Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2029 году (на первом году выполнения проекта) была отработана методика иммуногистохимического исследования тканей на альфа-синуклеин, получен и апробирован конкретный протокол для оптимальной детекции фосфорилированной патологической формы альфа-синуклеина (α-Syn-p129) в биоптатах слюнной железы, а также в веществе мозга на аутопсийном материале и в тканях экспериментальных животных с моделью паркинсонического синдрома. С использованием разработанной методики были исследованы биоптаты подъязычной слюнной железы пациентов с различными формами и стадиями болезни Паркинсона (БП) в сопоставлении с контрольной группой. Показаны четкие различия пациентов с БП и лиц контрольной группы по α-Syn-p129; с целью более тонкой оценки агрегатов альфа-синуклеина начата разработка специальной иммуногистохимической шкалы. Отработаны основные запланированные методики для оценки и объективизации вовлечения различных уровней центральной нервной системы (ЦНС) в синуклеи-опосредованный нейродегенеративный процесс при БП: цветовые зрительные вызванные потенциалы (цЗВП), оптическая когерентная томография (ОКТ), видеоокулография (ВОГ), полисомнография (ПСГ). Получен первые данные об особенностях нарушения контрастного цветовосприятия (цЗВП), тонких движений глаз (ВОГ), архитектоники нервных волокон сетчатки (СНВС) и структуры ночного сна (ПСГ) у пациентов с БП в сопоставлении с группой здоровых добровольцев (контроль). Отобраны конкретные параметры (увеличение латентного периода цЗВП на реверсивный черно-белый и зелено-черный паттерны, снижение ОКТ-толщины слоя нервных волокон в нижнем квадранте сетчатки, гипометрия и нарушение инициации саккад при ВОГ-исследовании и др.), которые потенциально могут служить биомаркерами БП. Апробирована новая технология визуализации нигральной области среднего мозга у пациентов с БП – меланин-чувствительная МРТ, отражающая структурно-функциональную дезорганизацию дофаминергических нейронов компактной части черной субстанции. Согласно полученным предварительным данным, у пациентов с БП имеет место снижение интенсивности сигнала в области черной субстанции (в среднем на 25%), которое обычно выглядит симметричным вне зависимости от латерализации клинической симптоматики. Получены и охарактеризованы модели паркинсонизма на крысах с использованием системного введения параквата и интранигрального введения 6-OHDA. Показано характерное снижение двигательной активности и/или двигательной координации животных обеих экспериментальных групп, с латерализацией нарушений моторики в модели с односторонним введением 6-OHDA в черную субстанцию. На модели с паракватом показан иммунопатогистохимический субстрат развивающегося двигательного расстройства – дегенерация дофаминергических нейронов и волокон в черной субстанции и полосатом теле, в комбинации с астроцитарным глиозом. В системной паракватной модели паркинсонизма показано формирование альфа-синуклеиновой патологии на уровне вегетативных нейронов миентериального сплетения тонкого кишечника. В отчетном году была взята биопсия кожи у трех пациентов с БП – два случая с носительством мутаций в генах SNCA и LRRK2 и один случай спорадической формы БП без семейного анамнеза. Начаты работы по получению культур фибробластов с целью последующего их репрограммирования в направлении индуцированных плюрипотетных стволовых клеток и дальнейшей дифференцировки их в дофаминергические нейроны.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
1. Экспериментальный раздел in vivo. На паракватной модели БП у крыс детально исследованы наиболее ранние проявления патологии альфа-синуклеина (а-Syn) в нейронах кишечника экспериментальных животных. В опытной группе крыс, по сравнению с контролем, количество миентеральных нейронов снижалось, как и количество тирозингидроксилаза- (ТН)-позитивных нервных волокон (в среднем на 20%), но количество всех нервных волокон, окрашиваемых на β-III-тубулин, оставалось сохранным. Выявленные изменения, наиболее вероятно, связаны с внешней симпатической иннервацией тонкой кишки. а-Syn выявлялся у опытных и контрольных животных как в телах отдельных миентеральных, так и в