Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Проект направлен на создание многоуровневых наноконструкций-транспортеров (МУНК) на основе нековалентных ассоциатов siRNA с наночастицами золота (НЧЗ), и рН-зависимого липоплекса mRNA, а также на исследование активности полученных конструкций на культурах клеток в 2D- и 3D-системах культивирования (монослой и сфероиды). Исследования по проекту было разделено на три условных блока: i) изучение взаимодействия модифицированных siRNA c НЧЗ и сборка на их основе МУНК; ii) создание МУНК на основе рН-зависимого липоплекса mRNA; iii) получение и изучение свойств 3D-культуры (сфероиды). В первый год выполнения проекта (блок 1) были выбраны модификации, направленные на повышение устойчивости модельной siРНК к действию внутриклеточных нуклеаз. Модификации вводили по 2’-положению остатка рибозы и по фосфодиэфирной связи, которые вовлечены в процесс расщепления РНК нуклеазами. В качестве модификаций рибозного остова была выбрана замена 2’-OH группы на 2’-OMe и 2’-F, а для фосфодиэфирной связи была выбрана фосфорилгуанидиновая группа (ФГ) - оригинальная разработка ИХБФМ. Были определены РНКаза А чувствительные сайты для каждой цепи модельной siРНК. По РНКаза А-чувствительному сайту вводили одну из модификаций по 2’-положению остатка рибозы с и без ФГ в составе межнуклеотидного фосфата. Получена библиотека модифицированных цепей siРНК, полученные олигорибонуклеотиды были очищены и охарактеризованы методом задержки в полиакриламидном геле. На основе библиотеки модифицированных цепей была получена библиотека модифицированных siРНК. Эффективность формирования siРНК (дуплексов), содержащей исходные и/или модифицированные сенс- и антисенс-цепи, проанализирована методом термической денатурации. Получены кривые термической денатурации и термодинамические параметры для всех 25 вариантов siРНК. Показано, что введение ФГ-модификации по межнуклеотидному фосфату приводит к снижению температуры плавления дуплекса на 2 оС, несмотря на стабилизирующий эффект 2´-ОМе и 2´-F. Изучение стабильности синтезированных siRNA при воздействии РНКазы А показало, что сенс-цепь имеет наибольшую стабильность при наличии 2’-F и 2’-F/ФГ модификаций, вне зависимости от типа модификации антисенс-цепи. Биологический эффект был изучен для вариантов дуплексов, состоящих из модифицированной сенс-цепи и немодифицированной антисенс. Культура клеток HEK Phoenix, стабильно экспрессирующих белок GFP, была трансфицирована данными вариантами siRNA с помощью Lipofectamine 3000. По данным проточной цитофлуорометрии биологическая активность siRNA, несущих модификации, сохраняется. Т.о., показана возможность использования комбинаций 2´-ОМе или 2´-F защитных групп с ФГ-защитой siRNA без потери её функциональной активности. Параллельно велась работа по изучению взаимодействия модифицированных siРНК с НЧЗ. Были получены ассоциаты НЧЗ с siРНК для всех 25 вариантов siRNA. Все варианты НЧЗ-siRNA были стабильны в условиях гель-электрофореза. Показано что наличие модификаций в составе siРНК приводит к достоверному снижению электрофоретической подвижности ассоциата по сравнению с ассоциатом, содержащим немодифицированную siRNA. Поверхностная плотность siRNA-покрытия НЧЗ (число молекул siRNA на 1 НЧЗ), для модифицированных siRNA (43+4) была меньше чем для нативного дуплекса (49+2). Также было показано, что ассоциаты, несущие модифицированные siРНК имеют больший гидродинамический диаметр. Данные изменения были общими для всех ассоциатов, несущих модифицированную siРНК. Полученные ассоциаты сохраняли физико-химические свойства в течение 3-х месяцев хранения при +4оС. Была изучена устойчивость ассоциатов НЧЗ с модифицированными siРНК, к нуклеазам бактериального «цитозоля». Результаты исследования: модификация siRNA и их сорбция на поверхности НЧЗ обеспечили «защиту» около 70% всех дуплексов от