КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 19-15-00272

НазваниеИзучение молекулярных и клеточных механизмов патогенеза бронхиальной астмы в сочетании с полипозным риносинуситом

РуководительХаитов Муса Рахимович, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научный центр "Институт иммунологии" Федерального медико-биологического агентства, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2021 г.

, продлен на 2022 - 2023. Карточка проекта продления (ссылка)

Конкурс№35 - Конкурс 2019 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами».

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-108 - Иммунология

Ключевые словаХронический полипозный риносинусит, бронхиальная астма, аллергия, факторы роста, провоспалительные и противовоспалительные цитокины, биомаркеры

Код ГРНТИ34.15.33

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Одной из самых распространенных патологий верхних дыхательных путей является хронический полипозный риносинусит (ХПРС), характеризующийся воспалением слизистой оболочки носа и околоносовых пазух, сопровождающийся ростом полипов. Распространенность ХПРС достигает 4%; при этом почти в 40% случаев сопутствующей патологией является бронхиальная астма (БА) – хроническое воспалительное заболевание нижних дыхательных путей. Указанные заболевания традиционно рассматриваются как независимые, однако в последние годы появляются публикации, доказывающие их тесную взаимосвязь. По всей видимости воспаление в верхних дыхательных путях поддерживает воспаление нижних дыхательных путей и наоборот. Частое сочетание указанных патологий создает значительные проблемы при их диагностике и лечении. БА в сочетании с ХПРС считается одним из самых сложных в лечении фенотипов, поскольку развитие полипов приводит к повышению частоты обострений, и наоборот, вероятность повторного появления полипов значительно выше у больных с БА. Изучение патогенеза ХПРС и БА показало, что в их развитии участвуют провоспалительные Th2-цитокины (IL-4, -5, -13) и Th17-цитокины (IL-17A, IL-17F и -22), которые формируют основные признаки заболеваний: ремоделирование респираторного тракта, инфильтрация провоспалительных клеток (нейтрофилов и эозинофилов) в зону воспаления (ткань легких при БА и слизистая оболочка полости носа и околоносовых пазух при ХПРС), развитие гиперчувствительности дыхательных путей. Несмотря на растущее количество исследований, к настоящему времени не раскрыты молекулярные и клеточные механизмы взаимного влияния вышеуказанных патологий, а также неизвестно какие факторы и клетки ответственны за индукцию и рост полипозной ткани. В связи c этим, одной из задач предлагаемого проекта является изучение молекулярных и клеточных механизмов взаимного влияния БА и ХПРС. Для ее решения планируется сформировать несколько групп добровольцев, которые будут включать: здоровых добровольцев, пациентов с ХПРС, пациентов, страдающих ХПРС на фоне аллергической и неаллергической БА, а также пациентов с БА без ХПРС. В рамках предлагаемого проекта будет впервые изучено влияние ХПРС на различные фенотипы БА. Гетерогенность молекулярных механизмов развития БА определяет разнообразие фенотипов данной патологии; если эозинофильная БА развивается по Th2-зависимому механизму, то неэозинофильная - по Th17- зависимому механизму. Данные исследования позволят оценить влияние ХПРС на Th2/Th17 баланс иммунного ответа при различных формах БА. В ходе исследований от каждого добровольца будет собран биопсийный материал (ткань полипа или фрагмент носовых раковин - для здоровых добровольцев) и мононуклеары периферической крови, где будет проведено изучение уровней провоспалительных цитокинов (IL-4, IL-5, IL-13, IL-17А, IL-17F, IL-33, IL-25 и TSLP) и транскрипционных факторов (GATA3 и RORgt) методами количественной ПЦР и твердофазного ИФА. Сравнение уровней локальной (в ткани полипа) и системной (в мононуклеарных клетках периферической крови) экспрессии данных цитокинов внесет вклад в понимание того, является ли развитие полипа результатом локальной дисрегуляции или системных нарушений в иммунной системе. Другой важной задачей проекта является установление молекулярных и клеточных механизмов роста полипов. Развитие ХПРС и БА сопровождается ремоделированием - структурными изменениями дыхательных путей, которое характеризуется гиперплазией и метаплазией эпителия, гипертрофией гладких мышц и отложением коллагена. Процесс ремоделирования при БА относительно хорошо изучен; полагается, что его причиной служат факторы роста, выделяемые макрофагами. В связи с этим мы предполагаем, что в процесс роста полипов также вовлечены макрофаги и продуцируемые ими факторы роста. Для проверки этой гипотезы будет изучен клеточный состав полипозной ткани методом проточной цитометрии с клеточным сортингом. Из полипа планируется выделить популяции клеток, которые участвуют и/или могут участвовать в патогенезе ХПРС. В первую очередь CD4+T- и CD8+Т-клетки, В-клетки и эпителиальные клетки, которые продуцируют провоспалительные цитокины, поддерживающие хроническое воспаление. Отдельно будет рассмотрена популяция макрофагов, в которой будет изучена экспрессия факторов роста (FGF, EGF, VEGF, GM-CSF) методом количественной ПЦР, что позволит сделать предположение об их роли в процессах ремоделирования и формирования полипозной ткани. Раскрытие молекулярных и клеточных механизмов взаимного влияния БА и ХПРС будет иметь большое как научное, так и практическое значение. В частности, на основе полученных в ходе проекта данных, можно будет предложить ряд перспективных молекулярных биомаркеров для диагностики указанных заболеваний, а также выявить оптимальные биомишени для разработки новых таргетных препаратов.

