутантного гена. При этом мРНК, синтезирующаяся с мутированного гена, должна содержать преждевременные стоп-кодоны, что должно приводить к ее деградации по механизму Nonsense-mediated mRNA decay. Для подтверждения того, что нокаутные по каспазе-2 мыши не содержат остаточной мРНК каспазы-2 был проведен ПЦР-анализ. Оказалось, что в образцах тканей мышей del7 и del20 по сравнению с мышами дикого типа (wt) мРНК каспазы-2 не было обнаружено. Таким образом, можно сделать заключение, что были получены два варианта полного нокаута каспазы-2 в линии мышей FVB/N. 3. Патоморфологические характеристики были описаны для 50 мышей с генотипом del7, del20 и wt, из которых 23 мыши были дикого типа и 27 были нокаутами по каспазе-2. Согласно сделанному заключению регулярные и специфические патоморфологические изменения, характерные для органов и тканей нокаутных животных, не касающихся половой сферы, не выявлены. Однако, было показано, что яичники нокаутных по каспазе-2 самок кардинально отличаются от яичников самок wt: более половины молодых самок del7 и почти у всех молодых самок del20 отмечалась частичная или полная редукция ооцитов (иногда с сохранившимися фолликулярными структурами) с избыточным развитием (гиперплазией) желтых тел по сравнению с животными дикого типа. Таким образом, нокаутные по каспазе-2 самки не могли иметь потомство вследствие того, что их ооциты не были сформированы. Поскольку проблематика фертильности является острым медицинским и социальным вопросом необходимо далее продолжать исследования полученного нокаута и выяснить, могут ли самки выносить здоровых подсаженных эмбрионов. 4. Для исследования гибели опухолевых клеток от малых доз ДНК-повреждающих химиотерапевтических препаратов было решено проверить насколько влияет на развитие митотической катастрофы уровень белка р53, стабилизация которого зависит от каспазы-2. р53 регулирует стабильность генома и играет существенную роль в контроле гибели клеток при повреждении ДНК. Как показал анализ ядерной морфологии клеток после их обработки низкой дозой доксорубицина отсутствие р53 в клетках колоректального рака HCT116 приводило к снижению количества клеток в состоянии митотической катастрофы. Таким образом, мы определили, что белок р53 стимулирует развитие данной предстадии гибели клеток. 5. На предыдущем этапе было выяснено, что в условиях генотоксического стресса уровень накопления маркера повреждения ДНК – γН2АХ (фосфорилированной формы гистона Н2АХ) – был существенно ниже в нокаутных по каспазе-2 клетках по сравнению с клетками дикого типа. Мы предположили, что каспаза-2 может участвовать в детекции разрывов ДНК. Для дальнейшего исследования такой неапоптотической функции был проведен анализ уровня γН2АХ в нокаутных по каспазе-2 и нормальных клетках после синхронизации на разных стадиях клеточного цикла. Как показал анализ уровень γН2АХ в нокаутных по каспазе-2 клетках был снижен по сравнению с нормальными клетками после синхронизации клеток в фазе G1/S, при этом данное различие не было детектировано для клеток, синхронизированных в G2/M фазе. Это говорит о важности каспазы-2 для детекции повреждений ДНК именно в фазе синтеза. Более того, возник очевидный вопрос: если есть различие в уровне маркера повреждения ДНК между клетками дикого типа и нокаутными по каспазе-2, то возможно ли, что в этих клетках отличался непосредственно уровень повреждения ДНК после обработки доксорубицином? Для анализа уровня повреждения ДНК был использован метод ДНК-комет, который позволяет напрямую оценить уровень повреждения ДНК в клетке. Согласно данным, полученным этим методом, отличия в уровне повреждений ДНК между клетками дикого типа и нокаутными по каспазе-2 не детектировались. Таким образом, несмотря на различный уровень маркера повреждений ДНК, в клетках дикого типа и нокаутных по каспазе-2 после обработки доксорубицином уровень повреждения ДНК оставался одинаковым. Полученные данные говорят о том, что клетки нокаутные по каспазе-2 также подвержены повреждениям ДНК, как и клетки дикого типа, однако детекция повреждений ДНК в таких клетках отличается. 6. Предыдущие исследования предположили наличие связи между альтернативным сплайсингом (AS) Mcl-1 и клеточным циклом. Мы протестировали несколько повреждающих ДНК агентов на их способность повышать уровень Mcl-1S. Хотя ответ на повреждение ДНК был получен, в этих условиях не было обнаружено накопления белка Mcl-1S с мм 32 кДа или мРНК. Согласно ранее опубликованным результатам, на уровень Mcl-1L можно повлиять обработкой низкими дозами повреждающих ДНК агентов или радиации. В отличие от низких доз доксорубицина или этопозида, обработка 2-8 мкМ доксорубицина приводила к снижению уровня 40 кДа Мcl-1L, но не уровня мРНК Mcl-1, из-за деградации белка через зависимый от p53-Noxa путь или каспаза-зависимое расщепление. Тенденция к увеличению уровней мРНК и белка Mcl-1S при входе в фазу G2/M была обнаружена в неопухолевых (фибробласты легких IMR90) и раковых клетках (аденокарцинома шейки матки HeLa, карцинома