аксонных терминалях, а также в отдельных нервных волокнах, оплетающих кровеносные сосуды. Интенсивность флюоресценции а-Syn оказалась наиболее высокой в варикозностях (расширениях аксонов, содержащих везикулы с нейромедиатором) по ходу нервных волокон и внутри ганглиев, где а-Syn-позитивные волокна оплетают и иннервируют ганглионарные нейроны. Фосфорилированный a-Syn также обнаруживался в опытной и контрольной группах, но у животных опытной группы интенсивность окрашивания была выше. Фосфорилированный а-Syn локализовался в телах отдельных нейронов в виде мелких гранул, а в отростках нейронов в виде пунктата. При этом у животных опытной группы плотность гранул была выше, а гранулы крупнее, что может указывать на процессы агрегации белка. В опытной группе значительно чаще фосфорилированный а-Syn локализовался в ТН-позитивных волокнах, которые выглядели расширенными, «набухшими» и лишёнными ярко светящихся варикозностей, напоминая нейриты Леви, описанные в энтеральной нервной системе у пациентов БП. Набухание ТН-позитивных отростков симпатических нейронов и накопление в них а-Syn является, по-видимому, начальной стадией дегенерации этих нейронов. Фосфорилированный а-Syn был выявлен также и в клетках не-нейрональной природы, которые располагались за пределами ганглиев – в подслизистой основе тонкой кишки и вдоль крупных сосудов. Популяция не-нейрональных клеток, содержащих фосфорилированный а-Syn, судя по их морфологии и локализации, включает тучные клетки и клетки макрофагальной и лейкоцитарной природы. Как свидетельствуют полученные результаты, на модели БП в патологическом процессе распространения a-Syn с периферии в ЦНС, помимо общеизвестного пути вдоль волокон блуждающего нерва, задействованы симпатические волокна (альтернативный путь распространения патологии). Показана также возможность распространения патологических форм а-Syn c клетками лимфоцитарного ряда (т.е. через кровь), что требует уточнения на 3-м году проекта с помощью использования дополнительных специфических иммуноцитохимических меток и других подходов. В отчетном году тестировались две модели БП с системным применением ротенона (подкожное и пероральное введение). При подкожном введении ротенона наблюдалась повышенная смертность экспериментальных животных (до 36% к исходу 24 суток после начала введения), имело место развитие ряда типичных проявлений паркинсонического синдрома, а также значительное увеличение (на 50%) латентного периода захода и выхода в рукава приподнятого Т-образного лабиринта, что свидетельствует об изменении эмоционального состояния по типу тревожного расстройства. На полиграфе BIOPAC МР150 при регистрации физиологических показателей (артериальное давление, частота сердечных сокращений и дыхания, степень оксигенации крови) получены данные, свидетельствующие об ухудшении общего состояния у крыс опытной группы по сравнению с контрольными животными. При морфохимическом исследовании в телах нигральных нейронов было выявлено накопление а-Syn (без формирования а-Syn-позитивных телец Леви). В модели БП с пероральным хроническим введением малых доз ротенона при сроках наблюдения в течение 30 дней не было выявлено статистически значимых различий между опытной и контрольной группами крыс, однако наметилась тенденция к снижению моторики экспериментальных животных. Плотность расположения ТН-позитивных волокон в контрольной и экспериментальной группах достоверно не различалась. На этом этапе кратковременного наблюдения фосфорилированный а-Syn выявлялся и у контрольных, и у экспериментальных животных в отдельных нервных волокнах, а также в телах некоторых миентеральных нейронов. У крыс, получавших ротенон, получены предварительные данные о начале воспалительного процесса в кишечнике, приводящего к нарушению кишечного эпителиального барьера и функции всасывания воды. 2. Экспериментальный раздел in vitro. Осуществлено репрограммирование фибробластов, полученных от пациентов с генетическими формами БП – носителей мутаций в генах a-Syn (SNCA) и LRRK2, а также от пациента со спорадической формой БП и от здорового донора. Были получены соответствующие линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК). На клеточной