нуклеаз цитозоля в течение 4 ч. Из полученных данных следует, что введение модификаций в siРНК не приводит к выраженным изменениям физико-химических свойств ассоциатов, полученных на их основе. Т. о. siРНК, несущие 2’-OMe или 2’-F, и ФГ модификации, могут быть использованы для создания ассоциатов НЧЗ-siРНК, которые в дальнейшем послужат ядром для сборки МУНК. Для второго блока получена in vitro T7-транскрипцией информационная РНК (иРНК), кодирующая GFP и содержащая следующие элементы: 5’-кэп, 3’- и 5’-UTR, а также поли-А хвост. В качестве 5’-кэпа было использовано 2 аналога ARCA (Anti Reverse Cap Analog, 3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G) и CleanCap®Reagent AG (m7(3'OMeG)(5')ppp(5')(2'OMeA)pG, ССR AG). Для каждого варианта иРНК была оценена эффективность трансляции GFP на культуре клеток. Обе иРНК позволяют нарабатывать белок, однако для варианта иРНК, несущего 5’-кэп на основе CleanCap®Reagent AG эффективность трансляции несколько выше. На основе полученных иРНК и синтезированных рН-чувствительных липидов ТОМ (N2,N4,N6-триолеил-1,3,5-триазин-2,4,6-триамин) и DOME2 (N2-дигидроксиэтил-N4-додецил-N6-олеил-1,3,5-триазин-2,4,6-триамин) проводили оптимизацию сборки липоплекса. Был подобран оптимальный состав липидных ядер - фосфатидилхолин/DOME2/TOM в соотношении 1:1:2, а также технология производства липидных ядер – ультразвуковая обработка гидратированной тонкой липидной пленки с последующей экструзией. Полученные липидные частицы были охарактеризованы методом динамического светорассеяния (ДСР) и просвечивающей электронной микроскопией (ПЭМ). По данным ДСР, частицы имели размер 124,3±16,3 нм и PDI 0,233±0,021. ПЭМ-анализ показал, что основную долю суспензии составляют частицы размером до 100 нм, имеющие неровные контуры, также наблюдались частицы чашеобразной формы. Далее была оптимизирована загрузка иРНК, для чего варьировали соотношение количества липидных частиц и иРНК. Оптимальное соотношение 10 мкл суспензии частиц (суммарная концентрация молекул липида составляла 3,6 μМ) и 400 нг иРНК. Липоплексы также были охарактеризованы методом динамического ДСР и ПЭМ. Добавление иРНК приводит к росту размера частиц, размер изменился с 124,3±16,3 нм до 341,9±37,5 нм, а также к изменениям их морфологии: частицы в ПЭМ выглядели плотными, во многих просматривались «нити» и более толстые «жгуты». Чашеобразные частицы встречались редко. Таким образом, взаимодействие липидных частиц с иРНК приводит к их компактизации и структурированию. Таким образом, запланированный результат по данному блоку проекта достигнут: получены охарактеризованные набор рН-зависимых липидов и липоплекс иRNA, который может быть использован в дальнейших по плану экспериментах. В течение первого года проекта нами была разработана экспериментальная модель сфероидов на основе культуры клеток HepG2. Определена оптимальная «посевная» доза, выбран период проведения экспериментальных воздействий, определены параметры контроля роста сфероидов и учета эффектов воздействий.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Создание многоуровневых наноконструкций (МУНК) на основе кора (наночастица золота, НЧЗ, несущая siРНК) для доставки в клетку терапевтических нуклеиновых кислот (НК) является одной из главных целей проекта. В течение первого года проекта мы синтезировали 25 вариантов химически модифицированных siРНК, среди которых нужно выбрать наиболее эффективно подавляющие синтез целевого белка GFP в клетках. Эффективность подавления зависит от целого ряда параметров, одним из которых является устойчивость siРНК к действию внутриклеточных нуклеаз, способных быстро уничтожить её при выходе в цитозоль клетки из состава МУНК. Мы исследовали устойчивость модифицированных siРНК к клеточным нуклеазам на модели РНКазы А. Установлено, что устойчивость siРНК зависела от типа модификаций, их комбинации и