Ожидаемые результаты
Данный проект направлен на изучение молекулярных и клеточных механизмов взаимного влияния БА и ХПРС. Для решения этой задачи будет сформировано 6 групп добровольцев. Группа-1: здоровые добровольцы; группа-2: добровольцы с хроническим полипозным риносинуситом (ХПРС) без бронхиальной астмы (БА) и аллергии; группа-3: добровольцы с аллергической БА (любой степени тяжести) в сочетании ХПРС; группа-4: добровольцы с неаллергической БА (любой степени тяжести) в сочетании ХПРС; группа-5: добровольцы с аллергической БА (любой степени тяжести) без ХПРС; группа-6: добровольцы с неаллергической БА (любой степени тяжести) без ХПРС. В исследование будет включено не менее 20 добровольцев в каждую группу. Все участники исследования будут охарактеризованы с клинической точки зрения: будет проведен сбор анамнеза, будут применены клинико-лабораторные методы обследования (клинический анализ крови, спирометрия, постановка прик-тестов). Также у каждого добровольца будет собран биопсийный материал (ткань полипа у добровольцев с ХПРС или фрагмент слизистой оболочки носовых раковин у здоровых добровольцев) и мононуклеары периферической крови. Известно, что эозинофильная БА развивается по Th2-зависимому механизму, а неэозинофильная - по Th17-зависимому механизму [Newcomb, Peebles, 2013]. Учитывая эти факты, методом количественной ПЦР будут изучены изменения уровней экспрессии цитокинов: IL-4, IL-5, IL-13, продуцируемых Th2-лимфоцитами и IL-17А и IL-17F, продуцируемых Th17-клетками, как в ткани полипа, так и в мононуклеарах периферической крови. Кроме того, этим же методом планируется изучить изменения активности транскрипционных факторов GATA3 и RORgt, которые специфично экспрессируются в Th2- и Th17-клетках. Данные количественного ПЦР-анализа будут подтверждены методом ИФА. Для этого супернатанты стимулированных мононуклеаров будут проанализированы в ИФА для определения продукции основных маркерных цитокинов: IL-4 (маркер Th2-иммунного ответа), IL-17F (маркер Th17-иммунного ответа) и IFN gamma (маркер Th1-иммунного ответа). Таким образом, данные исследования позволят оценить влияние ХПРС на изменения в Th2/Th17-балансе иммунного ответа при различных формах БА. Сравнение уровней локальной (в ткани полипа) и системной (в мононуклеарных клетках периферической крови) экспрессии данных цитокинов внесет вклад в понимание того, является ли развитие полипа результатом локальной дисрегуляции или системных нарушений в иммунной системе. Другой важной задачей проекта является установление молекулярных и клеточных механизмов роста полипов. В последние годы большое внимание уделяется роли фактора, активирующего В-клетки (BAFF) [Dilidaer и др., 2017]. Считается, что дифференцированные В-клетки, продуцируя аутоантитела в ткани полипа, индуцируют локальный аутоиммунный воспалительный процесс, который способствует формированию полипа [Koennecke и др., 2018]. В связи с этим фактор, активирующий В-клетки, также может играть роль в патогенезе ХПРС, что экспериментально было подтверждено у мышей [Kim и др., 2016]. Учитывая этот факт, будет изучена активность BAFF в ткани полипа у добровольцев, что позволит подтвердить или опровергнуть, высказанную гипотезу. Помимо BAFF к семейству TNF относится лиганд, индуцирующий пролиферацию (APRIL) [Vincent и др., 2013]. Согласно нашему предположению, APRIL также, как BAFF может быть вовлечен в эпителиально-мезенхимальные изменения при формировании полипозной ткани. Для проверки нашего предположения на данном этапе будет изучена активность APRIL в ткани полипа методом количественной ПЦР. Развитие ХПРС и БА сопровождается