яичников Caov-4, колоректальная карцинома HCT116 и немелкоклеточная карцинома легкого U1810). Мы проверили способность Mcl-1S интернализоваться в ядра. Показано, что эндогенный Mcl-1S, а также Mcl-1S, экспрессируемый плазмидой, оказываются в ядерных фракциях, демонстрируя способность белка проникать в ядро. Более того, ядерное накопление было обнаружено после выхода из блока клеточного цикла, что может указывать на важность Mcl-1S для ядерных функций. Чтобы изучить возможность клинического применения ингибитора Mcl-1L, мы протестировали BH3-миметик S63845 в аналогичных экспериментальных условиях. Связывание S63845 приводит к стабилизации Mcl-1L, поэтому накопление Mcl-1L служит индикатором ингибирующего действия S63845. Показана безопасность S63845 в контексте событий клеточного цикла. Этот BH3-миметик, как было показано, не влиял на развитие клеточного цикла в вышеуказанных экспериментах, также не влиял на накопление повреждений ДНК. Полученные результаты демонстрируют, что увеличение Mcl-1S приводит к накоплению повреждений ДНК, тогда как ингибирование Mcl-1 способствует либо небольшому увеличению повреждений ДНК (нокдаун siRNA), либо вообще отсутствию изменений (химическое ингибирование 300 нМ S63845). Дополнительные исследования: Так как процесс размножения животных занимает достаточно много времени, а число нокаутных мышей незначительно, в дополнениe к планируемым по гранту исследованиям мы решили выполнить интересные нам исследования, результаты которых обобщены ниже. 1. BNIP3 – белок семейства Bcl-2, участвующий в регуляции различных видов клеточной гибели, включая апоптоз и аутофагию. Однако его роль в этих процессах остается до конца не выясненной, и варьирует в зависимости от типа раковых клеток и факторов среды (рН, уровень О2 и т.д.). Нами созданы линии клеток А549 и Н23, в которых экспрессия BNIP3 была выключена с использованием методики CRISPR/Cas9. BNIP3 на 56% гомологичен другому представителю семейства Bcl-2 – BNIP3L/NIX. Применяемые нами методы нокаута и нокдауна BNIP3 не приводили к изменению в уровне BNIP3L/NIX, что позволило изучать вклад BNIP3 на процессы клеточной гибели. Мы предположили, что подавление экспрессии BNIP3 ослабит процесс митофагии, что приведет к появлению дефектных органелл, неспособных адекватно обеспечивать энергией клетку. Выяснилось, что нокаут BNIP3 приводил к угнетению как базального, так и максимально возможного дыхания. Снижение потребления кислорода клетками после нокаута BNIP3 обусловлено не снижением содержания митохондрий в клетке, а угнетением митофагии. Далее мы показали, что выход цитохрома с из митохондрий в клетках с нокаутом и нокдауном по BNIP3 был более выражен, чем в контрольных клетках. Это привело к стимуляции каспазного каскада и активации эффекторной каспазы-3, ответственной за появление биохимических и морфологических признаков апоптоза. Более того, оценка содержания митохондриальных активных форм кислорода (мтАФК) с помощью метода проточной цитометрии показала, что в клетках A549 KoBNIP3 их уровень после индукции апоптоза цисплатином был практически в два раза выше по сравнению с клетками дикого типа. Представленные данные указывают на то, что BNIP3 участвуя в контроле качества митохондрий, способен оказывать влияние на митохондриальный путь гибели клеток. 2. Различные типы программируемой гибели клеток (ПГК) используют определенное число общих молекул для инициации, сигнализации и исполнения программы. Как осуществляется такая координация, в значительной степени не изучено. Мы собрали информацию о механизмах ПГК и представили ее в структурированном и машиночитаемом виде. Полная карта ПГК охватывает фазы инициации, сигнальную фазу, во время которой выбирается режим гибели клетки, а также финальную и фатальную фазу выполнения процесса. Одно из очевидных применений карт ПГК – идентификация сетевой сигнатуры заболеваний в отношении статуса механизмов гибели клеток. Как мы показали на некоторых примерах приложений, интеграция и анализ данных в контексте карты дает представление не только о дерегулируемых процессах ПГК в исследуемом типе заболевания, но и указывает на наиболее активных участников, которые могут быть в будущем являться терапевтической мишенью. Второй способ использования разработанной нами карты ПГК моделирует переключение между различными типами гибели клеток. В зависимости от подхода к моделированию может использоваться полная или упрощенная схема сети ПГК. Данное исследование опубликовано в журнале Cancers. В течение второго года нами планировалось опубликовать три статьи в научных журналах. В результате исследования мы опубликовали 7 статей, из них 4 в журнале Биохимия и три в журналах, входящих в Q1: Frontiers Cell Dev. Biol. (I.F.=5.2), Cancers (I.F.=6.2), Intern. Rev. Cell Mol. Biol. (I.F.= 3.8). По материалам проекта сделано 9 докладов на международных и национальных конференциях. За публикации, поддержанные настоящим грантом 2 участника проекта были признаны лауреатами Конкурса МГУ в номинации «Выдающиеся статьи».

