Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Настоящий проект посвящен выявления молекулярных триггеров начала болезни Паркинсона (БП), ассоциированной с мутациями в гене лизосомного фермента глюкоцереброзидазы (GBA) (GBA-БП). Мутации в гене GBA являются наиболее распространенным фактором риска развития БП, повышая риск развития заболевания в 7-8 раз. Молекулярные механизмы развития GBA-БП остаются неизвестными. В общей структуре БП, распространенность GBA-БП достигает 5-6%, однако не все носители мутаций и пациенты с болезнью Гоше (гомозиготные или компаундные мутации в гене GBA) развивают БП в течение жизни. Мы предположили, что развитие БП у носителей мутаций в гене GBA может быть обусловлено дисфункцией других лизосомных ферментов. За отчетный период группа пациентов с GBA –БП описанная нами ранее (Emelyanov et al., 2018, Neurobiology of Aging, Vol.71C, P. 272) была расширена. Проведенный скрининг мажорных мутаций GBA среди 250 пациентов с БП выявил 2х пациентов с мутациями N370S и L444P в гене GBA. Также при обследовании семей с ранее выявленными мутациями был выявлен еще один пациент с GBA-БП. В группе GBA-БП было охарактеризовано течение БП, моторный и когнитивный статус пациентов, а также в плазме крови пациентов исследован спектр цитокинов. Показано повышение концентрации провоспалительных цитокинов в группе GBA-БП как по сравнению с группой с БП, так и с группой контроля (Милюхина с соавт., 2019, 168 (10):404 - 408). Группа бессимптомных носителей мутаций в гене GBA была сформирована при обследовании родственников первой и второй степени родства пациентов с болезнью Гоше. В группу GBA-БП было включено 13 пациентов (мужчин 46%, возраст 62,0±3,0; возраст начала 55,7 ± 3,5), группа сравнения – неврологически здоровые лица с наличием мутаций в гене GBA составила 19 человек (мужчин 35%, возраст 52,5 ± 2,5 лет). Также в исследование были включены группа пациентов со спорадической формой БП (сБП) с отсутствием мутаций в гене GBA, группа неврологически здоровых лиц с отсутствием мажорных мутаций в гене GBA (контроль). При скрининге других мутаций, приводящих к развитию лизосомных болезней накопления (ЛБН) (84GG GBA, C185T (S62L) TPP1 и C1210A (H404N) CLN3) и полиморфных вариантов rs6812193 и rs8475 в гене SCARB2, кодирующем специфический рецептор транспортаглюкоцереброзидазы на мембране лизосом, среди 518 пациентов с БП и в контроле был выявлен один носитель мутации в гене CLN3 (в гомозиготном и компаундном состоянии мутации приводят к развитию болезни Баттена). Также было показано, что носительство аллеля Т rs6812193 и вариант ТТ rs8475 гена SCARB2 повышают риск развития БП в 1.5 и 2 раза, соответственно. Ассоциация вариант ТТ rs8475 гена SCARB2 с БП выявлена впервые. При оценке активности лизосомных ферментов (глюкоцереброзидазы (GCase), альфа-галактозидазы (GLA), альфа-глюкозидазы (GAA), галактоцереброзидазы (GALC), сфингомиелиназы (ASM) и альфа-идуронидазы (IDUA)) и накоплении субстратов ((гексазилсфингозина (HexSph) (смесь гликозилсфингозина (GlcSph) и галактозилсфингозина (GalSph)), лизосфингомиелин (LysoSM), лизоглоботриаозилсфингозин (LysoGb3), лизосфингомиелин-509 (LysoSM-509)) нами было выявлено снижение ферментативной активности GBA, и накопление лизосфинголипидов (HexSph) в крови (анализ с сухого пятна крови методом ВЭЖХ-МС/МС) как в группе GBA-БП, так и в группе бессимптомных носителей мутаций как по сравнению с группой сБП, так и с контролем. При этом не было выявлено различий в активности лизосомных ферментов и концентрации метаболитов между группой GBA-БП и бессимптомными носителями GBA мутаций. При анализе экспрессии генов мембранных белков лизосом SCARB2 и LAMP2 в CD45+ клетках периферической крови пациентов с GBA-БП, в группе бессимптомных носителей мутаций, а также в группе пациентов со сБП и контроле было выявлено достоверное снижение экспрессии генов SCARB2 и LAMP2 в группе пациентов с GBA-БП, как относительно пациентов со сБП (р=0.01, p<0.0001, соответственно), так и контрольной группы (p<0.05, p<0.0001, соответственно). Более