ремоделированием - структурными изменениями дыхательных путей, которое характеризуется гиперплазией и метаплазией эпителия, гипертрофией гладких мышц и депозизиция коллагена. Процесс ремоделирования при БА относительно хорошо изучен; полагается, что его причиной служат факторы роста, выделяемые макрофагами. В связи с этим, мы предполагаем, что в процесс роста полипов также вовлечены макрофаги и продуцируемые ими факторы роста. Для проверки этой гипотезы будет изучен клеточный состав полипозной ткани методом проточной цитометрии с клеточным сортингом. Из полипа планируется выделить популяции клеток, которые участвуют и/или могут участвовать в патогенезе ХПРС. В первую очередь CD4+T- и CD8+Т-клетки, В-клетки и эпителиальные клетки, которые продуцируют провоспалительные цитокины, поддерживающие хроническое воспаление. Отдельно будет рассмотрена популяция макрофагов, в которой будет изучена экспрессия факторов роста (FGF, EGF, VEGF, GM-CSF) методом количественной ПЦР, что позволит сделать предположение об их роли в процессах ремоделирования и формирования полипозной ткани. Таким образом, полученные данные позволят пролить свет на молекулярные и клеточные механизмы взаимного влияния БА и ХПРС, а также установить возможную роль макрофагов и выделяемых ими факторов роста в формировании полипов. Раскрытие этих механизмов будет иметь большое как научное, так и практическое значение. В частности, можно будет предложить ряд перспективных молекулярных биомаркеров для диагностики указанных заболеваний, а также выявить оптимальные биомишени для разработки новых таргетных препаратов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетном году были выполнены все запланированные работы и получены ожидаемые результаты. А именно, начато формирование групп добровольцев для исследования на основе ранее разработанных критериев включения/невключения. За 2019 год был собран материал от 111 добровольцев, у которых был подтвержден факт наличия исследуемых патологий: ХПРС и/или БА аллергической или неаллергической природы. Проведенное нами исследование подтвердило взаимосвязь между БА и ХПРС, что указывает на необходимость более детальной диагностики, лечения и дальнейшего ведения данной когорты пациентов. Главной новизной проекта являлось выделение из общего пула добровольцев пациентов с аллергической и не аллергической БА. В процессе обработки данных мы впервые показали, что выраженное воспаление было характерно для пациентов с БА в сочетании с ХПРС, при этом пациенты с нБА в сочетании с ХПРС имели признаки более выраженного эозинофильного воспаления, что является неблагоприятным прогностическим фактором. При исследовании мононуклеарных клеток периферической крови и ткани полипа было показано преобладание локального воспалительного процесса, поддерживающегося дисрегуляцией Th1-, Th2-, Th17-иммунного ответа, что подтверждается данными qPCR- и ИФА-маркерных цитокинов и их транскрипционных факторов. Полученные нами результаты свидетельствуют о нарушении Th1-, Th2- и Th17-иммунного ответа при аБА и нБА в сочетании с ХПРС, а высокая экспрессия гена il-37 у добровольцев с БА в сочетании ХПРС, и, особенно, у добровольцев с нБА в сочетании с ХПРС, возможно свидетельствует о «включении» противовоспалительного компенсаторного механизма. Таким образом, сравнение уровней локальной (в ткани полипа) и системной (в мононуклеарных клетках периферической крови) экспрессии данных цитокинов позволило сделать вывод о том, что развитие полипа является результатом локальной дисрегуляции про- и противовоспалительный факторов, а системные нарушения в иммунной системе вторичны.