линии от здорового донора была осуществлена дифференцировка ИПСК в дофаминергические нейроны. При электронной микроскопии к 19-му дню in vitro в исследуемом материале обнаруживались клетки, большинство которых по своей тонкой структуре очень близки к зрелым нейронам: содержат комплекс Гольджи и формирующиеся тельца Ниссля и образуют друг с другом разнообразные контакты, в том числе симметричные, асимметричные и смешанные авезикулярные соединения, появление которых предшествует образованию зрелых химических синапсов. Важным ультраструктурным критерием развития и созревания синапсов является появление крупных гранулярных пузырьков, необходимых для построения активной зоны синапса и участвующих в дифференцировке пост- и пресинаптического отделов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ультраструктурные изменения ИПСК, дифференцируемых в дофаминергические нейроны, на ранних сроках культивирования воспроизводят динамику этих изменений, наблюдаемую в раннем эмбриогенезе мозга человека, напоминая по своему клеточному составу нервную трубку с митотически делящимися нейроэпителиальными клетками, радиальной глией и созревающими нейронами. 3. Клиническо-гистологический раздел: исследование a-Syn в биоптатах слюнной железы пациентов с БП. Исследование проводили на образцах подъязычной железы, полученных у 10 пациентов с БП. Иммуногистохимическое исследование показало, что антитела к PGP-9.5, β-III-тубулину и нейрофиламентам связывались с высокой специфичностью с нервными волокнами, иннервирующими протоки железы, волокнами в стенках сосудов и в соединительной ткани в составе слюнной железы. Экспрессию TH обнаруживали в нервных сплетениях стенок крупных сосудов и в волокнах по ходу нервно-сосудистых пучков, а также в отдельных нервных волокнах в составе соединительной железы. Нефосфорилированный а-Syn и фосфорилированный а-Syn в биопсийном материале пациентов с БП были колокализованы с маркерами нервных волокон, экспрессия a-Syn обнаруживалась в крупных и мелких нервных пучках в составе соединительной ткани железы. Иммунофлюоресцентный метод давал сходные результаты. По результатам анализа биопсий у всех обследованных в 2020 году пациентов с БП было подтверждено накопление фосфорилированного α-Syn в периферической нервной системе. 4. Патологоанатомический раздел: исследование a-Syn в секционном случае БП. В отчетном году проведен клинико-морфологический и гистологический анализ секционного случая БП (пациент 70 лет со смешанной формой заболевания, скончавшийся от инфаркта миокарда). Исследование показало наличие а-Syn-p129 в виде включений (расположенных в нервных волокнах) в хвостатом ядре, черной субстанции, лобной коре, а также в толстой кишке (миэнтеральный ганглий) и поднижнечелюстной слюнной железе. Таким образом, а-Syn-p129 был обнаружен как в образованиях головного мозга, так и в структурах периферической нервной системы. Данный случай расширяет представления о системном характере накопления патологических форм α-Syn при БП как в структурах головного мозга, так и за его пределами. 5. Клинический раздел: биомаркеры альфа-синуклеиновой патологии у пациентов с БП. Изучена дифференциально-диагностическая роль двух МРТ-феноменов, характерных для БП при исследовании на ультравысокопольных томографах (3 Тесла) – феномена потери дорсолатеральной нигральной гиперинтенсивности (исчезновение нигросомы-1) и феномена уменьшения интенсивности/площади МР-сигнала от черной субстанции (ЧС) в режиме нейромеланин-чувствительной МРТ (НМ-МРТ). По итогам проведенного анализа показана высокая диагностическая значимость визуализации нигросомы-1 при дифференцировании БП и эссенциального тремора: чувствительность и специфичность данного метода составили 79,5% и 100% соответственно; меньшую значимость имеет данный биомаркер для синдромов атипичного паркинсонизма. Результаты, полученные в режиме НМ-МРТ, показывают у пациентов с БП отклонение от нормы с односторонним или двусторонним снижением интенсивности сигнала или уменьшением объёма ЧС в 81,8% случаев. При проведении видеоокулографии (ВОГ) нарушение инициации саккад было выявлено у 61% пациентов, гипометрия саккад – также у 61%, нарушения фиксации взора – у 46%. Подтверждены полученные ранее у пациентов с БП данные об удлинении латентного периода цветовых зрительных вызванных потенциалов на черно-белый и зелено-черный паттерны и уменьшении толщины слоя нервных волокон сетчатки в нижнем квадранте сетчатки при оптической когерентной томографии. Таким образом, в отчетном году уточнена возможность объективизации накопления а-Syn в различных тканях-мишенях (как нейрональных, так и не-нейрональных) при развитии системного нейродегенеративного процесса у пациентов с БП.