положения в дуплексе. Наибольшей устойчивостью обладали siРНК, несущие одновременно 2’-F (2’-фтор) или 2’-OMe (2’-метокси) защитные группы в сочетании с фосфорилгуанидиновой (ФГ) защитой межнуклеотидного фосфата. По итогам исследования siРНК выбрано 8 наиболее устойчивых к действию РНКазы А дуплексов. Отбор дуплексов для создания МУНК проводили по результатам оценки влияния введенных защитных групп на эффективность siРНК, для чего определили биологическую активность всех siРНК из синтезированной библиотеки. Для каждого дуплекса siРНК было проведено по три эксперимента на культуре клеток SC-1 R780, стабильно экспрессирующих GFP. Наличие ФГ-группы в антисенс-цепи приводило к потере активности siРНК, такие дуплексы практически не влияли на экспрессию GFP. В то же время, наличие ФГ модификаций на сенс-цепи не снижало активности siРНК. Эффективно подавляющими экспрессию GFP siРНК оказались 4 дуплекса без ФГ-группы и 3 дуплекса с ФГ-защитой на пассажирской цепи siРНК. Сопоставляя результаты по устойчивости к РНКазе А и эффективности подавления экспрессии GFP, выделили две siРНК. Еще одним параметром, влияющим на эффективность доставленной siРНК в клетке является её связывание с НЧЗ. Изучали взаимодействие с НЧЗ всех 25 вариантов модифицированных вариантов siРНК, содержащих на 5’-конце антис-цепи радиоактивную метку. Обнаружено, что число сорбированных молекул siРНК в пересчете на одну НЧЗ зависит от модификации siРНК. siРНК, содержащие нативную антисенс-цепь либо 2`-F-модифицированную, сорбировались на НЧЗ хуже всего (от 11±5 до 30±7 siРНК-НЧЗ). Лучше всего связывались с НЧЗ дуплексы, в состав которых входили антисенс–цепи с 2`-OMe-модификацией или с ФГ-звеньями, покрытие достигало 66±5 siРНК-НЧЗ. Определена степень деградации антисенс-цепи siРНК в составе кора НЧЗ-siРНК, в присутствии эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, содержащей нуклеазы и другие соединения, дестабилизирующие siРНК в составе кора. Степень деградации siРНК варьировала от 10 до 44 %, в зависимости от типа модификации в её составе. Результаты показали, что дуплексы, содержащие сенс-цепь siРНК с 2`-OMe- и ФГ- модификациями, подвержены деградации в наименьшей степени, что соответствует результатам исследования устойчивости siРНК к РНКазе А. Эффективность доставленной в клетку-мишень siРНК, несомненно, зависит от величины нагрузки НЧЗ дуплексами siРНК, от их устойчивости к деградации нуклеазами и биологической активности. Для отбора наиболее эффективных вариантов дуплексов мы проанализировали все приведенные выше данные. В качестве эффективной нагрузки siРНК на НЧЗ приняли значение равное или больше 70% от максимально возможной емкости. Также из списка были удалены дуплексы, содержащие антисенс-цепь с ФГ-звеньями, так как такие дуплексы не обладают биологической активность. Учитывая весь комплекс результатов, для дальнейших исследований и создания МУНК были отобраны три варианта модифицированных siРНК. Блок 2. В соответствии с планом работ, мы получили МУНК на основе кора НЧЗ-siРНК путем их «одевания» липидной оболочкой, допированной амфифильным пептидом(и) по ранее разработанной нами методике [doi.org/10.3390/ijms19072096]. Химический состав липидной оболочки МУНК: PC/DOPE/DOME2 (4,5:4,5:1), где РС – яичный фосфатидилхолин, DOPE – диолеилфосфатидилэтаноламин, DOME2 - N2-дигидроксиэтил-N4-додецил-N6-олеил-1,3,5-триазин-2,4,6-триамин. Однако, получаемый препарат содержал как «полные» МУНК (полностью покрытый липидной оболочкой кор), так и «голые» коры, и «пустые» липидные частицы. Для улучшения «качества» препарата и повышения эффективности его биологического эффекта, была проведена оптимизация методики сборки МУНК. Качество получаемых частиц оценивали с помощью методов динамического светорассеяния и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). В ходе оптимизации варьировали условия