Публикации

1. Шиловский И. П., Дынева М. Е., Курбачева О. М., Кудлай Д. А., Хаитов М. P. Роль интерлейкина-37 в патогенезе аллергических заболеваний ACTA NATURAE, т. 11, №4 (43), с. 46-56 (год публикации - 2019)

2. Дынева М.Е., Курбачева О.М., Шиловский И.П., Ковчина В.И., Савлевич Е.Л., Гайсина А.Р., Никольский А.А., Хаитов М.Р. Analysis of the expression of Th-1, Th-2, Th-17 cytokines in patients with allergic and non- allergic bronchial asthma associated with chronic rhinosinusitis with nasal polyps Allergy, volume 74, issue 106, p. 205-206 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1111/all.13959

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном году были выполнены все запланированные работы и получены ожидаемые результаты. А именно, за 2020 год были проанализированы биологические материалы от 207 добровольцев. Проведенное нами исследование подтвердило гипотезу о том, что при сочетании бронхиальной астмы (БА) и хронического полипозного риносинусита (ХПРС) отмечается наиболее выраженные воспалительные и фиброзные процессы в верхних дыхательных путях, что в свою очередь может объяснить наблюдаемое тяжелое и рецидивирующее течение ХПРС в сочетании с БА. Принципиальной новизной проекта являлось изучение особенностей экспрессии генов различных факторов роста в полипозной ткани у пациентов с аллергической и неаллергической БА в сочетании с ХПРС. Мы установили, что сочетание неаллергической БА и ХПРС характеризовалось наиболее высокой экспрессией фактора роста фибробластов и фактора, активирующий В-клетки. Таким образом, выраженное локальное нарушение процессов пролиферации и фиброза является неблагоприятным прогностическим фактором и объясняет частую неэффективность проводимой терапии в отношении ХПРС. Дальнейшее изучение факторов роста позволит понять не только их взаимоотношения и биологические эффекты при сочетании ХПРС и БА, но и определить роль BAFF и APRIL в данном воспалительном каскаде. Мы предполагаем, что развитие полипа является результатом локальной дисрегуляции как про- и противовоспалительный факторов, так и факторов роста, отвечающих за процессы ангиогенеза, фиброза и пролиферации эпителиальных клеток. Дополнительно мы включили в наше исследование незапланированный раздел по изучению молекулярных механизмов вирус-индуцированных обострений БА. В частности, мы планировали выяснить каким образом респираторные инфекции влияют на Th1/Th2-поляризацию иммунного ответа при БА и установить возможные механизмы развития дефицитного иммунного ответа на инфекцию у этой категории пациентов. Это особенно актуально в свете последних событий, связанных с пандемий, т.к. пациенты с БА относятся к группе риска по развитию обострений. В ходе наших исследований полученные результаты подтвердили, что наблюдаемый при аллергической БА дефицитный иммунный ответ на респираторные инфекции может быть следствием повышенной регуляции провоспалительного Th-2 цитокина IL-33 и снижением количества М1-подобных классически активированных бронхоальвеолярных макрофагов, обладающих противовирусными свойствами.

Публикации

1. А. Никонова, М. Хаитов, Д.Ж. Джексон,С. Трауб, М-Б Тружило-Торалбо, Д.А. Кудлай, А.С. Дворников, Аджерико Дел-Розарио, Р. Валента, Л.А. Станку, Р. Хаитов, С.Л. Джонстон M1-like macrophages are potent producers of anti-viral interferons and M1-associated marker-positive lung macrophages are decreased during rhinovirus-induced asthma exacerbations EBioMedicine, N 54, p. 102734 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2020.102734

2. М.А. Галицкая, О.М. Курбачева, И.П. Шиловский, А.А. Никольский, А.А. Никонова, М.Е. Дынева, М.Р. Хаитов Некоторые особенности воспаления у пациентов с атопической бронхиальной астмой при воздействии респираторных вирусов Иммунология, N41 (2), стр. 154–163. (год публикации - 2020) https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-2-154-163

3. Никонова А., Шиловский И., Галицкая М., Соколова А., Сундукова М., Дмитриева- Посокко О., Митин А., Комогорова В., Литвина М., Шарова Н., Жернов Ю., Кудлай Д., Дворников А., Курбачева О., Хаитов Р., Хаитов М. Respiratory syncytial virus upregulates IL-33 expression in mouse model of virus-induced inflammation exacerbation in OVA-sensitized mice and in asthmatic subjects Cytokine, 155349 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.cyto.2020.155349

4. О.М. Курбачева, М.Е. Дынева, И.П. Шиловский, Е.Л. Савлевич, В.И. Ковчина, А.А. Никольский, Е.Ю. Савушкина, М.Р. Хаитов Полипозный риносинусит в сочетании с бронхиальной астмой: клинические особенности и клеточная характеристика локального и системного воспаления Российский Аллергологический Журнал, №17(1), стр. 32-49 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.36691/RAJ.2020.17.1.003