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В отчетном году была завершена поведенческая, моторная, морфологическая и иммуногистохимическая оценка системных нейротоксических моделей болезни Паркинсона (БП) у крыс, основанных на введении нейротоксинов – ротенона и параквата, с оценкой у экспериментальных животных системной патологии альфа-синуклеина (a-Syn). В экспериментах с системным введением параквата и ротенона в малых дозах тест «сужающаяся дорожка» показал, что процент оступаний левыми конечностями экспериментальных животных достоверно выше, чем контрольных. Таким образом, впервые в эксперименте удалось получить столь характерную для БП латерализацию двигательных нарушений. Оценка моторики желудка и тонкой кишки путём измерения дистанция прохождения красителя Evans Blue от привратника в каудальном направлении по тонкой кишке после перорального введения красителя показала достоверное снижение этого показателя у животных на модели с введением ротенона. Следовательно, воспроизведены характерные для БП симптомы снижения моторики желудка и кишечника. Иммуногистохимические и иммуноферментные исследования. Тонкий кишечник. В эксперименте с введением параквата у крыс снижались плотность расположения нейронов в миентеральных ганглиях и количество ТН-позитивных (тирозингидроксилазных) нервных волокон в межмышечном сплетении. Содержание фосфорилированного а-Syn увеличивалось в телах миентеральных нейронов и ТН-позитивных волокнах, а плотность расположения GFAP-позитивной глии в миентеральных ганглиях – снижалась. Плотность расположения β-III-тубулин-позитивных и ТН-позитивных нервных волокон была достоверно меньше у крыс через 7 мес введения ротенона по сравнению с контролем. На паракватной модели также выявлено достоверное снижение интенсивности иммунофлуоресцентного окрашивания на ТН и β-III-тубулин. В модели БП с ротеноном выявлено увеличение экспрессии общего а-Syn в нервных элементах стенки тонкой кишки. Двойное мечение на фосфорилированный а-Syn и общий лейкоцитарный маркер CD45 выявило их частичную колокализацию в лейкоцитарных клетках стенки кишечника. Поднижнечелюстная слюнная железа. Нервные волокна, иммунопозитивные к общему а-Syn, обнаруживались в составе пучков нервных волокон в строме слюнной железы крыс. Фосфорилированный а-Syn также выявлен в контроле и в эксперименте, однако у животных с моделями БП интенсивность окрашивания была выше. Кожа. На тотальных препаратах кожи экспериментальных животных выявлены ТН-позитивные нервные волокна, часть из которых была иммунопозитивна к фосфорилированному а-Syn. Сердце. Общий а-Syn выявлялся в значительном количестве нервных волокон, иннервирующих стенку сердца экспериментальных и контрольных крыс. Фосфорилированный а-Syn выявлялся в ТН-позитивных волокнах, являющихся симпатическими эфферентами. Вместе с тем, фосфорилированный а-Syn колокализовался с ТН лишь частично, что свидетельствует о том, что в его накоплении и распространении могут быть задействованы другие волокна, в том числе собственных нейронов интрамуральных парасимпатических ганглиев. Дофаминэргические (ДА) структуры ЦНС. На паракватной модели БП наиболее выраженные изменения наблюдались в стриатуме, где интенсивность флуоресценции ТН-позитивных волокон достоверно снижалась (преимущественно в дорсальных отделах). Плотность расположения ДА-эргических нейронов в чёрной субстанции на этой модели снижалась незначительно. На модели с введением ротенона, напротив, более выраженные изменения наблюдались в чёрной субстанции. Таким образом, обе модели воспроизводят повреждение структур нигростриатной системы, однако используемые токсины демонстрируют