сборки на этапах получения (i) коров, (ii) липидной пленки и (iii) МУНК. Оптимизация была проведена по следующим параметрам получения МУНК: - концентрация и химический состав буферного раствора; - условия получения липидной пленки; - очистка препаратов МУНК. В результате оптимизации приготовления МУНК, получали до 43% полностью «запечатанных» в липидную пленку коров, препарат имел следующие характеристики: гидродинамический размер (Dh =111±5 нм), индекс полидисперсности (PdI=0,186 ± 0,012). Блок 4. Для отработки методики инкубации сфероидов HepG2 с МУНКами проведен модельный эксперимент по их инкубации с НЧЗ (12,0 + 0,1 нм). Оказалось, что клетки HepG2 (в монослое) не поглощают НЧЗ. Для изучения этого феномена мы взяли еще одну эпителиоидную линию - НЕК293 (клетки почки эмбриона человека). Линия HepG2 в монослое сохраняла органоспецифические признаки, тогда как клетки линии НЕК293 не несли признаков формирования эпителиального пласта. Клетки НЕК293 активно поглощали НЧЗ посредством клатрин-зависимого эндоцитоза и макропиноцитоза. Клетки обеих линий активно поглощали НЧЗ, покрытыми полиэтиленимином (НЧЗ-ПЭИ) и бычьим сывороточным альбумином (НЧЗ-БСА) при инкубации в монослое. Морфологию сфероидов изучали с помощью комплекса светооптических методов, ПЭМ и сканирующей ЭМ, что позволило получить ряд новых данных об их пространственной организации. Для целей проекта важно: сфероиды клеток HepG2 и НЕК293 существенно различаются по организации клеток в 3Д-структуру, однако с питательной средой и, соответственно с вносимыми в нее веществами взаимодействует внешняя поверхность сфероидов, образованная базальными отделами клеток. Этот факт важен для оценки взаимодействия клеток сфероидов с исследуемыми веществами. Сфероиды клеток HepG2 и НЕК293 не имеют «оболочки», состоящей из слоя (слоев) клеток, их поверхность не сплошная, между клетками располагаются щели разного размера (пространства между латеральными поверхностями клеток). В целом, пространственная организация сфероидов определяется природой клеток. Исследовали взаимодействие НЧЗ, НЧЗ-БСА и НЧЗ-ПЭИ с клетками сфероидов HepG2 и НЕК293. Установили, что НЧЗ не проникает в клетки HepG2 сфероидов. Одновременно с этим, клетки сфероидов HepG2 активно поглощали НЧЗ-БСА и НЧЗ-ПЭИ. Таким образом, необычная избирательность клеток HepG2 по отношению к НЧЗ, обнаруженная в монослое, сохранялась в сфероидах, а клетки НЕК293 разные варианты НЧ «не различали». Глубина проникновения НЧ в сфероиды не превышала 35 – 40 мкм. Для изучения эффекта siРНК необходимы клетки, стабильно экспрессирующие белок GFP. Мы использовали линию фибробластов SC-1 R780, клетки которой стабильно экспрессируют белок GFP и при посеве на низкоадгезивное покрытие формируют сфероиды (планшеты Corning® spheroid microplates 96 well, black/clear bottom round, ULA (Ultra-Low Attachment surface), питательная среда IMDM. Сфероиды клеток SC-1 R780 собирались в сферическую компактную структуру уже через сутки и сохраняли эту форму по мере культивирования. В сфероидах клетки лежали хаотично, внешняя поверхность сфероидов формировалась распластанными клетками. По совокупности данных о динамике роста и морфологии сфероидов клеток SC-1 R780 были выбраны условия культивирования сфероидов для дальнейшей работы. Проникновение МУНК в клетки SC-1 R780 в монослое и в сфероидах изучали с помощью ПЭМ в разные сроки инкубации (15 мин – 4 ч), суспензии МУНК имели концентрацию 10^-9 мМ (по золоту). На ультратонких срезах МУНК выявляются благодаря хорошо видимым НЧЗ, которые являются индикатором МУНК. Проникновение МУНК в клетки SC-1 R780 происходило путем микроэндоцитоза как при монослойном культивировании, так и в сфероидах. Глубина проникновения МУНК в сфероид составляла не более 30 мкм. Характер взаимодействия МУНК с клетками SC-1 R780 не различался при культивировании клеток в монослое и