 

Публикации

1. - Ученые показали, каким образом взаимодействуют отдельные формы клеточного «самопоедания» Indicator.ru, 29.02.2020 (год публикации - ).

2. - Ученые показали, каким образом взаимодействуют отдельные формы клеточного «самопоедания» РНФ, 29.02.2020 (год публикации - ).

3. - Ученые показали, каким образом взаимодействуют формы клеточного «самопоедания» Gazeta.ru, 26.02.2020 (год публикации - ).

4. - Предписано погибнуть. Опухолевую клетку толкают к самоубийству Poisknews.ru, 2.10.2020 (год публикации - ).

5. - Исследователи нашли безопасную альтернативу естественному «врагу» онкогенного белка Indicator.ru, 25.10.2020 (год публикации - ).

6. - Исследователи нашли безопасную альтернативу естественному «врагу» онкогенного белка РНФ, 11.11.2020 (год публикации - ).

7. - Исследователи нашли безопасную альтернативу естественному «врагу» онкогенного белка yandex.ru, 25.10.2020 (год публикации - ).

8. - Исследователи нашли безопасную альтернативу естественному «врагу» онкогенного белка Об этом сообщает "Рамблер". Далее: https://news.rambler.ru/scitech/45092208/?utm_content=news_media&utm_medium=read_more&utm_source=copylink Rambler.ru, 25.10.2020 (год публикации - ).

9. Горбунова, А.С., Денисенко, Т.В., Япрынцева, М.А., Пивнюк, А.Д., Приказчикова, Т.А., Гогвадзе, В.Г., Животовский, Б. Д. BNIP3 как регулятор цисплатин-индуцированного апоптоза Биохимия, 85(10), 1464 – 1473 (год публикации - 2020).

10. Животовский Б. Программируемая гибель клеток: исторические заметки из России Биохимия, 85(10), 1323 – 1330 (год публикации - 2020).

11. Замараев, А.В., Животовский, Б.Д., Копеина, Г.С. Вирусные инфекции: негативный регулятор апоптоза и фактор онкогенности Биохимия, 85(10), 1398-1410 (год публикации - 2020).

12. Первушин Н.В., Сеничкин В.В., Животовский Б., Копеина Г.С. Mcl-1 as a “barrier” in cancer treatment: can we target it now? Intern. Rev. Cell Mol. Biol., 351, 23-55 (год публикации - 2020).

13. Первушин, Н.В., Сеничкин, В.В., Капуста, А.А., Горбунова, А.С., Каминский, В.О., Животовский, Б., Копеина, Г.С. Деградация Mcl-1 в условиях недостатка питательных веществ происходит независимо от аутофагии Биохимия, 85(10), 1452-1463 (год публикации - 2020).

14. Равель Ж.М., Монрац Гомеш Л.С., Сомпайрак Н, Калцоне Л, Животовский Б, Кремер Г, Бариллот Э, Зиновьев А, Куперштейн И, Comprehensive map of the regulated cell death signaling network: A powerful analytical tool for studying diseases Cancers, 12 (4), 990 (год публикации - 2020).

15. Стрелецкая, А.Ю., Сеничкин, В.В., Приказчикова, Т.А., Зацепин, Т.С., Животовский, Б., Копеина, Г.С. Upregulation of Mcl-1S causes cell-cycle perturbations and DNA damage accumulation Frontiers Cell Dev. Biol, 8, 543066 (год публикации - 2020).