того выявлено достоверно значимое снижение уровня мРНК гена LAMP2 в CD45+ клетках крови у пациентов GBA-БП по сравнению с группой бессимптомных носителей мутаций в гене GBA (p=0.024) (Усенко с соавт., 2019, Анналы клинической и экспериментальной неврологии, 14(2)). При анализе спонтанной и индуцированной (H2O2) аутофагии методом проточной цитометрии в первичной культуре макрофагов, полученной путем культивирования мононуклеаров крови в присутствии макрофагального колоние-смулирующего фактора роста (M-CSF) от пациентов с GBA-БП, бессимптомных носителей мутаций и в контроле не было выявлено отличий в спонтанной аутофагии в указанных группах. Для оценки влияния мутаций в гене GBA на пул экстраклеточных везикул плазмы крови и на эффективность переноса ими белка альфа-синуклеина, агрегация которого рассматривается в качестве основной причины развития БП, нами впервые проведено с сопоставление характеристик пула экзосом плазмы крови, а также сопоставление белкового состава экзосом, группы пациентов с болезнью Гоше и контроля. В протеоме экзосом полученным методом МС/МС белка альфа-синуклеина выявлено не было (Shtam et al., 2019, under rewiew). Проведены эксперименты по дозо-зависимому введению мышам селективного ингибитора GBA кондуритола бетта эпоксида (CBE) с последующей оценкой активности GBA и уровня лизосфинголипидов в различных отделах мозга. Показано, что инъекция CBE в концентрации 100мкг/кг приводит к снижению ферментативной активности GBA на 40% и повышению концентрации HexSph в 8 раз в лобной коре головного мозга животных, что позволит в дальнейшем использовать данных поход для создания умеренной дисфункции GBA у модельных животных при оценке влияния дисфункций GBA на степень нейродегенерации в модели МФТП-индуцированного паркинсонизма на животных. В целом проведенное исследование настоящего этапа подтвердило ассоциацию генетических вариантов в генах, кодирующих ферменты и белки лизосом, с БП. Впервые показано, что оценка активности GBA, а также лизосфинголипидов в крови не может служит маркером развития GBA – БП. Сделано предположение о том, что пониженная экспрессия гена LAMP2, кодирующего рецептор, участвующий в транспорте GBA в лизосомы, может способствовать развитию БП у носителей мутаций в гене GBA. Отработана модель мягкой дисфункции GBA на мышах.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Настоящий проект посвящен выявления молекулярных триггеров начала болезни Паркинсона (БП), ассоциированной с мутациями в гене лизосомного фермента глюкоцереброзидазы (GBA) (GBA-БП). Мутации в гене GBA являются наиболее распространенным фактором риска развития БП, повышая риск развития заболевания в 7-8 раз. Молекулярные механизмы развития GBA-БП остаются неизвестными. В общей структуре БП, распространенность GBA-БП достигает 9%, однако не все носители мутаций и пациенты с болезнью Гоше (гомозиготные или компаундные мутации в гене GBA) развивают БП в течение жизни. К возрасту 80 лет БП развивается у 19% носителей мутаций в гене GBA (Balestrino et al., 2020, Mov Disord). Мы предполагаем, что триггером развития заболевания у носителей мутаций в гене GBA могут служить дополнительные факторы, влияющие на дисфункцию лизосом. Целью настоящего этапа исследования явилось сопоставление дифференциальной экспрессии генов, ферментативной активности GBA и концентрации лизосфинголипидов, эффективности транслокации GBA в лизосомы между группами пациентов с GBA-БП и группой бессимптомных носителей мутаций в гене GBA (БП-GBA). Поскольку макрофаги крови наиболее чувствительны к дисфункции GBA исследования выполнены на первичной культуре макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови. Также в ходе исследования определяли количество, размер и белковый состав экстраклеточных везикул в плазме крови. В качестве групп сравнения в исследование включены пациенты со спорадической формой заболевания (сБП), а также лица контрольной группы без неврологических заболеваний. Кроме того на модельных животных с одновременным введением нейротоксина МФТП и