в форме сфероида. Блок 5. Одной из задач проекта является создание МУНК на основе липидного кора (липоплекса, несущего иРНК), покрытого липидной оболочкой. Синтез и-РНК, включающей целевую последовательность белка GFP и обеспечивающей достаточный уровень его экспрессии, является самостоятельной многокомпонентной задачей. В течение второго года проекта была продолжена работа по конструированию иРНК с использованием одного из способов или их комбинации: (i) увеличения длины поли (А)-хвоста (на данный момент в конструкции он представлен 15-ю остатками аденина); (ii) замены имеющихся 5’- и 3’-НТО на 5’- и 3’-НТО более стабильных иРНК; (iii) введения, в дополнение к 5’-кэп, участка внутренней посадки рибосом (IRES). В ходе конструирования иРНК разработана схема сборки ДНК-матрицы для in vitro T7-транскрипции. Синтезированная ДНК-матрица содержала: (i) 5’-нетранслируемую область (НТО) с искусственным участком внутренней посадки рибосом KMI; (ii) консенсусную последовательность Козак; (iii) последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок; (iv) вирусный 3’-НТО; и (v) удлиненный поли(А)-хвост (35 остатков аденина). Оптимизирована in vitro T7-транскрипция и получена целевая иРНК, обеспечивающая синтез белка GFP. Липидный кор, несущий длинную молекулу иРНК, должен быть, как минимум, достаточно жестким, чтобы быть «одетым» липидной оболочкой, а также не сливаться с ней. Был проведен дизайн и сконструирована модель липоплекса на основе тридодецил-содержащих олигонуклеотидов. Липофильные конъюгаты олигонуклеотидов формировали частицы размером от 32,67±9,07 до 169,63±96,40 нм, индекс полидисперсности не превышал 0,25. В ПЭМ частицы имели округлую форму и размер около 30 нм, их поверхность была структурирована. Полученные частицы взаимодействовали с альбумином, что меняло их структуру. Показано проникновение частиц в клетки и снижение эффективности трансфекции в присутствии альбумина, также способность белков сыворотки нивелировать эффект альбумина. Полученные результаты показывают, что данная стратегия может быть использована для получения липидного кора (липоплекса, несущего целевую иРНК). Публикации в 2020 Г.: Chelobanov B., Poletaeva Ju., Epanchintseva A., Tupitsyna A., Pyshnaya I., Ryabchikova E. Ultrastructural Features of Gold Nanoparticles Interaction with HepG2 and HEK293 Cells in Monolayer and Spheroids. Nanomaterials 2020, 10, 2040; doi: 10.3390/nano10102040 Pavlova A.S., Dovydenko I.S., Kupryushkin M.S., Grigor’eva A.E., Pyshnaya I.A., Pyshnyi D.V. Amphiphilic “Like-A-Brush” Oligonucleotide Conjugates with Three Dodecyl Chains: Self-Assembly Features of Novel Scaffold Compounds for Nucleic Acids Delivery. Nanomaterials 2020, 10, 1948; doi:10.3390/nano10101948

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
МУНК – разработанная и созданная нами многоуровневая наноконструкция на основе сферических наночастиц золота (НЧЗ, AuNPs), образующих, вместе с нековалентно адсорбированным слоем молекул siRNA, ядро (кор), который окружен липидной оболочкой, допированной пептидом Str-(LR)4G. При всем многообразии транспортеров siРНК на основе НЧЗ [doi: 10.1039/c8tb02484g], разработанная нами конструкция уникальна, прежде всего, нековалентной сорбцией siРНК на поверхность НЧЗ. В третий год проекта была реализована заключительная стадия разработки метода создания МУНК – очистка и концентрирование их препаратов. Мы проверили эффективность доставки siРНК препаратом МУНК, очищенным с использованием фракционирования в глицерине, отработанного ранее. Оказалось, что глицерин токсичен для клеток даже в низких концентрациях, при концентрации глицерина 2,25 % (соответствует расчетной концентрации при добавлении препарата МУНК к культуре клеток); в культуре выявляется лишь около 20 % жизнеспособных клеток. Глицерин был заменен на 58 % раствор сахарозы в качестве вязкой среды для