определенную специфику воздействия на исследуемые структуры. Оценка общего a-Syn в плазме крови. При исследовании методом ELISA общего a-Syn в плазме крови крыс с паракватной и ротеноновой моделями БП было установлено, что данный белок определяется в концентрациях, значительно превышающих его уровень в норме. Этот факт (как и выявленное нами окрашивание на a-Syn клеток лейкоцитарного ряда в стенке кишечника) подтверждает возможность гематогенного распространения a-Syn при системном воздействии на организм паркинсонических нейротоксинов. Проведена оценка эффектов фармабиотика на основе бактериального штамма L. fermentum U-21 на мышах с МФТП-индуцированным паркинсонизмом. Результаты моторных тестов показали, что исследуемый фармабиотик эффективно предохраняет двигательные функции животных на фоне применения нейротоксина МФТП. Патоморфологическое исследование установило, что у животных, получавших фармабиотик, был более сохранным целый ряд структур после воздействия нейротоксина (ДА-структуры стриатума, ТН-позитивные волокна стенки кишечника). Эти позволяет говорить о высокой биологической активности исследованного фармабиотика, что реализуется, наиболее вероятно, через нормализацию микробиоты и позитивное влияние на динамику кишечных a-Syn-опосредованных реакций. Проведен сравнительный анализ свойств ДА-нейронов и нейрональных предшественников, дифференцированных на предыдущих годах работы из линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от пациентов с генетическими формами БП (мутации в генах a-Syn и LRRK2) и от здорового донора. Во всех изученных клеточных линиях выявлялись ТН-позитивные нейроны. При этом в культуре a-Syn чаще выявлялись признаки нарушения нейрогенеза: ТН-позитивные нейроны имели более короткие, ветвящиеся, изломанные отростки, которые по всей длине содержали многочисленные чётковидные расширения – варикозности. Фосфорилированный a-Syn выявлялся во всех линиях, локализуюсь в виде диффузного окрашивания в ядре и в виде мелких гранул, пунктата в перикарионе и в отростках. Средний уровень интенсивности флуоресценции фосфорилированной изоформы a-Syn в клетках культуры с мутацией a-Syn был достоверно выше, чем в культуре LRRK2 и в контроле. При электронной микроскопии культура, экспрессирующая мутацию a-Syn, резко отличалась обилием изменений, свидетельствующих, в первую очередь, о патологии митохондрий. Цитоплазма клеток была сильно вакуолизирована, вакуоли представляли собой аутофаголизосомы с содержимым различной электронной плотности как в околоядерной части цитоплазмы, так и в отростках клеток. В культуре a-Syn количественно преобладали клетки с крупным ядром и большим объёмом светлой цитоплазмы, в которой было мало органелл белок-синтезирующего аппарата, преобладали хаотично расположенные элементы цитоскелета. Визуализируемые митохондрии были преимущественно мелкими, тёмными. Встречались отдельные гигантские митохондрии с тёмным матриксом, изменёнными кристами по периферии и вакуолями. Остатки митохондрий определялись в содержимом аутофаголизосом (картина, характерная для нарушений митофагии). В отростках встречались расширенные участки с прерыванием параллельного хода микротрубочек. Анализ экспрессии генов факторов роста (BDNF, NGF, NT-3, GDNF, Trk A,TrkB, TrkC) показал, что уровни мРНК GDNF, NGF, TrkA, C и TrkB.tk+ увеличились для линии, экспрессирующей мутацию a-Syn, по сравнению с клетками от здорового донора и пациента с мутацией LRRK2. Иммуноферментный анализ показал достоверно более низкий уровень BDNF в ДА-нейронах, полученных от пациентов с БП, по сравнению с клетками от здорового донора; особенно низкий уровень BDNF выявлен в клетках с мутацией a-Syn. Для регистрации электрофизиологической активности использовались мультиэлектродные матрицы (МЕА) и система для регистрации МЕА-2100 (Multichannel system, Germanу). Показано, что нейрональные культуры от здорового донора и от пациентов с БП имели в среднем одинаковую частоту потенциалов действия за 5 мин регистрации активности. При этом культура ДА-нейронов, экспрессирующая мутацию a-Syn, характеризовалась более низкой адаптацией и худшим восстановлением исходных потенциалов действия после воздействия