Аннотация результатов, полученных в 2021 году
За отчетный период был проведен анализ представленности функциональных групп белков в различных подотрядах грызунов Sciuromorpha, Hystricomorpha, Castorimorpha, Myomorpha с целью идентификации уникальных молекулярно-клеточных путей, характерных для представителей грызунов с высокой продолжительностью жизни. В ходе анализа было выявлено, что для представителей подотрядов Sciuromorpha, Hystricomorpha, Castorimorpha, которые характеризуются большей продолжительностью жизни, характерно наличие ряда белков группы хемокинового-цитокинового пути и белков бета-дефенсинов, которые участвуют в регуляции и миграции иммунных клеток, а также противомикробной защите. На основании данных полученных за предыдущий отчетный период и текущих результатов была описана модель, демонстрирующая существенные изменения иммунной системы грызунов в подотрядах Sciuromorpha, Hystricomorpha, Castorimorpha. Для анализа функций каспазы-2 на уровне организма мы создали 2 линии мышей нокаутных по гену данного белка с помощью метода CRISPR/Cas9. Исследование полученных линий дало совершенно неожиданный результат. Мы показали, что нокаутные самки не способны дать потомство при скрещивании с любым вариантом генотипа самца – диким типом, гетерозиготой или нокаутом. При этом нокаутные самцы имеют возможность продуцировать потомство, как с самками дикого типа, так и гетерозиготными особями. Данное фенотипическое проявление можно было объяснить каспаза-2 зависимым развитием половой системы самок. Анализ скрещивания всех возможных пар от WTxWT до KO-casp2xKO-casp2 (WT -дикий тип мышей, KO-casp2 – любая из двух нокаутных линий) показал, что расщепление генотипов происходит согласно классическим законам наследования, описанного Менделем. Анализ массы тела и отдельных органов с целью выявления разницы в фенотипе показал, что кроме висцерального жира у самок нет статистических различий в массе органов между животными с нокаутом по сравнению с диким типом. Это говорило о том, что при нокауте каспазы-2 могли произойти сдвиги метаболического гомеостаза. Анализ сперматозоидов и семенников самцов продемонстрировал, что ни морфология семенника, ни качество спермы не отличаются у нокаутных животных от дикого типа. Анализ органов и гормонов половой системы показал, что только животные с делецией 20 нуклеотидов обладают каким-то отличием от животных дикого типа – самцы характеризовались повышенным содержанием тестостерона, а самки увеличенной массой матки и яичников. Данное отличие могло быть вызвано индивидуальными изменениями линии мышей вследствие редактирования генома с помощью системы CRISPR/Cas9. Анализ полового цикла самок показал, что часть нокаутных животных в течение ненормально долгого времени находятся в одной фазе цикла, по сравнению с животными дикого типа. При этом двигательная активность самок – показатель, коррелирующий с циклированием – изменялась в зависимости от времени суток. Выяснилось, что нокаутные самки менее активны днем, чем животные дикого типа. Это говорило о возможной разбалансировке гормонов. Анализ прогестерона и эстрадиола, отметил только тенденцию к увеличению продукции эстрадиола и снижению прогестерона, но это изменение не было статистически значимым. Мы провели исследование, могут ли изучаемые животные выносить беременность после подсадки нокаутным мышам здоровых эмбрионов. Результаты этих экспериментов показали, что более половины нокаутных мышей del7/del7 и все мыши del20/del20 не способны выносить беременность. Таким образом, бесплодие самок с нокаутом по каспазе-2 было вызвано не только изменениями яичника, но и невозможностью выносить беременность. Анализ половой системы самцов показал, что нокаутные животные не обладают какими-то выраженными отличиями в морфологии семенников или качестве спермы. Необходимо отметить, что при этом нокаутные самки характеризовались сильными морфологическими изменениями яичника – в возрасте 2-3 месяцев они характеризовались гиперплазией желтых тел и сокращением или практически полным отсутствием ооцитов в фолликулах. Вследствие этого скрещиваемые нокаутные самцы могут иметь потомство в отличии от самок. Таким образом, можно сделать вывод, что каспаза-2 выполняет очень важную и специфичную функцию в организме, обеспечивая правильное функционирование половой системы самок. Помимо работы с животными мы провели анализ формирования митотической катастрофы и ее исхода в зависимости от наличия белка р53 – одного из главных защитников целостности генома. Каспаза-2 является регулятором стабильности р53, т.к. может расщеплять негативный регулятор этого белка – убиквитинлигазу MDM2. Митотическая катастрофа является онкосупрессорным механизмом и характеризуется формированием мульти- или микроядер в клетке после повреждений ДНК в фазе G2/M цикла. Дальнейшая судьба этих клеток зависит от баланса ряда белков, в том числе, как мы предположили, и наличия р53. В отдельных экспериментах мы показали, что обработка клеток рака кишечника НСТ116 низкими дозами доксорубицина приводит к накоплению клеток в состоянии митотической катастрофы, а отсутствие р53 снижает это накопление. Более того, в условиях формирования митотической катастрофы отсутствие р53 ведет к стимуляции аутофагии, которая нередко способствует выживанию клеток в условиях стресса. Таким образом, с большой вероятностью можно пердположить, что р53 регулирует процессы формирования митотической катастрофы и сопровождающей ее аутофагии, что определяет исход митотической катастрофы – гибель опухолевой клетки или ее выживание. В течении отчетного периода мы продолжили исследование эффекта подавления активности антиапоптотического белка Mcl-1 сцелью выяснения использования BH3 миметиков в терапии солидных новообразований. Нами впервые было показано, что белки Bak и Bcl-xL способны регулировать чувствительность опухолевых клеток к ингибиторам Mcl-1. Мы также впервые обнаружили, что S63845 вызывал индукцию апоптоза более эффективно, чем другой ингибитор Mcl-1 - A1210477 через Bak-зависимый механизм. Далее мы продемонстрировали, что чувствительность раковых клеток коррелирует с низкой экспрессией белка Bcl-xL. Более того, приобретенная резистентность к ингибированию Mcl-1 может быть связана с увеличенной экспрессией белка Bcl-xL. Кроме того, низкие уровни Bcl-xL и высокие уровни Bak как мРНК, так и белков наблюдались в опухолевых тканях полученных от пациентов с аденокарциномой легких. В целом, наши результаты показали важную роль белков Bak и Bcl-xL в регуляции чувствительности и устойчивости опухолевых клеток к ингибированию Mcl-1. В результате проведенных исследований нами в течение 2021 года опубликованы 1 статья в отечественном и 7 статей в международных журналах, из которых 6 в журналах, относящихся к Q1. Кроме того сделано 5 приглашенных докладов на конферецниях, проводимых в России. За публикации, поддержанные настоящим грантом 4 участника проекта были признаны лауреатами Конкурса МГУ в номинации «Выдающиеся статьи». Один участник (Замараев А.В.) за выполнение исследований, входящих в данный проект, награжден Золотой Медалью РАН с премией для молодых ученых России.