5. Хаитов М.Р., Дынева М.Е., Савлевич Е.Л., Кудлай Д.А., Гайсина А.Р., Никольский А.А., Шиловский И.П., Курбачева О.М. Бронхиальная астма в сочетании с полипозным риносинуситом: клиническая характеристика и анализ локальной экспрессии гена IL37 Иммунология, №41 (1), стр. 54–63. (год публикации - 2020) https://doi.org/10.33029/0206-4952-2020-41-1-54-63

6. Дынева М., Курбачева О., Шиловский И.,Савлевич Е.,Ковчина В., Никольский А., Хаитов М., Кудлай Д. Characteristic of systemic and local inflammation in nasal polyps comorbid with asthma Allergy, Т. 75. - № S109. - P:390-391 (год публикации - 2020)

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году были выполнены все запланированные работы и получены ожидаемые результаты. Были собраны и охарактеризованы клинические образцы у разных групп пациентов . Всего было сформировано 3 группы добровольцев: группа-1: 9 добровольцев с аллергической бронхиальной астмой (БА) (любой степени тяжести) в сочетании хроническим полипозным риносинуситом (ХПРС); группа-2: 7 добровольцев с неаллергической БА (любой степени тяжести) в сочетании с ХПРС; группа-3: 15 добровольцев с ХПРС без БА. Все участники исследования были охарактеризованы с клинической точки зрения. Образцы полипов, собранные у пациентов разных групп были проанализированы методом проточной цитометрии с целью определения клеточного состава полипа. Кроме того, разные популяции клеток были сепарированы посредством клеточного сортинга и в каждой из них была определена экспрессия мРНК различных цитокинов и факторов роста методом количественной РТ-ПЦР (ПЦР в флуоресцентной детекцией в режиме реального времени). Полученные данные свидетельствуют о том, что более выраженное воспаление характерно для пациентов, страдающих ХПРС в сочетании с неаллергической бронхиальной астмой. Эти данные сопоставимы с теми, которые мы получили на предыдущем этапе проекта, когда мы сравнивали локальный и системный уровень воспаления у пациентов разных групп. Кроме того, было установлено, что все три исследуемых группы характеризовались высоким содержанием эозинофилов, что совпадает с данными гистологических исследований, полученных нами на предыдущем этапе проекта, которые свидетельствуют об эозинофильной инфильтрации ткани полипов, уровень которых также повышен в крови у пациентов с ХПРС. Мы предполагаем, что именно эозинофилы вносят основной вклад в развитие воспаления, наблюдаемое у пациентов с ХПРС, осложненном как аллергической, так и неаллергической БА и разрабатываемая терапия должна быть направлена в т.ч. на снижение их уровня. Кроме того, мы предполагаем, что ведущую роль в развитии воспалительной реакции (в форме привлечения эозинофилов и ремоделировании ткани полипа) играют IL-5 и IL-13, которые могут стать привлекательной мишенью при таргетной терапии ХПРС.

Публикации

1. О.М.Курбачева , М.Е.Дынева , И.П.Шиловский , Е.Л.Савлевич , В.И.Ковчина , А.А.Никольский , Е.Ю.Савушкина , М.Р.Хаитов Особенности молекулярных механизмов патогенеза бронхиальной астмы в сочетании с полипозным риносинуситом Пульмонология, 31 (1): 7–19. (год публикации - 2021) https://doi.org/10.18093/0869-0189-2021-31-1-7-19

2. Гусниев С.А., Польнер С.А., Михалева Л.М., Ильина Н.И., Есакова А.П., Курбачева О.М., Шиловский И.П., Хаитов М.Р. Влияние экспрессии гена интерлейкина-33 на клинико- морфологические характеристики слизистой оболочки носа при аллергическом рините Иммунология, Том 42, № 1, стр. 68-79 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-1-68-79

3. Александра Никонова, Дмитрий Кудлай, Муса Хаитов The role of TH1 and TH2 immunity in rhinovirus infections European Journal of Immunology, 51 (Suppl. 1), p.21 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1002/eji.202170200

4. Дынева М; Курбачева О; Шиловский И; Савлевич Е; Савушина Е; Никольский А; Ковчина В; Хаитов М; Кудлай Д The change of the processes of angiogenesis and proliferation of epithelial cells in patients suffer from chronic rhinosinusitis with nasal polyps comorbid with asthma Allergy, Volume 76,Supplement 110, p. 110 (год публикации - 2021)

Возможность практического использования результатов
Результаты, полученные в ходе работ над проектом, могут быть использованы для разработки новых методов диагностики и терапии пациентов с хроническим полипозным риносинуситом, осложненным бронхиальной астмой.