L-дофа и последующей отмывки. Продолжено исследование на a-Syn биопсийных образцов подъязычной слюнной железы. Нефосфорилированный и фосфорилированный a-Syn в биопсийном материале пациентов с БП были колокализованы с маркерами нервных волокон, экспрессия a-Syn обнаруживалась в крупных и мелких нервных пучках в составе соединительной ткани железы. Выраженность позитивной оценивали качественно, по разработанной нами трехбалльной шкале (где 0 — отсутствие включений, 3 – максимальная выраженность реакции). Был разработан ряд технических модификаций методики. По итогам работы на всем протяжении проекта (56 пациентов с БП и лиц группы контроля), уточненная общая чувствительность методики составила 86,9%, специфичность – 77,8%, что значительно превышает аналогичные показатели для большинства других биомаркеров БП. Ни в одном случае биопсии слюнной железы осложнений процедуры не было. Таким образом, разработанная нами технология значительно расширяет возможности диагностики БП на основании выявления системного накопления фосфорилированного a-Syn. Завершен набор больных и проведен окончательный анализ диагностической значимости методики МРТ-визуализации нигросомы-1 у пациентов с БП – в сопоставлении с наиболее трудной для дифференцирования категории больных, имеющих диагноз «Эссенциальный тремор» (ЭТ). При сравнении двух групп выявлена значительная разница в процентном соотношении результатов (по критерию хи-квадрата Пирсона, p <0,001) и тем самым доказана высокая диагностическая значимость данного маркера при дифференцировании БП и ЭТ: чувствительность и специфичность метода составили 70% и 100%, соответственно. Видеоокулография (ВОГ) проведена 38 новым пациентам с БП. Скорости саккад в большинстве случаев находились в пределах нормальных значений. Нарушение инициации саккад было выявлено у 21 пациента (55%), гипометрия саккад – у 19 пациентов (50%). Нарушение плавного слежения было выявлено у большинства (29 пациентов, 76%). Нистагм был зарегистрирован у 5 пациентов из данной группы (13%), а избыток квадратных осцилляций глаз был отмечен у 11 пациентов (29%). Также у 3 пациентов из 31 (10%) было зарегистрировано нарушение подавления вестибуло-окулярного рефлекса, признаки вестибулопатии по данным видео Хальмаги-теста в данной группе пациентов были выявлены лишь у одного пациента из 26 (4%). Выявлена значимая обратная корреляция между возрастом дебюта заболевания и точностью плавного слежения. Завершен набор пациентов с БП и обобщены результаты оценки патологии сетчатки (отражающей накопление a-Syn) методом оптической когерентной томографии (ОКТ). Группы пациентов с БП и здоровых лиц сопоставимомго возраста статистически значимо различались по толщине слоя нервных волокон (СНВС) в нижнем квадранте – в группе БП она была статистически значимо меньше. При исследовании корреляционных связей возраста с параметрами ОКТ в контрольной группе выявлена статистически значимая обратная связь между возрастом и толщиной СНВС в нижнем квадранте, в среднем и височном секторах нижнего квадранта, в среднем и височном секторах верхнего квадранта. В группе БП также выявлена обратная связь между возрастом и толщиной СНВС в нижнем квадранте (r=-0,327, p<0,05). Результаты работы показали, что БП характеризуется атрофическими изменениями сетчатки в виде истончения СНВС в нижнем квадранте, и эти данные подтверждает системность нейродегенеративной патологии при данном заболевании, выходящей за пределы черной субстанции и вещества головного мозга. Таким образом, завершающий год работы по гранту позволил на экспериментальном и клиническом материале подтвердить системный характер распределения a-Syn в организме при БП и в моделях данного заболевания, уточнить возможные пути его распространения по различным органам и тканям, уточнить биомаркерную роль ряда выявляемых у пациентов с БП нейровизуализационных и нейофизиологических признаков (отражающих a-Syn-ассоциированную нейродегенерацию), а также показать на клеточной модели ряд характерных особенностей поражения ДА-нейронов, экспрессирующих мутацию в гене a-Syn – нарушения нейрогенеза, патологию миохондрий и митофагии, дисбаланс пептидных нейротрофических факторов и др.