 

Публикации

1. - Здесь или там? Поиск, №30-31, 30.07.2021 (год публикации - ).

2. В.В.Сеничкин, Н.В. Первушин, А.В.Замараев, Е.В.Сазонова, А.П.Зуев, А.Ю.Стрелецкая, Т.А. Приказчикова, Т.С. Зацепин, О.В. Ковалева, Е.М.Чевкина, Б. Животовский, Г.С. Копеина Bak and Bcl-xL participate in regulating sensitivity of solid tumor derived cell lines to Mcl-1 inhibitors Cancers, - (год публикации - 2021).

3. Горбунова АС, Копеина ГС, Животовский Б. A Balance Between Autophagy and Other Cell Death Modalities in Cancer Methods in Molecular Biology, IV, 392 (год публикации - 2021).

4. Горбунова АС, Япрынцева МА, Денисенко ТВ, Животовский Б. BNIP3 in Lung Cancer: To Kill or Rescue? Cancers, 12, 3390 (год публикации - 2020).

5. Денисенко Т.В., Гогвадзе В, Животовский Б. Mitophagy in carcinogenesis and cancer treatment Discover Oncology, - (год публикации - 2021).

6. Денисенко ТВ, Горбунова АС, Животовский Б. Mitochondrial involvement in migration, invasion and metastasis Frontiers in Cell and Developmental Biology., 7, 355 (год публикации - 2020).

7. Дхани С, Жао Ю, Животовский Б. A long way to go: caspase inhibitors in clinical use Cell Death & Diseases, 12, 949 (год публикации - 2021).

8. Животовский Б Методы редактирования генома: от дрожжей до клеток человека Гены и клетки, XVI, 1 (год публикации - 2021).

9. Замараев АВ, Волик ПИ, Сухих ГТ, Копеина ГС, Животовский Б. Long non-coding RNAs: A view to kill ovarian cancer BBA - Reviews on Cancer, 1876, 188584 (год публикации - 2021).


Возможность практического использования результатов
Полученные данные (отсутствие потомства у каспаза-2-дефицитных самок) могут быть использованы как основа при разработке тестов, связанных с патологией репродукции. Данные о митотической катастрофе и таргетировании Mcl-1 могут быть использованы при поиске новых подходов в лечении онкологических заболеваний.