очистки и концентрирования МУНК. Все препараты, получаемые в ходе исследований, анализировали методами динамического светорассеяния (ДСР) и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Было подобрано оптимальное время центрифугирования МУНК в 58 % растворе сахарозы, обеспечившее сохранность целевых МУНК и их максимальное содержание. Методика была многократно воспроизведена при подготовке препаратов для исследований на культурах клеток. Оптимальные условия получения препаратов МУНК наилучшего качества: - присутствие 0,1 мМ MgSO4 и 5 мМ NaCl при сборке коров; - получение липидной пленки при 12 мм.рт.ст. без термостатирования; - сборка МУНК в 1 мМ РВ. - 15-минутное центрифугирование при 2000 g в 58% сахарозе; Результат: препарат, содержащий 40% целевых МУНК, что вдвое превышает их содержание в препаратах, полученных по исходной методике. Подробно методика получения МУНК опубликована в статье: Epanchintseva A.V. et al. A Lipid- Coated Nanoconstruct Composed of Gold Nanoparticles Noncovalently Coated with Small Interfering RNA: Preparation, Purification and Characterization. Nanomaterials. 2021; 11(11):2775. Разработанная нами конструкция МУНК показала свою эффективность как доставщика siРНК в клетки, растущие в монослое и в виде сфероидов. Входящие в её состав коры на основе НЧЗ могут служит аналогом для получения коров наночастиц других металлов для доставки терапевтических нуклеиновых кислот. Наш опыт создания и оптимизации процесса получения МУНК показывает, что значение имеет каждый фактор эксперимента, поэтому мы настоятельно рекомендуем контролировать КАЖДУЮ стадию работы, КАЖДОЕ вносимое изменение. Мы оценивали по финальному препарату МУНК результат каждого изменения, независимо от стадии получения МУНК. Например, изменяя скорость упаривания липидной пленки, мы получали МУНК, и оценивали эффект изменения скорости упаривания по изменению качества препарата финальных МУНК, и мы считаем такой подход верным. Для контроля качества образцов на всех стадиях приготовления, очистки и концентрирования МУНК мы использовали методы динамического светорассеяния, спектроскопии и просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Данный комплекс методов позволяет адекватно оценивать препараты наноструктур и отслеживать изменения как препаратов в целом, так и морфологии частиц. Следует подчеркнуть важность и значимость исследования препаратов в ПЭМ, - прямая визуализация частиц позволяет отследить изменения их структуры при разных воздействиях, а также адекватно интерпретировать данные других исследований. Для изучения влияния химических модификаций на эффективность подавления синтеза целевого белка GFP в клетках культур в монослое и в сфероидах использовали три варианта из 24-х синтезированных и изученных модифицированных siРНК. Выбор сделан по результатам сравнительного анализа физико-химических параметров и эффективности подавления синтеза репортерного белка GFP в клетках HEK Phoenix, стабильно экспрессирующих данный белок. Для удобства изложения в тексте приняты следующие обозначения: МУНК-1 – МУНК, несущий нативную siРНК (S/AS) МУНК-2 – МУНК, несущий модифицированную siРНК (S/AS-OMe) МУНК-3 – МУНК, несущий модифицированную siРНК (S-F*/AS-OMe) МУНК-4 – МУНК, несущий модифицированную siРНК (S-OMe*/AS-OMe) Оценку эффекта химических модификаций siРНК проводили на фибробластах линии SC-1 R780, стабильно экспрессирующих репортерный белок GFP. Анализ методом проточной цитофлуориметрии уровня флуоресценции репортерного белка GFP в фибробластах, трансфицированных вариантами 1-4 МУНК (концентрация 1,5 нМ по золоту), не выявил заметных различий между вариантами. Мы заменили линию фибробластов на линию клеток HEK FT, также стабильно экспрессирующих белок GFP, этот вариант клеток был получен и аттестован в лаборатории геномного редактирования нашего института (ИХБФМ СО РАН). Клетки