селективного ингибитора GBA (кондуритол-В-эпоксида, СВЕ) была проведена оценка потенциирующего действия нейротоксина, приводящего к развитию паркинсонизма, у модельных животных с дисфункцией GBA. При анализе транскриптома первичной культуры макрофагов в группах GBA-БП, БН-GBA и контроле проведен анализ качества прочтений (FastQC), проведено выравнивание прочтений на референсный геном (GRCh38.) при помощи программы HISAT2. Качество выравниваний оценивалось с использованием программ RSeQC и IGV. Количество прочтений для каждого гена было посчитано с использованием HTSeq. С использованием программного пакета DESeq2 в статистической среде R версии 3.6.2.выявлен ряд дифференциально экспрессирующихся генов. Наибольший интерес в качестве потенциальных триггеров развития БП у носителей мутаций в гене GBA представляют гены, вовлеченные в поддержание функции дофаминергической системы, митохондриальной функции, воспаления и иммунного ответа, с высокой степенью значимости дифференциальной экспрессии, а также ранее ассоциированные с развитием БП. В частности, гены транскрипционных факторов JUNB, NR4A2, EGR1, ген фосфотазы DUSP1, а также гены LINC02471, LINC01891, NXPH3 ранее ассоциированные с БП, и гены воспаления IL31RA, IL6. На предыдущем этапе исследования нами был охарактеризован пул экстраклеточных везикул плазмы крови пациентов с болезнью Гоше и показано влияние мутаций в гене GBA на размер и морфологию везикул (Shtam et al., 2020, Eur J Med Genet, 63: 104038). На настоящем этапе нами охарактеризован пул экстраклеточных везикул плазмы крови пациентов с GBA-БП и бессимптомных носителей мутаций, а также определен протеом экстраклеточных везикул, полученных из плазмы крови путем ультрацентрифугирования. Выделенные везикулы охарактеризованы методом NTA, также показано присутствие экзосомальных маркеров тетраспонинов (CD9, CD63,CD81). Впервые показано увеличение количества экзосом в плазме крови пациентов с БП, несущих мутацию в гене GBA по сравнению с контролем . Интересно отметить, что концентрация и размер экстраклеточных везикул в группе пациентов с GBA-БП были статистически значимо выше по сравнению с группой БН-GBA (Кулабухова с соавт., 2021, Молекулярная биология, в печати). При анализе белкового состава экзосом методом тандемной масс-спектроскопии (МС/МС) полученные масс-спектры были проанализированы с помощью программ MaxQuant, Perseus, а также встроенного пакета DEP в среде R (vs. 3.6.2). При оценке дифференциальной экспрессии 105 белков, выявленных в составе экзосом плазмы крови в исследованных группах, было показано, что в основном во всех группах присутствуют белки, участвующие в общем механизмами, механизме биогенеза экзосом плазмы крови. Интерес представляют данные о белках дифференцально экспрессирущиеся в группе пациентов с GBA-БП по сравнению с БП и БН-GBA (гены SLC4A1, APOA1, HP), а также белки, кодируемые генами FGA, CFH дифференциально экспрессирующиеся в группе пациентов GBA-БП по сравнению с БН-GBA, ассоциированные ранее с БП. Нами проведена оценка активности GBA и концентрации метаболита, гексозилсфингозина (HexSph), в первичной культуре макрофагов крови. Наблюдали статистически значимое накопление HexSph у носителей мутаций в гене GBA как у пациентов с болезнью Гоше, так и у пациентов с GBA-БП. Значения между группами пациентов с GBA-БП и бессимптомных носителей мутаций не перекрывались. Проведенный анализ характеристических кривых (ROC-анализ) позволил установить пороговое диагностически значимое значение концентрации HexSph. Предложенный подход по оценке HexSph первичной культуре макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови, позволяет отличить группу пациентов с GBA–БП от бессимптомных носителей мутаций в гене GBA, и может являться маркером развития заболевания (выявлено (Nikolaev et al., 2020, Park Relat Disord, under review). На модельных животных (мыши самцы линии C57BL/6 с одновременным введением нейротоксина МФТП и селективного ингибитора GBA (кондуритол-В-эпоксида, СВЕ) была проведена оценка потенциирующего действия