HEK FT в монослое трансфицировали вариантами 1-4 МУНК (концентрация 1,5 нМ по золоту) и проанализировали уровень флуоресценции белка GFP методом проточной цитофлуорометрии через 3 сут. Уровень флуоресценции белка GFP снижался при трансфекции всеми вариантами МУНК, что говорит о подавлении его синтеза, причем эффект МУНК-3 и МУНК-4 (несут ФГ-группу) был более выражен, чем МУНК-1 (нативная siRNA). В то же время эффект МУНК-2 (модифицированная siRNA без ФГ-группы) заметно не отличался от эффекта МУНК-1. Можно заключить, что более выраженный эффект МУНК-3 и МУНК-4 обусловлен протективным действием ФГ-группы в составе модифицированной siРНК. Проверка эффекта модификаций siРНК в клеточной 3D-системе (сфероидах) НЕК FT потребовала дополнительных исследований по выбору параметров культивирования сфероидов и подбору концентраций siRNA. Сфероиды клеток HEK FT трансфицировали МУНК-1 или МУНК-4 в концентрации 0,25 - 1 нМ (по золоту) в течение 4 ч, часть сфероидов фиксировали для ПЭМ, остальные инкубировали в течение 3 суток. Затем флуоресценцию клеток сфероидов анализировали на цитофлуориметре, результаты показали, что эффект МУНК-4, несущей в модифицированной siРНК ФГ-группу, на 22,7 % превосходит эффект МУНК-1 (нативная siРНК). Эти результаты показывают протективное действия ФГ-группы в составе siRNA. В рамках решения задачи по созданию МУНК, несущих иРНК, был собран ряд ДНК-матриц для in vitro T7 транскрипции, матрицы были заклонированы в вектор и охарактеризованы методом секвенирования по Сэнгеру. На основе полученных матриц были синтезированы пять вариантов иРНК, содержащих кодирующую GFP последовательность, поли-А хвост длиной 35 или 45 нуклеотидов, в 5’-НТО искусственный IRES KMI I или IRES вируса энцефаломиокардита, в 3’-НТО - норовирусный НТО или НТО альфа-глобина. Полученные иРНК были испытаны на клеточных линиях Hep G2 и HEK 293, с использованием трансфектантов Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 и протамин. Было установлено, что ни один из 5 типов иРНК в сочетании с одним из трех трансфектантов на двух типах клеточных культур не показывает экспрессию GFP. Мы полагаем, что этот результат может быть связан с кодоновым составом кодирующей GFP последовательности и уровнем соответствующих тРНК в использованных нами клетках. Для сборки липоплекса с иРНК нами была разработана методика по получению липидных наночастиц, позволяющая получать концентрированный препарат оформленных наночастиц размером до 20 нм. На поверхность полученных наночастиц эффективно сорбировались протяженных РНК (от 1000 нт), процесс сорбции РНК не приводил к преципитации частиц или к их агрегации. Липидные наночастицы, несущие на своей поверхности протяженную РНК, сохраняли небольшой размер - 21,19±3,5 нм в диаметре (данные ДСР). Мы визуализировали в ПЭМ изображения липоплексов, несущих на поверхности нуклеиновую кислоту, использовав наш опыт контрастирования наноструктур. Нуклеиновая выявлялась в виде скоплений/нитей электронно-плотного материала, аналогичные данные в научной литературе не обнаружены. В третий год проекта нами опубликовано две статьи по тематике проекта в журналах Q1: Pavlova A.S.; Yakovleva K.I.; Epanchitseva A.V.; Kupryushkin M.S.; Pyshnaya I.A.; Pyshnyi D.V.; Ryabchikova E.I.; Dovydenko I.S. An Influence of Modification with Phosphoryl Guanidine Combined with a 2 0 -O-Methyl or 20 -Fluoro Group on the Small-Interfering-RNA Effect. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 9784. https:// doi.org/10.3390/ijms22189784 Epanchintseva A.V.; Poletaeva J.E.; Dovydenko I.S.; Chelobanov B.P.; Pyshnyi D.V.; Ryabchikova E.I.; Pyshnaya I.A. A Lipid-Coated Nanoconstruct Composed of Gold Nanoparticles Noncovalently Coated with Small Interfering RNA: Preparation, Purification and Characterization. Nanomaterials 2021, 11, 2775. https://doi.org/10.3390/nano111127752079-4991