нейротоксина, приводящего к развитию паркинсонизма, у модельных животных с дисфункцией GBA. В группах животных ( n=10 для каждой ) вводили CBE (100мг/кг), МФТП (вводили подкожно дважды с концентрацией 12 мг/кг), или их комбинацию с последующей оценкой активности GBA, уровня лизосфинголипидов, а также дофамина и его метаболитов в различных отделах мозга животных. Показано, что МФТП потенциирует накопление метаболита, HexSph. Данный эффект наблюдали в лобной коре и стриатуме мозга мышей. Однако, потенциируеющего эффекта на содержание дофамина в стриатуме не наблюдали, что может говорить о малом интервале между введением соединений и декапитацией. Также нами проведено исследование по оценке влияние ОНП в гене SCARB2 в клетках крови в группе GBA-БП, БН- GBA, сБП и в контроле (Usenko et al., Neuroscience Letters. 20 November 2020. doi.org/10.1016/j.neulet.2020.135509), а также по анализу относительного уровня экспрессии генов, кодирующих ферменты лизосом в группах GBA-БП и БН-GBA. Показана ассоциация rs8475 с БП в российской популяции. В тоже время rs6812193 и rs8475 не влияют на уровень мРНК SCARB2 в клетках крови. Относительный уровень мРНК гена GALNS был достоверно повышен в CD45+ клетках крови в группе БН-GBA относительно пациентов с cБП и контроля. К основным результатом исследования данного этапа проекта можно отнести выявление маркера БП, а именно концентрации HexSph в первичной культуре макрофагов, позволяющего дифференцировать пациентов с GBA-БП от бессимптомных носителей мутаций в гене GBA, а, значит, быть потенциальным биомаркером развития БП к носителей мутаций. Данный результат может иметь важное прикладное значение. Также многообещающими представляются данные полученные в ходе анализа дифференциальной экспрессии генов позволивший выделить перспективные гены, участвующие в регуляции работы дофаминергической системы, уровень экспрессии которых может являться триггером развития БП у носителей мутаций в гене GBA.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект посвящен выявления молекулярных триггеров болезни Паркинсона (БП), ассоциированной с мутациями в гене лизосомного фермента глюкоцереброзидазы (GBA) (GBA-БП). Мутации в гене GBA являются наиболее распространенным фактором риска развития БП, повышая риск развития заболевания в 7- 8 раз. Молекулярные механизмы развития GBA-БП остаются неизвестными. В общей структуре БП, распространенность GBA-БП достигает 9%, однако не все носители мутаций и пациенты с болезнью Гоше (гомозиготные или компаундные мутации в гене GBA) развивают БП в течение жизни. К возрасту 80 лет БП развивается у 19% носителей мутаций в гене GBA. В третий год выполнения проекта была проведена оценка влияния мутаций в гене GBA на индукцию аутофагии и транслокацияю GBA в лизосому как у пациентов с GBA-БП (N=10), так и у бессимптомных носителей мутаций (N=9). Поскольку известно, что макрофаги – наиболее чувствительные к изменению активности GBA клетки в организме человека, исследование проводили на первичной культуре макрофагов, полученных из моноцитов периферической крови. При проведении цитометрического анализа (FC500 BeckmanCoulter, USA) оценки окрашивания мембран преаутофагосом с использованием набора Autophagy Detection kit (ab139484, Abcam, UK) впервые было показано увеличение флуоресцентоного сигнала как в группе пациентов с GBA-БП, так и в группе бессимптомных носителей GBA мутации по сравнению с контролем (p=0.003, p=0.027, соответственно), что говорит о том, что нарушение процесса аутофагии происходит при наличии мутаций в гене GBA независимо от статуса заболевания. При сопоставлении степени транслокации GBA в лизосому методом иммуногистохимического окрашивания, проводимого одновременно с использованием антител на GBA и мембранный белок дизосом LAMP2 впервые показано, что эффективность транслокации в лизосому также снижена как в группе GBA-БП (N=9) и носителей мутаций в гене GBA (N=8) (p<0,0001, p<0,0001 соответственно). При оценке активности GBA и концентрации субстрата HexSph в цельной крови, а также в CD14 + мононуклеарах и первичной культуре макрофагов показано, что максимальной степенью различий дискриминировать группу GBA-БП от контроля позволяет оценка HexSph в культивируемых макрофагах. Верификация данных, полученных на предыдущем этапе исследований при сопоставлении дифференциально экспрессирующихся генов при анализе результатов полнотранскриптомного анализа, проведенного в группах пациентов с GBA-БП, бессимптомных носителей мутаций в гене GBA была проведена с использованием метода ПЦР в режиме реального времени на мононуклеарах периферической крови. Подтверждено снижение уровня экспрессии гена DUSP1, кодирующего фосфатазу митоген-активированных протеинкиназ (MKP-1), как в группе пациентов с GBA-БП как по сравнению с бессимптомными носителями в гене GBA так и с контролем (p<0.0002), p<0.0001 ). Также была выявлено снижение уровня мРНК гена нейрогенеза JUNB по сравнению с сБП, но не с контролем (p=0.029). В отличие от предыдущего года при проведении исследований на модельных животных, самцы линии C57BL/6 в возрасте 5-6 недель с одновременным введением ингибитора GBA кондуритола В эпоксида (CBE) и нейротоксина MPTP животные были выведены из эксперимента не через 48 часов, а через 2 недели после инъекций путем цервикальной дислокации с последующим извлечением лобной коры, стриатума, черной субстанции, что позволило провести оценку моторной нарушений животных при проведении поведенческих тестов через 5 дней и через 2 недели после инъекций, а также оценить отдаленное влияние действия нейротоксина на фоне дисфункции лизосом, а именно, концентрацию моноаминов в стриатуме, степень нейродегенерации нейронов черной субстанции мозга, и выделить дифференциально экспрессирующиеся гены между экспериментальными группами животных. Так, при оценке метаболитов дофамина методом ВЭЖХ-МС было показано потенциирующее влияние CBE на падение уровня дофамина в стриатуме при введении MPTP – в то время как через 2 недели после инъекции MPTP снижение уровня дофамина в стриатуме не наблюдали в группе CBE+MPTP наблюдали двукратное падение концентрации дофамина по сравнению с контролем (p<0,004). Моторных нарушений не было выявлено ни в одной из групп животных. При оценке степени нейродегенерации дофаминергических нейронов методом иммуногистохимии с использованием антител на маркер нейронов тирозингидроксилазу (TH) показано снижение колич ества нейронов при введении MPTP. В группе с одновременным введением CBE+MPTP наблюдали повышение степени нейродегенерации как по сравнению с животными при введении CВЕ, так и с животными при отдельном введении MPTP. Впервые проведенное сопоставление геномной экспрессии в ЧС мозга модельных животных. Было показано снижение экспрессии гена эфринового рецептора EphB1, играющего роль в аксональном наведении и гена меланин-концентрируеющего гормона, Pmch, отвечающего за синтез нейропептида (МСЧ) в группе мышей с MPTP/CBE по сравнению с MPTP, что может свидетельствовать об усилении процессов связанных с нейродегенерации при одновременно введении двух нейротоксинов, чем при введении одного нейротоксина. К основным результатом исследования данного этапа проекта можно отнести то, что он позволил завершить исследования по сопоставлению характеристик, оцениваемых в культуре первичных макрофагов в группах GBA-БП и бессимптомных носителей мутаций GBA, в частности, впервые было показано, что как нарушение транслокации GBA в лизосому, так и степень аутофагии зависит от наличия мутации в гене GBA, а не от наличия БП. Результаты подтвердили, что оценка концентрации HexSph в первичной культуре макрофагов, более чувствительный маркер развития БП по сравнению с оценка данного метаболита в CD14+ клетках крови. Подтверждено влияние дисфункции лизосом на нейродегенерацию дофаминергических нейроном с использованием нейротоксической модели паркинсонизма на мышах. Полученные результаты имеют важное прикладное значение, однако, и ставят новые вопросы, а именно, отражают ли выявленные нами изменения процессы, происходящие в дофаминергических нейронах мозга человека.